CN113917001B - 清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体公开了清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法。所述检测方法包括对清肺排毒颗粒特征图谱中汉黄芩苷的鉴定，以及对清肺排毒颗粒中黄芩苷的定量检测。本发明针对特征图谱的构建方法和黄芩苷的定量检测方法进行了筛选与优化，确定了最佳的色谱条件。本发明所提供的检测方法重复性好、精密度高、稳定性强，在不同的高效液相色谱仪和不同的色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明本发明的方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种中成药中黄芩有效成分 的检测方法。
背景技术
清肺排毒汤，是经过临床验证、由经方演化而来，由麻杏石甘汤、 小柴胡汤、五苓散和射干黄芩汤4个经典名方组成。药物组方有宣、 有清、有健脾、有和胃，方子涵盖面广，考虑到了寒、热、燥以及胃 肠问题，经过临床验证疗效确切后加以推广，该方也可用于普通感冒 和流感患者。
清肺排毒颗粒，是一种在清肺排毒汤中药复方的基础上改良而成 的颗粒剂，解决了汤剂存放、使用和携带不便的问题，利于所述中药 复方的推广应用。
在清肺排毒颗粒的制备过程中，需用到黄芩、炙甘草、燀苦杏仁、 石膏、桂枝、泽泻、猪苓、白术、茯苓、柴胡、黄芩、姜半夏、生姜、 紫苑、款冬花、射干、细辛、山药、枳实、陈皮、广藿香等二十一味 药材。
其中，黄芩为唇形科黄芩属植物黄芩的干燥根，具有清热燥湿， 泻火解毒，止血，安胎的功效。主治湿温，暑湿，胸闷呕恶，湿热痞 满，黄疸泻痢，肺热咳嗽，高热烦渴，血热吐衄，胎动不安。黄芩中 的有效成分为黄芩苷，为一种黄酮类化合物，具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能。黄芩苷作为清肺排毒颗粒主要的功能性成分，其含量 的测定与控制将对清肺排毒颗粒药物的质量控制起到不可忽视的关键 作用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供清肺排毒 颗粒中黄芩有效成分的检测方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法，所 述检测方法包括对黄芩苷的定量检测方法，所述定量检测方法为：
采用高效液相色谱法，对供试品和对照品制备的供试品溶液和对 照品溶液进行色谱测定，根据测定结果计算供试品中黄芩有效成分的 含量；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇和 0.15～0.25％磷酸溶液为流动相，且二者的用量体积比为44:56～46:54；
流速：0.9～1.1mL/min；
检测波长：280nm；
柱温：15～40℃；
进样量：10μL；
其中，所测定的黄芩有效成分为黄芩苷，相应地，以黄芩苷作为 对照品。
作为优选，所述流动相为甲醇和0.2％磷酸溶液，且二者的用量体 积比为45:55。
作为优选，所述柱温为30℃。
进一步优选，在制备供试品溶液时，采用70％乙醇溶液作为提取 溶剂，对供试品中的黄芩有效成分进行提取。
又进一步地，在制备供试品溶液时，采用超声处理的方式进行黄 芩有效成分的提取，提取时间为15～45min。
更进一步地，所述定量检测方法具体为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂；以甲醇-0.2％磷酸溶液(45：55)为流动相；检测波长为280nm；柱 温为30℃，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制 成每1mL含60μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，密塞，称定重量，超声 处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重 量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液 相色谱仪，测定，即得；
本品每袋含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，应为38.29～144.95 mg。
作为优选，所述超声处理的功率为250W，频率为40kHz。
为了更好的对清肺排毒颗粒中黄芩的有效成分进行检测，本发明 所述检测方法在对黄芩苷进行定量检测的基础上，还进一步对汉黄芩 苷进行定性检测，所述定性检测方法包括如下步骤：
(1)构建清肺排毒颗粒样品的特征图谱：
采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷 键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，检测 波长为265nm，进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱过程为：0-50min内，流动相A和流动相B的体积比 从16：84匀速渐变至21：79；50-95min内，流动相A和流动相B的体积 比从21：79匀速渐变至50：50；
其中，以黄芩苷为参照品；
(2)判断特征图谱中是否含有汉黄芩苷峰：
以黄芩苷为参照峰S，设定黄芩苷的相对保留时间为1，根据特征 图谱中相对保留时间在1.33±7％范围内是否出峰，判断样品中是否含 有汉黄芩苷。
进一步地，构建清肺排毒颗粒样品的特征图谱的方法具体包括如 下步骤：
1)参照品溶液的制备：取黄芩苷参照品适量，精密称定，加 10％～100％甲醇或乙醇制成每1mL含0.1mg黄芩苷的参照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取本品，研细，取约2g，精密称定，置具 塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声处理20分钟，取出，放冷，离 心，取上清液10mL，通过C18固相萃取小柱，以20mL 20％甲醇洗 脱，弃去20％甲醇液，再以10mL30％～100％甲醇或乙醇洗脱，收集 洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
