CN113341007B - 一种基于hplc特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法 - Google Patents

一种基于hplc特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于HPLC特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法。所述方法包括建立HPLC特征图谱、制备供试品溶液、HPLC进样测定、记录样品中待测成分的峰面积、计算其含量。本发明采用了优化后的枣仁安神胶囊HPLC‑UV方法，实现了枣仁安神胶囊的全药味特征图谱检测，并同时测定了全药味中10个成分的含量，实现了枣仁安神胶囊的全药味多成分含量测定。

Description

一种基于HPLC特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测 定方法
技术领域
本发明属于检验分析技术领域，具体涉及一种基于HPLC特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法。
技术背景
枣仁安神成方制剂(简称枣仁安神制剂)是由炒酸枣仁、丹参、醋五味子制得的中药复方制品，具有养血安神的功效，临床用于治疗心血不足引起的失眠、健忘、心烦、头晕及神经衰弱症见上述证候者。枣仁安神制剂主要包括胶囊、颗粒和口服液3种剂型。胶囊剂为药材经75％乙醇、60％乙醇、水依次回流提取，浓缩后加淀粉制成颗粒装入胶囊所得；颗粒剂为药材经水煎煮，浓缩后加糊精制成颗粒；口服液为药材经水提取，浓缩后加辅料和水煮沸，过滤而得。
目前国外主流国家和地区的药典，包括《欧洲药典》、《美国药典》、《日本药典》、《英国药典》等，均未收载枣仁安神制剂。我国药典和部分中药成方制剂标准中收载有枣仁安神胶囊、颗粒及口服液的质量标准，如《中国药典》一部2020年版和《新药转正标准》第72册中收载了枣仁安神胶囊质量标准，《中国药典》一部2020年版和《卫生部药品标准中药成方制剂》第11册中收载有枣仁安神颗粒(冲剂)质量标准，《卫生部药品标准中药成方制剂》第18册中收载有枣仁安神液质量标准。
枣仁安神制剂在我国不同标准中的收载项目及规定有所不同，以《中国药典》2020年版收载各项指标最为全面，涵盖了性状、薄层色谱(TLC)鉴别、HPLC特征图谱和HPLC含量测定的检测内容。相同制剂的相同检测项在不同标准中的规定有所不同。如枣仁安神胶囊TLC鉴别项下，《中国药典》2020年版以酸枣仁提取物或酸枣仁皂苷A，B为对照，《新药转正标准》则以酸枣仁皂苷A、原儿茶醛及五味子甲素为对照。各标准中以《中国药典》2020年版最为完善，虽然通过综合采用TLC鉴别、HPLC特征图谱以及含量测定基本实现了对枣仁安神胶囊的全药味主成分控制，但是该质量标准仍有待完善，尤其特征图谱中共有峰和色谱峰的指认较少，有待进一步提高。
高效液相色谱(HPLC)可以快速地对中药材及其制剂中的化学成分进行定性、定量分析，在中药化学分析与质量控制中应用广泛，是《中国药典》中枣仁安神胶囊和颗粒质量控制的重要方法。目前HPLC主要用于枣仁安神制剂的特征图谱、指纹图谱分析及主要成分的含量测定，但是仅有枣仁安神胶囊和颗粒制剂的HPLC指纹图谱或特征图谱的研究报道；枣仁安神胶囊、颗粒和口服液制剂的HPLC含量测定均有研究报道，含量测定成分主要集中在酸枣仁中的斯皮诺素、酸枣仁皂苷A，丹参中的丹参酮ⅡA、丹酚酸B，五味子中的五味子醇甲、五味子醇乙，其他成分如酸枣仁中的酸枣仁皂苷B、酸枣仁皂苷A1、白桦酯酸、木兰花碱，丹参中的丹参素，五味子中的五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛H、戈米辛F等也有报道。尽管目前对枣仁安神制剂中的1-7个成分的含量测定均有报道，个别研究涵盖全部3味药材的主要成分，但多数文献还是仅测定其中某个单一成分含量。
发明内容
针对《中国药典》2020年版及文献中对于枣仁安神胶囊的特征图谱检测，所指认的色谱峰较少，且《中国药典》2020年版没有达到全药味特征图谱分析的情况，以及《中国药典》2020年版枣仁安神胶囊的含量测定项中，仅测定了斯皮诺素、丹参酮IIA和五味子醇甲三种成分的含量，且斯皮诺素与另两者分别测定，测定成分较少，且分析时间较长的问题，本发明的目的是提供一种基于高效液相色谱(HPLC)的枣仁安神胶囊的特征图谱检测方法，以及基于所得特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法。所述特征图谱中指认了涵盖全药味成分的14个色谱峰，实现了枣仁安神胶囊的全药味特征图谱检测，并同时测定了全药味中10个成分的含量，实现了枣仁安神胶囊的全药味多成分含量测定。