3)测定：分别精密吸取参照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液 相色谱仪，测定，记录色谱图，即得清肺排毒颗粒的特征图谱；
以上步骤1)和步骤2)的顺序不分先后。
作为优选，在汉黄芩苷定性检测方法中使用的色谱柱选自Welch Uitimate AQ-C18或INDUSTRIES Caprisil AQ C18色谱柱，柱长为 25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如 无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合， 得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
首先，本发明首次基于高效液相法实现了对清肺排毒颗粒中黄芩 苷的分离与测定，且不受清肺排毒颗粒中其他药物成分的干扰，为清 肺排毒颗粒中黄芩有效成分的含量测定和质量评价提供了有效的科学 方法。依据本发明方法，黄芩苷在浓度为22.60～226.00μg/mL的范围内， 线性关系良好。该定量方法重复性好、精密度高、稳定性强，在不同的高效液相色谱仪和不同的色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明 本发明的方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
第二，本发明针对清肺排毒颗粒建立了特征图谱，特征图谱的整 体性与全面性符合中药质控的要求，可全面地反映清肺排毒颗粒中所 含化学成分的种类与数量，针对黄芩有效成分之一的汉黄芩苷，可通 过特征图谱中特征峰的相对保留时间对其进行准确的定性。弥补了单 纯指标性成分在质控方面的不足，更具有科学性与全面性，保证了中药质量的均一性和稳定性，提高了在临床上的整体疗效。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符 合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面 将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而 易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前 提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为黄芩苷工作曲线图；
图2为清肺排毒颗粒样品HPLC色谱图；
图3为黄芩苷对照品HPLC色谱图；
图4为黄芩苷阴性样品HPLC色谱图；
图5为清肺排毒颗粒的特征图谱。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将 对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下， 本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但 本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书 中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要 理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对 本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和 精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业 途径得到。
实施例1
本实施例旨在说明对清肺排毒颗粒中黄芩有效成分黄芩苷的定量 检测。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以甲醇-0.2％磷酸溶液(45：55)为流动相；检测波长为280nm；柱温为 30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制 成每1mL含60μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品适量，研细，取约0.5g， 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50mL，密塞，称定 重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再 称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液 相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，应为38.29～144.95mg。
实验例1
本实验例用于说明本发明所述定量方法的确定过程。
一、仪器与试药
仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；岛津LC-20AT高效液相色谱仪， DAD检测器；METTLER TOLEDO XA105，ML-104/02分析天平，梅 特勒-托利多仪器(上海)有限公司。分析天平：赛多利斯Quintix224。
试剂：甲醇、乙醇：分析纯，天津市大茂化学试剂有限公司；磷 酸：分析纯，麦克林；黄芩苷对照品：批号110715-201821，中国食品 药品检定研究院。
样品来源：批号分别为：2004007、2004008、2004009、2004010、 2002001、2009001、2009002、2009003(片仔癀提供)；2003903、2007901、 2007902、2007903、2009902、2009903、2009904(华润三九提供)。
二、实验方法与结果
1.色谱分析条件选择
(1)流动相：参考文献(《小柴胡汤滴丸质量标准研究》)中黄芩 苷的含量测定项，考察甲醇-0.2％磷酸溶液(45:55)为流动相，得到的 色谱图峰形良好，分离度较高，且阴性对照无干扰，所以确定其流动 相为甲醇-0.2％磷酸溶液(45:55)。
(2)检测波长的选择
参考黄芩药材(《中国药典》2020年版一部)中黄芩苷的含量测定 项，选用280nm为检测波长。
2.实验条件的选择
(1)提取溶剂的选择：
参考《中国药典》2020年版黄芩药材含量测定项下黄芩苷提取所 用溶剂为70％乙醇。实验中对比了甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇及 50％甲醇对清肺排毒颗粒中黄芩苷的提取效果。乙醇对黄芩苷的提取相对较低，且理论塔板数均不及甲醇、70％乙醇、50％乙醇及50％甲醇。 考虑到后续大生产样品检测的批量较大，甲醇存在一定的毒性，以及 《中国药典》2020年版采用的提取溶剂为70％乙醇，最终选择70％乙醇 作为提取溶剂。
(2)提取时间的选择
清肺排毒颗粒研成细粉，精密称取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密 加入70％乙醇50mL，密塞，称定重量，分别超声提取(功率200W， 频率50kHz)15min、30min、45min，滤过，取续滤液，即得。注入液 相色谱仪10μL，测定，结果见表1。
表1.提取时间考察
由上述实验结果可知，不同超声时间对于黄芩苷含量测定结果 RSD为0.23％。表明超声时间对于黄芩苷含量测定的影响不大。考虑到 超声15min时，可能超声溶解不完全，因此选择超声时间为30min。
综上所述，确定的供试品溶液制备方法为：取装量差异项下的本 品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇 50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，用70％乙醇 补充减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
3.线性关系考察
配制一定浓度的对照品储备液，稀释，配制成浓度分别为 22.60μg/mL、45.20μg/mL、90.40μg/mL、135.60μg/mL、180.80μg/mL、 226.00μg/mL的对照品溶液，分别进样10μL，测定，记录色谱图。以浓 度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，以浓度对平均峰面积进行回归分析，绘制标准曲线。线性回归方程为：A＝37.6C，r2＝0.9994，在浓度为22.60～226.00μg/mL的范围内，线性关系良好，结果见表2， 见图1。
表2.线性试验结果
| 浓度(mg/mL) | 平均峰面积 |
| 0.0226 | 861 |
| 0.0452 | 1706 |
| 0.0904 | 3393 |
| 0.1356 | 5238 |
| 0.1808 | 6794 |
| 0.2260 | 8417 |
4.空白试验
取黄芩阴性样品适量，同前述供试品溶液的制备方法制备。对照 品溶液、黄芩阴性样品溶液分别进样10μL，记录色谱图，见图2-4。阴 性对照溶液在黄芩苷保留时间处无任何色谱峰，说明阴性样品无干扰， 本方法专属性良好。
5.精密度试验
同一供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，并计算含量及其相 对标准偏差，结果见表3。RSD为0.05％，精密度良好。
表3.精密度试验测定结果
| 序号 | 峰面积 |
| 1 | 3118 |
| 2 | 3119 |
| 3 | 3120 |
| 4 | 3116 |
| 5 | 3118 |
| 6 | 3116 |
| 平均值 | 3117.8 |
| RSD％ | 0.05 |
6.稳定性试验
精密称取样品适量，同前述供试品溶液的制备方法制备样品，取 供试品溶液分别于0h、1h、2h、4h、8h、12h、18h、24h、48h进样10μL， 记录色谱峰面积，并计算含量及相对标准偏差。稳定性试验的RSD为 0.45％，表明黄芩苷在48h内稳定性良好。结果见表4。
表4.稳定性试验结果
7.重复性试验
①重复性试验
取同批号的清肺排毒颗粒样品6份，同前述供试品溶液的制备方法 制备样品，对照品溶液、供试品溶液分别进样10μL，测定，记录色谱图，并计算含量及其相对标准偏差，结果见表5。
表5.重复性试验测定结果
重复性试验测得样品的含量均值为8.336mg/g，RSD为0.46％，数 据显示本方法重现性良好。
②3名不同人员重复性试验
三名实验人员分别取同批号的清肺排毒颗粒样品6份，同前述供试 品溶液的制备方法制备样品，对照品溶液、供试品溶液分别进样10μL， 测定，记录色谱图，并计算含量及其相对标准偏差，结果见表6。
表6.不同人员实验结果
8.回收率试验
取已知黄芩苷准确含量8.336mg/g(批号20200302)的本品研细， 取粉末约0.25g，分别精密称定6份，分别置具塞锥形瓶中，各精密加入 含黄芩苷1.0120mg/mL对照品甲醇溶液2mL(精密称取黄芩苷对照品 26.521mg(含量为95.4％)，用甲醇溶解并定容至25mL)，按本发明所 述定量方法操作，测定结果见下表7。
表7.清肺排毒颗粒黄芩苷准确度实验结果
准确度试验测得样品的平均回收率为103.8％，RSD为1.02％，在 2％以内，符合《中国药典》2020年版四部中9101药品质量标准分析方 法验证指导原则中数据要求(样品含量为10mg/g，回收率限度为 92～105％)。
9.样品测定结果
按本发明方法测定黄芩苷的含量，结果见表8。
表8. 15批样品测定结果