为实现上述目的，本发明提供了一种枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱，所述特征图谱的建立方法包括如下步骤：取枣仁安神胶囊内容物，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；采用C18色谱柱，以乙腈A-水B体系为流动相，进行梯度洗脱，并检测，经对照品比对，共指认了14个化学成分，所述化学成分具体为：丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、迷迭香酸、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素。
优选地，所述建立方法中，提取溶剂选自甲醇水溶液，胶囊内容物与提取溶剂的比0.1-0.3:5-10；超声处理时间为5-30min；C18色谱柱选自Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm)，Agilent Extend-C18(4.6×250mm,5μm)，Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)，CAPCELL PAK C18 MG(4.6×250mm,5μm)和ACCHROM Unitary C18(4.6×250mm,5μm)；所述乙腈A-水B体系的流动相中进一步加酸，所述酸选自磷酸、冰醋酸或者甲酸，所述酸在流动相A和流动相B中的含量为0.025％；梯度洗脱时间为60min-70min，流动相洗脱梯度为：
优选地，提取溶剂为70％的甲醇水溶液，胶囊内容物与提取溶剂的比0.1:5；超声处理时间为5min；流动相以含0.025％甲酸的乙腈为流动相A，含0.025％甲酸的水为流动相B。
优选地，紫外检测波长为270nm，柱温为25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为10μL。
优选地，特征峰的指认方法为采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对其进行色谱峰匹配，得到匹配数据，并根据各色谱图中色谱峰的保留时间确定其特征峰。
本发明还提供了一种基于HPLC特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法，所述测定方法对枣仁安神胶囊中十个主要活性成分进行定量检测，所述十个主要活性成分具体为：斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素；所述测定方法包括以下步骤：
(1)精密称取斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素适量，加甲醇溶解，分别制成对照品储备液；分别吸取各对照品储备液，加甲醇稀释至不同浓度的对照品溶液；HPLC进样测定，记录各对照品不同浓度下的色谱峰面积，以质量浓度xμg/mL为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，确定各对照品的回归方程、相关系数及线性范围；
(2)制备供试品溶液；
(3)HPLC进样测定，记录样品中待测成分的峰面积，计算其含量。
优选地，步骤(1)中各对照品的回归方程、相关系数及线性范围如下：
优选地，步骤(2)制备供试品溶液的方法是取待测枣仁安神胶囊内容物，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
优选地，步骤(2)制备供试品溶液的方法是取待测枣仁安神胶囊内容物0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇5mL，密塞，称定重量，超声处理5分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
优选地，步骤(1)和(3)中的HPLC色谱条件为采用C18色谱柱，以含0.025％甲酸的乙腈为流动相A，含0.025％甲酸的水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为270nm，柱温为25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为10μL。
优选地，步骤(1)和(3)中的洗脱梯度为
本发明的有益效果：
本发明建立了枣仁安神胶囊的特征图谱，所述特征图谱中指认了涵盖全药味成分的14个色谱峰，分别为丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、迷迭香酸、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA、五味子乙素，实现了枣仁安神胶囊的全药味特征图谱检测，并采用了优化后的枣仁安神胶囊HPLC-UV方法，同时测定了全药味中10个成分的含量，实现了枣仁安神胶囊的全药味多成分含量测定。
附图说明
图1：《中国药典》与文献报道方法的枣仁安神胶囊色谱图。
图2：不同色谱柱的色谱图。
图3：不同流动相的色谱图。
图4：有机相是否加酸的色谱图。
图5：不同洗脱梯度的色谱图。
图6：不同检测波长的色谱图。
图7：不同检测方式的色谱图(1：斯皮诺素，2：酸枣仁皂苷A，3：酸枣仁皂苷B)。
图8：不同柱温的色谱图。
图9：不同流速的色谱图。
图10：不同供试品提取溶剂的色谱图。
图11：不同物料比的色谱图。
图12：不同提取时间的色谱图。
图13：枣仁安神胶囊的HPLC色谱图(1：斯皮诺素，2：6″′-阿魏酰斯皮诺素，3：丹酚酸B，4：五味子醇甲，5：五味子醇乙，6：隐丹参酮，7：丹参酮I，8：五味子甲素，9：丹参酮IIA，10：五味子乙素)。
图14：枣仁安神胶囊的HPLC对照特征图谱。
图15：枣仁安神胶囊色谱峰的药材归属。
图16：15批枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱叠加图。
具体实施方式
下面通过具体实例对本申请做进一步详细说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1：枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱分析
1、仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪：Waters Alliance(e2695 separations module,e2998photodiode array detector,Empower 3 workstation)，ACCHROM(S6000,Empower 3workstation)，Agilent(1260Infinity,Agilent ChemStation workstation)；高效液相色谱柱：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)，Agilent Extend-C18(4.6×250mm,5μm)，Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)，CAPCELL PAK C18 MG(4.6×250mm,5μm)，ACCHROM Unitary C18(4.6×250mm,5μm)；SQP十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，OHAUS万分之一电子天平(美国OHAUS公司)，KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，高速万能粉碎机(FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司)，旋转蒸发仪(N-1100型，东京理化)，冷却水循环装置(CA-111型，东京理化)，水浴锅(SB-2000，东京理化)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
1.2材料和试剂
一次性使用无菌注射器(2mL，上海治宇医疗器械有限公司)，微孔滤膜(0.22μm，津腾尼龙66型)。甲醇(Fisher Scientific,Fisher Chemicals,New Jersey USA)，乙腈(Fisher Scientific,Fisher Chemicals,New Jersey USA)，甲酸、磷酸等均为分析纯试剂，由北京市通广精细化工公司生产，水为Water Purification System(RODI-220A1，锐思捷水纯化技术有限公司)制备所得。
1.3药材与样品
枣仁安神胶囊样品及制备对照药材样品和阴性对照品所用原料药材信息见表1。用于方法学考察的枣仁安神胶囊样品批号为190702。
表1.枣仁安神胶囊及相关样品信息
1.4对照品
丹酚酸B(批号：111562-201917)，五味子醇甲(批号：110857-201815)，隐丹参酮(批号：0852-9902)，丹参酮I(批号：0867-200003)，五味子甲素(批号：110764-200408)，丹参酮IIA(批号：0766-200010)，五味子乙素(批号：110765-200508)均购买于中国食品药品检定研究院；斯皮诺素(批号：DSTDS006001)，6″′-阿魏酰斯皮诺素(批号：DST190914-013)，五味子醇乙(批号：DST180713-013)购买于成都德思特生物技术有限公司。特征图谱用对照品结构如下：