根据上述2个企业提供的15批样品实际测定数据结果显示，黄芩苷 含量在颗粒剂中最低测定值：54.7mg/袋，最高测定值：111.50mg/袋， 平均值：86.28mg/袋。最高测定值与最低测定值相差1倍。考虑到黄芩 药材含量的实际情况，制定颗粒剂上下限量的样品批数较少，因此， 暂时按照最高测定值与最低测定值上下浮动30％计算颗粒剂中黄芩苷 的限量。规定本品每袋含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，在38.29～144.95 mg之间。
10.系统适用性试验
(1)不同厂牌的同类型色谱柱
取清肺排毒汤颗粒样品，同前述供试品溶液的制备方法法制备样 品，对3个品牌的色谱柱(Agilent、Waters、Thermo，规格均为250×4.6 mm，5μm)进行考察。结果表明，黄芩苷运用同类型不同品牌的色谱柱进行测定，RSD为0.25％，符合《中国药典》2015年版四部中9101药 品质量标准分析方法验证指导原则中数据要求(视样品含量范围不同 而定：供试品中黄芩苷含量属于1％数量级，重复性可接受范围： RSD≤2％)，表明色谱柱的耐用性较优。结果见表9。
表9.不同色谱柱考察结果
(2)柱温的变化
取清肺排毒汤颗粒样品，同前述供试品溶液的制备方法法制备样 品，对3个不同温度(15℃、25℃、40℃)进行耐用性考察。不同柱温 考察实验结果RSD为1.11％，黄芩苷在15～40℃的温度范围内测得的含 量未见显著差异，符合《中国药典》2015年版四部中9101药品质量标 准分析方法验证指导原则中数据要求(视样品含量范围不同而定：供 试品中黄芩苷含量属于1％数量级，重复性可接受范围：RSD≤2％)，表 明方法柱温耐用性较优。结果见表10。
表10.不同柱温考察结果
(3)流动相磷酸浓度的变化
取清肺排毒汤颗粒样品适量，同前述供试品溶液的制备方法制备 样品，对磷酸的3个不同的浓度(0.15％、0.20％、0.25％)进行考察。 结果表明，黄芩苷以不同浓度磷酸为流动相进行测定，RSD为0.47％， 符合《中国药典》2015年版四部中9101药品质量标准分析方法验证指 导原则中数据要求(视样品含量范围不同而定：供试品中黄芩苷含量 属于1％数量级，重复性可接受范围：RSD≤2％)，表明流动相磷酸浓度 的耐用性较优。结果见表11。
表11.不同磷酸浓度考察结果
(4)流速的变化
取清肺排毒汤颗粒样品，同前述供试品溶液的制备方法法制备样 品，对3个不同流速(0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min)进行耐用性 考察。不同流速考察实验结果RSD为1.45％，黄芩苷在09-1.1mL/min的 流速范围内测得的含量未见显著差异，符合《中国药典》2020年版四 部中9101药品质量标准分析方法验证指导原则中数据要求(视样品含 量范围不同而定：供试品中黄芩苷含量属于1％数量级，重复性可接受 范围：RSD≤2％)，表明方法流速耐用性较优。结果见表12。
表12.不同流速考察结果
(5)流动相比例的变化
取清肺排毒汤颗粒样品，同前述供试品溶液的制备方法法制备样 品，对3个不同流动相比例(44:56、45:55、46:54)进行耐用性考察。不 同流动相比例考察实验结果RSD为1.22％，黄芩苷在(44:56、45:55、 46:54)的流动相比例下测得的含量未见显著差异，符合《中国药典》 2020年版四部中9101药品质量标准分析方法验证指导原则中数据要求 (视样品含量范围不同而定：供试品中黄芩苷含量属于1％数量级，重 复性可接受范围：RSD≤2％)，表明方法流动相比例耐用性较优。结果 见表13。
表13.不同流动相比例考察结果
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综上所述，本发明所提供的方法重复性好，精密度高，在不同的 高效液相色谱仪和不同的色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明本 发明的方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
实施例2
本实施例旨在说明对清肺排毒颗粒中黄芩有效成分汉黄芩苷的定 性检测。
本实施例中所使用仪器包括：高效液相色谱仪:岛津LC-20AT，检 测器：二极管阵列检测器；KQ-250B型数控超声波清洗器(昆山市超 声仪器有限公司)；分析天平:METTLERTOLEDO XA105梅特勒-托利 多仪器(上海)有限公司。数据采集和分析采用Xcalibur，Metworks， Mass Frontier 7.0软件。ODS：SP-120-50-ODS-B Daisogel Made in Japan。
所述定性方法具体为：
(1)构建清肺排毒颗粒样品的特征图谱：
1)参照品溶液的制备：
取黄芩苷参照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.1mg黄 芩苷的参照品溶液。
2)供试品溶液的制备：
浸提操作：取清肺排毒颗粒样品，研细，取约2g，精密称定，置 具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声处理(功率250W，频率 40kHz)20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10mL，通过C18固相萃 取小柱(C18:ODS，2mL，柱内径1.5cm，高2cm，预先用水20mL洗 脱)，以20％甲醇20mL洗脱，弃去20％甲醇液，再以10mL甲醇洗脱， 收集洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3)色谱测定操作：分别精密吸取参照品溶液与供试品溶液各 5μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得清肺排毒颗粒的特 征图谱(图5)。