2、枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱分析
2.1HPLC条件优化
2.1.1色谱条件的初步分析
首先采用《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱和文献中枣仁安神颗粒指纹图谱的色谱条件进行了初步分析。
方法一，即《中国药典》2020年版枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱色谱条件：C18色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％冰醋酸溶液为流动相B，洗脱梯度见表2。
方法二，即文献所报道枣仁安神颗粒指纹图谱色谱条件：C18色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.03％磷酸溶液为流动相B，洗脱梯度见表3。
表2《中国药典》中枣仁安神胶囊特征图谱的流动相洗脱梯度
表3文献报道的枣仁安神颗粒指纹图谱的流动相洗脱梯度
结果表明，采用《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱方法对枣仁安神胶囊样品进行色谱分析，有较多成分被溶剂峰覆盖，色谱峰较少。相对于《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱方法，文献所述方法对于样品中的成分分离度更好，色谱图中色谱峰更丰富，峰型更佳(图1)。所以，本实验在文献报道方法的基础上，进一步进行了色谱条件的优化。
2.1.2色谱柱的考察
实验比较了五种色谱柱Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)，AgilentExtend-C18(4.6×250mm,5μm)，Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)，CAPCELL PAKC18 MG(4.6×250mm,5μm)，ACCHROM Unitary C18(4.6×250mm,5μm)的分离效果。
图2结果显示，不同色谱柱所得谱图的色谱峰，除5-9min以及40-42min处的峰数目稍有区别，其他峰数目基本一致，但保留时间有所差别。因此，该色谱条件对色谱柱的选择性低，适用性较好。本实验中如未特殊标明，均使用Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱。
2.1.3流动相的考察
实验考察了乙腈-磷酸水、乙腈-冰醋酸水以及乙腈-甲酸水三种流动相系统，选择了乙腈-甲酸水为流动相，并考察了水中酸浓度对色谱图的影响。为使得谱图基线更为平稳，选择了有机相及水相都加酸的流动相系统，结果如图3。
实验结果显示，流动相乙腈-0.03％磷酸水、乙腈-0.03％冰醋酸水和乙腈-0.03％甲酸水的色谱图差异不大，但乙腈-冰醋酸水在8min处的色谱峰分离度不如另两者；乙腈-磷酸水和乙腈-甲酸水两者图谱在峰数目、峰型上基本一致，考虑到实验还需考察HPLC-ELSD法检测酸枣仁皂苷成分的可行性，这里选择了乙腈-甲酸水为流动相；对于水相中酸浓度的考察，实验对比了乙腈-0.03％甲酸水、乙腈-0.05％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水的色谱图，发现三者的主要区别在于40-42min处的色谱峰峰高及基线上，选择了峰高较高、基线较平稳的0.05％水相甲酸浓度。
实验还考察了有机相中是否加酸对色谱图的影响(图4)。如果只有水相加甲酸，色谱图基线会有漂移，在低波长下更为明显；这是由于甲酸也会有紫外吸收，在进行梯度洗脱时，初始流动相比例与末尾相差较大，故基线不稳定，因此本实验选取了0.025％甲酸乙腈-0.025％甲酸水的流动相系统。
实验还对文献所报道的流动相洗脱梯度(表3)进行了优化(图5)，确定的流动相为0.025％甲酸乙腈(A)-0.025％甲酸水(B)，洗脱梯度见表4。该洗脱梯度将洗脱时间由70min缩减到60min，色谱峰数目及峰型均与原来一致，节省了实验时间，提高了检测效率。
表4优化后的流动相洗脱梯度
2.1.4检测方式及紫外波长的考察
实验考察了210nm、250nm、270nm、320nm波长处的色谱图(图6)，发现枣仁安神胶囊样品在270nm检测波长时，色谱峰数目最多，大部分色谱峰的峰面积较大，且基线平稳，因此选择270nm作为检测波长。
由于酸枣仁皂苷类成分的紫外吸收较弱，实验还采用HPLC-ELSD法对枣仁安神胶囊样品进行检测，结果如图7。
结果显示，ELSD为检测器时，枣仁安神胶囊样品色谱图中酸枣仁皂苷A、B的出峰处并没有明显的色谱峰，没有达到指认酸枣仁皂苷成分的目的；而相对于枣仁安神胶囊样品的HPLC-ELSD图谱，HPLC-UV(270nm)色谱图中的色谱峰数目更多，基线更加平稳。所以选择紫外检测方式，检测波长为270nm。
2.1.5柱温的考察
实验考察了20℃、25℃、30℃、35℃和40℃五个柱温对于样品成分分离度的影响，结果如图8。
结果显示，柱温对于7-9min处的两个色谱峰以及45-47min处的两个色谱峰的分离度影响较大，柱温为20℃和25℃时，两处的色谱峰分离度均较好；柱温高于30℃时，两处的色谱峰分别重叠在一起，影响了色谱峰的指认。本实验选择了更接近于室温的25℃为柱温。
2.1.6流速的考察
实验考察了不同流速(0.9mL/min、1.0mL/min和1.1mL/min)对于色谱图的影响(图9)，发现流速会影响色谱峰的保留时间，但峰的数目及峰型基本一致。本实验选择了HPLC法常用的1.0mL/min。
2.1.7供试品提取溶剂的考察
《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊特征图谱与含量测定中的供试品制备方法一致，为：取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟(必要时需摇散药粉)，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。其选择了70％甲醇为提取溶剂。
本实验考察了以甲醇、70％甲醇和50％甲醇为提取溶剂，其他供试品制备步骤与《中国药典》一致。比较各色谱图中色谱峰，发现70％甲醇的图谱中各色谱峰的峰高均高于其他两者，所以选择70％甲醇为供试品制备时的提取溶剂(图10)
2.1.8物料比的考察
《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊特征图谱供试品制备方法采取了胶囊内容物(g)：70％甲醇(mL)为1:50的物料比，所用试剂及样品量较多。本实验分别考察了胶囊内容物(g)：70％甲醇(mL)为1:50、0.1:5、0.1:10、0.2:10和0.3:10的物料比，发现1:50、0.1:5以及0.2:10的色谱结果基本一致，而0.1:10的图谱中色谱峰过低，0.3:10的图谱中色谱峰过高，故选择试剂用量较少的0.1:5的物料比(图11)。
2.1.9供试品提取时间的考察
《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊特征图谱供试品制备方法采取了超声提取30min的方式。本实验考察了30min、20min、10min和5min的超声时间，发现这四种超声时间对于样品的提取效率影响不大，各色谱图中对应色谱峰的峰高均相近，故选择了比较短的5min的超声提取时间，提高了实验效率(图12)。
2.1.10枣仁安神胶囊HPLC特征图谱色谱条件及供试品制备方法的确认
通过对枣仁安神胶囊HPLC特征图谱色谱条件及供试品制备方法的优化，确定了以下方法：取枣仁安神胶囊内容物约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇5mL，密塞，称定重量，超声处理5分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。采用C18色谱柱，以0.025％甲酸乙腈为流动相A，0.025％甲酸水为流动相B，按表4进行梯度洗脱；检测波长为270nm，柱温为25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为10μL。
2.1方法学考察
2.2.1精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，并计算10个主要特征色谱峰峰面积的RSD值，结果见表5。结果表明，各色谱峰峰面积的RSD值介于0.74％-2.75％之间，根据《中国药典》2020年版四部分析方法验证指导原则中样品待测定成分的含量与精密度可接受范围关系的相关要求(表6)，该方法的精密度良好。
表5精密度试验结果
表6样品中待测定成分的含量与精密度可接受范围
2.2.2重复性试验
精密吸取同一批次的供试品溶液6份，分别进样，根据10个主要特征色谱峰的峰面积计算其含量(mg/g)及含量的RSD值，结果见表7，各成分含量的RSD值介于1.89％-4.69％之间，基本满足相关要求，表明该方法的重复性良好。