其中，色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱， 以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱时 间及流动相比例为：0-50min内，流动相A和流动相B的体积比从16： 84匀速渐变至21：79；50-95min内，流动相A和流动相B的体积比从 21：79匀速渐变至50：50；检测波长为265nm，流速为1.0mL/min；柱 温35℃，理论塔板数按黄芩苷计，应不低于10000。
(2)判断特征图谱中是否含有汉黄芩苷峰：
以黄芩苷为参照峰S，设定黄芩苷的相对保留时间为1，根据特征 图谱中相对保留时间在1.33±7％范围内是否出峰，判断样品中是否含 有汉黄芩苷。
判断原理为：
本发明通过将清肺排毒颗粒标准样品和黄芩苷参照品的色谱图进 行比较，确定清肺排毒颗粒标准样品的色谱图有12个共有特征峰，标 号1～12；其中1号、2号、5号、6号、9号、10号、11号峰分别为柚皮 苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、野鸢尾苷元和16-氧代泽 泻醇A。
设定6号峰的相对保留时间为1，计算其他峰的相对保留时间，其 相对保留时间应在规定值的±7％之内。规定值:0.60(峰1)、0.66(峰 2)、0.68(峰3)、0.70(峰4)、0.76(峰5)、1.00(峰6S)、1.20 (峰7)、1.28(峰8)、1.33(峰9)1.48(峰10)、1.65(峰11)、1.68 (峰12)。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理 解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说 将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精 神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限 制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括对黄芩苷的定量检测方法和对汉黄芩苷的定性检测方法，所述定量检测方法为：
制备供试品溶液时，采用70%乙醇溶液作为提取溶剂，对供试品中的黄芩有效成分进行提取；采用超声处理的方式进行黄芩有效成分的提取，提取时间为30 min；
采用高效液相色谱法，对供试品和对照品制备的供试品溶液和对照品溶液进行色谱测定，根据测定结果计算供试品中黄芩有效成分的含量；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇和0.2%磷酸溶液为流动相，且二者的用量体积比为45:55；
流速：0.9~1.1mL/min；
检测波长：280nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
其中，所测定的黄芩有效成分为黄芩苷，相应地，以黄芩苷作为对照品；
所述对汉黄芩苷的定性检测方法包括如下步骤：
（1）构建清肺排毒颗粒样品的特征图谱：
采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸为流动相B，检测波长为265nm，进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱过程为：0-50min内，流动相A和流动相B的体积比从16：84匀速渐变至21：79；50-95min内，流动相A和流动相B的体积比从21：79匀速渐变至50：50；
其中，以黄芩苷为参照品；
（2）判断特征图谱中是否含有汉黄芩苷峰：
以黄芩苷为参照峰S，设定黄芩苷的相对保留时间为1，根据特征图谱中相对保留时间在1.33±7%范围内是否出峰，判断样品中是否含有汉黄芩苷；
所述步骤（1）包括如下步骤：
1）参照品溶液的制备：取黄芩苷参照品适量，精密称定，加10%～100%甲醇制成每1mL含0.1mg黄芩苷的参照品溶液；
2）供试品溶液的制备：取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声处理20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10mL，通过C18固相萃取小柱，以20mL20%甲醇洗脱，弃去20%甲醇液，再以10mL 30%～100%甲醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
3）测定：分别精密吸取参照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得清肺排毒颗粒的特征图谱；
以上步骤1）和步骤2）的顺序不分先后。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定量检测方法具体为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相，二者的用量体积比为45:55；检测波长为280nm；柱温为30℃，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含60μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品每袋含黄芩以黄芩苷计，应为38.29～144.95 mg。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述超声处理的功率为250W，频率为40kHz。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定性检测方法中使用的色谱柱选自Welch Uitimate AQ-C18或INDUSTRIES Caprisil AQ C18色谱柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
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