表7重复性试验结果
2.2.3稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h进样分析，记录色谱峰的峰面积，并计算10个主要特征色谱峰峰面积的RSD值，结果见表8，各色谱峰峰面积的RSD值介于0.67％-3.34％之间，表明该方法的样品溶液24h内稳定性良好。
表8稳定性试验结果
经过对该方法精密度、重复性和稳定性的考察，该方法精密度高，重复性好，样品24h内稳定性良好，可用于枣仁安神胶囊样品的定性、定量测定。
2.2HPLC特征图谱结果与分析
2.3.1枣仁安神胶囊的特征图谱分析
将15批枣仁安神胶囊按确定的方法制备供试品溶液，进样分析。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012.130723版本)对其进行色谱峰匹配，得到匹配数据，并根据各色谱图中色谱峰的保留时间确定其特征峰，结果如图14。
表9枣仁安神胶囊HPLC特征图谱特征峰及其药材归属
在枣仁安神胶囊样品的HPLC特征图谱中，有23个比较典型的特征峰，并确定了其药材归属，其中5个色谱峰来源于酸枣仁，13个色谱峰来源于丹参，8个色谱峰来源于五味子，4号峰可能是酸枣仁、丹参和五味子共有的成分，5号峰可能是酸枣仁和丹参共有的成分。经对照品比对，共指认了14个化学成分，包括酸枣仁黄酮，丹参酚酸，丹参酮和五味子木脂素等多种主要成分，实现了枣仁安神胶囊的全药味特征图谱检测。以君药酸枣仁主成分斯皮诺素的色谱峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积如表9所示。
2.3.2枣仁安神胶囊的相似度分析
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012.130723版本)对得到的枣仁安神胶囊色谱图进行色谱峰匹配，生成对照图谱，计算相似度，结果如图16。
表10枣仁安神胶囊与对照图谱的相似度
结果显示，15批枣仁安神胶囊的HPLC特征图谱与相似度评价系统生成的对照图谱的相似度在0.858-0.996之间，多数枣仁安神胶囊的相似度大于0.9，说明该15批枣仁安神胶囊之间的化学成分差异小。
实施例2：枣仁安神胶囊的全药味多成分含量测定分析
1、仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪：Waters Alliance(e2695 separations module,e2998photodiode array detector,Empower 3 workstation)；高效液相色谱柱：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm,5μm)；SQP十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，OHAUS万分之一电子天平(美国OHAUS公司)，高速万能粉碎机(FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司)，旋转蒸发仪(N-1100型，东京理化)，冷却水循环装置(CA-111型，东京理化)，水浴锅(SB-2000，东京理化)，KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
1.2材料和试剂
一次性使用无菌注射器(2mL，上海治宇医疗器械有限公司)，微孔滤膜(0.22μm，津腾尼龙66型)。甲醇(Fisher Scientific,Fisher Chemicals,New Jersey USA)，乙腈(Fisher Scientific,Fisher Chemicals,New Jersey USA)，甲酸为分析纯试剂，由北京市通广精细化工公司生产，水为Water Purification System(RODI-220A1，锐思捷水纯化技术有限公司)制备所得。
1.3样品
枣仁安神胶囊、胶囊中间体等样品及制备对照药材样品所用原料药材信息同实施例1。用于方法学考察的枣仁安神胶囊样品批号为190702。
1.4对照品
丹酚酸B(批号：111562-201917)，五味子醇甲(批号：110857-201815)，隐丹参酮(批号：0852-9902)，丹参酮I(批号：0867-200003)，五味子甲素(批号：110764-200408)，丹参酮IIA(批号：0766-200010)，五味子乙素(批号：110765-200508)均购买于中国食品药品检定研究院；斯皮诺素(批号：DSTDS006001)，6″′-阿魏酰斯皮诺素(批号：DST190914-013)，五味子醇乙(批号：DST180713-013)购买于成都德思特生物技术有限公司(同实施例1)。
2、枣仁安神胶囊的HPLC多成分含量测定
2.1测定成分的选择
《中国药典》2020年版枣仁安神胶囊的含量测定项中，测定了斯皮诺素、丹参酮IIA和五味子醇甲三种成分的含量；枣仁安神颗粒测定了斯皮诺素、丹酚酸B和五味子醇甲三种成分的含量；酸枣仁的含量测定项，用不同检测方法分别测定了酸枣仁皂苷A和斯皮诺素两种成分的含量；丹参测定了丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I三者的总量；五味子的含量测定项，仅测定了五味子醇甲的含量。为了提高枣仁安神胶囊质量控制标准，达到全药味多成分含量测定的目的，本实验选择了《中国药典》2020年版中各单药味及制剂含量测定所涉及的斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I等多种主要成分为测定目标，还依据特征图谱中各主要成分的出峰情况，增加了6″′-阿魏酰斯皮诺素、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素等测定成分。由于酸枣仁皂苷类成分紫外吸收弱，在枣仁安神胶囊样品中含量较低，ELSD检测方式也难于测定，故没有对枣仁安神胶囊中酸枣仁皂苷类成分进行含量测定。
2.2色谱条件及供试品制备方法的确定
经过对实验所建立的枣仁安神胶囊特征图谱检测方法的分析，其谱图中指认了包括酸枣仁黄酮、丹参酮、丹酚酸和五味子木脂素等各药味多种成分类型，且主要成分色谱峰分离度良好，保留时间分布均匀，故选择枣仁安神胶囊HPLC特征图谱检测方法作为含量测定的方法，供试品制备方法及色谱条件如下：
取枣仁安神胶囊内容物约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇5mL，密塞，称定重量，超声处理5分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。采用C18色谱柱，以0.025％甲酸乙腈为流动相A，0.025％甲酸水为流动相B，按表4进行梯度洗脱；检测波长为270nm，柱温为25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为10μL。
2.3方法学考察
2.3.1标准曲线的制定
精密称取斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为0.427、0.373、1.54、0.384、0.179、0.056、0.132、0.100、0.106、0.126mg/mL的对照品储备液。分别吸取各对照品储备液，加甲醇稀释至不同浓度的对照品溶液。按所确定的色谱条件，进样10μL，记录各对照品不同浓度下的色谱峰面积，以质量浓度x(μg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程、相关系数及线性范围如下。
表11各成分的回归方程、相关系数及线性范围
2.3.2精密度、重复性、稳定性试验
结果同实施例1方法学考察中的精密度、重复性、稳定性试验。
2.3.3加样回收率试验
根据《中国药典》2020年版四部分析方法验证指导原则准确度项目中加样回收率测定的相关要求，称取枣仁安神胶囊内容物0.1g，精密称定，共6份，分别加入各对照品的混合液，加入量见表12，按所确定的供试品制备方法制备供试品溶液，进样10μL，计算各成分的回收率及RSD值。斯皮诺素的平均回收率为97.4％，RSD值为0.88％；6″′-阿魏酰斯皮诺素的平均回收率为99.6％，RSD值为3.94％；丹酚酸B的平均回收率为98.4％，RSD值为3.53％；五味子醇甲的平均回收率为98.4％，RSD值为1.90％；五味子醇乙的平均回收率为101.1％，RSD值为2.34％；隐丹参酮的平均回收率为99.5％，RSD值为2.84％；丹参酮I的平均回收率为101.8％，RSD值为2.32％；五味子甲素的平均回收率为99.5％，RSD值为4.39％；丹参酮IIA的平均回收率为99.8％，RSD值为3.29％；五味子乙素的平均回收率为100.7％，RSD值为3.18％。结果表明该方法的回收率良好。
表12各成分的加样回收率结果
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2.4枣仁安神胶囊的HPLC多成分含量测定
将15批枣仁安神胶囊按确定的方法制备成供试品溶液，进样测定，记录各样品中待测成分的峰面积，并计算其含量，结果如下。
表13枣仁安神胶囊中各成分的含量(mg/0.45g)
注：峰1：斯皮诺素，峰2：6″′-阿魏酰斯皮诺素，峰3：丹酚酸B，峰4：五味子醇甲，峰5：五味子醇乙，峰6：隐丹参酮，峰7：丹参酮I，峰8：五味子甲素，峰9：丹参酮IIA，峰10：五味子乙素；枣仁安神胶囊规格为每粒0.45g。
由结果可知，15批枣仁安神胶囊中除丹酚酸B的含量相差相对较大外，其他成分含量相差不大，其中编号为Z9、Z11、Z12、Z13、Z14和Z15的枣仁安神胶囊中丹酚酸B含量较低，编号为Z7、Z8和Z10的枣仁安神胶囊中丹酚酸B含量较高。
《中国药典》2020年版中枣仁安神胶囊的含量测定项下，规定每粒胶囊含斯皮诺素不得少于0.40mg，含丹参酮IIA不得少于0.24mg，含五味子醇甲不得少于0.30mg，胶囊规格为每粒0.45g。相对于药典标准来说，各批次枣仁安神胶囊中的斯皮诺素、五味子醇甲和丹参酮IIA均达到了标准。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (3)

1.一种枣仁安神胶囊的全药味HPLC特征图谱检测方法，其特征在于，所述特征图谱的建立方法包括如下步骤：取枣仁安神胶囊内容物，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；采用C18色谱柱Kromasil 100-5-C18，4.6×250mm，5μm，以乙腈A-水B体系为流动相，所述乙腈A-水B体系的流动相中进一步加酸，所述酸选自甲酸，所述酸在流动相A和流动相B中的浓度为0.025％，进行梯度洗脱，并检测，梯度洗脱时间为60min，流动相洗脱梯度为：
，
所述特征图谱共指认了涵盖全药味成分的14个化学成分，所述化学成分具体为：丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、迷迭香酸、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素，
所述检测方法中，柱温是25℃；检测方式为紫外检测，检测波长为270nm；流速为1.0mL/min；特征峰的指认方法为采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对其进行色谱峰匹配，得到匹配数据，并根据各色谱图中色谱峰的保留时间确定其特征峰，所述建立方法中，提取溶剂为70％的甲醇水溶液，胶囊内容物与提取溶剂的比0.1-0.3:5-10；超声处理时间为5-30min。
2.一种基于权利要求1所述的HPLC特征图谱的枣仁安神胶囊全药味多成分含量测定方法，其特征在于，所述测定方法对枣仁安神胶囊中十个主要活性成分进行定量检测，所述十个主要活性成分具体为：斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素；所述测定方法包括以下步骤：
(1)精密称取斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子醇乙、隐丹参酮、丹参酮I、五味子甲素、丹参酮IIA和五味子乙素适量，加甲醇溶解，分别制成对照品储备液；分别吸取各对照品储备液，加甲醇稀释至不同浓度的对照品溶液，HPLC进样测定，记录各对照品不同浓度下的色谱峰面积，以质量浓度xμg/mL为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，确定各对照品的回归方程、相关系数及线性范围，
步骤(1)中各对照品的回归方程、相关系数及线性范围如下：
(2)制备供试品溶液，步骤(2)制备供试品溶液的方法是取待测枣仁安神胶囊内容物，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(3)HPLC进样测定，记录样品中待测成分的峰面积，计算其含量，
步骤(1)和(3)中的HPLC色谱条件为采用C18色谱柱Kromasil 100-5-C18，4.6×250mm，5μm，以含0.025％甲酸的乙腈为流动相A，含0.025％甲酸的水为流动相B，进行梯度洗脱；紫外检测波长为270nm，柱温为25℃，流速为1.0mL/min，进样体积为10μL，
步骤(1)和(3)中的洗脱梯度为
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)制备供试品溶液的方法是取待测枣仁安神胶囊内容物0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇5mL，密塞，称定重量，超声处理5分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
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