CN113030316B - 一种治疗腰骶痛中成药hplc特征图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药质量控制技术领域，特别涉及一种治疗腰骶痛中成药的HPLC特征图谱的构建方法。该方法包括如下步骤：取仙牛腰骶痛颗粒，加入甲醇水溶液，超声处理后滤过，取续滤液，得到供试品溶液；取淫羊藿苷对照品，加入甲醇水溶液，得到参照物溶液。将供试品溶液和参照物溶液分别采用HPLC进行检测，得到仙牛腰骶痛颗粒的HPLC特征图谱；色谱条件为：以乙腈为流动相A，以磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱。本发明克服了仙牛腰骶痛颗粒现有技术中检测方法指标针对性强、覆盖面小的片面性等不足，建立起的特征图谱可全面反映仙牛腰骶痛颗粒复杂的化学成分及其相对比例，是一种符合中药复方特色的质量控制模式，可有效地表征药品质量。

Description

一种治疗腰骶痛中成药HPLC特征图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及中药质量控制技术领域，特别涉及一种治疗腰骶痛中成药的HPLC特征图谱的构建方法。
背景技术
由于中药产地分散，类同品、代用品不断，加之生长环境、采收期、加工炮制方法不同及制剂生产工艺等因素，造成同一厂家生产的不同生产批次产品间内在质量即其所含化学成分及临床疗效的差异。因此，采用有效合理的方式和技术手段进行中药质量一致性评价，以保证中药产品的安全、有效和质量可控。
仙牛腰骶痛颗粒为治疗腰骶痛寒湿阻络证如腰肌劳损、腰椎骨质增生等症的中药复方制剂，由淫羊藿、千年健、地枫皮、牛膝四味中药组成，功能主治为温阳祛湿，通经止痛。质量标准标准中只收载性状、检查、淫羊藿及牛膝的薄层鉴别项及淫羊藿苷含量测定项，因中药复方制剂药味多，成分复杂相互干扰不易有效检测等特点，已有质量检查项并不能全面监控产品质量。因此，建立中成药特征图谱将能较为全面地反映其所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
目前针对仙牛腰骶痛颗粒HPLC特征图谱的构建方法暂无相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种治疗腰骶痛中成药的HPLC特征图谱的构建方法。该方法可有效分离仙牛腰骶痛颗粒复杂的化学成分，是一种符合中药复方特色的质量控制模式，可有效地表征药品质量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种治疗腰骶痛中成药的HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
取由淫羊藿、千年健、地枫皮、牛膝四味中药制成的中成药，加入甲醇水溶液，进行提取，得到供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品，加入甲醇水溶液，得到参照物溶液；
将供试品溶液和参照物溶液分别采用HPLC进行检测，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％～0.15％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序：
0～20min，A相5％～15％；B相95％～85％；
20～40min，A相15％～25％；B相85％～75％；
40～60min，A相25％～35％；B相75％～65％；
60～80min，A相35％～45％；B相65％～55％；
80～90min，A相45％～5％；B相55％～95％；
检测波长为260～340nm。
作为优选，检测波长为300nm。
作为优选，甲醇水溶液的体积百分浓度为30％～70％。
优选地，甲醇水溶液的体积百分浓度为50％。
作为优选，提取为超声提取，超声提取的功率为500～700W，频率为30～50kHz，时间为15～45分钟。
优选地，超声提取的功率为600W，频率为40kHz，时间为30～45分钟。
作为优选，参照物溶液的浓度为0.05～0.15mg/mL。
作为优选，供试品溶液的浓度为0.01～0.1g/mL。
作为优选，流动相B为0.1％磷酸水溶液。
作为优选，HPLC的柱温为30～40℃。
作为优选，HPLC的流速为0.5～1.5mL/min。
作为优选，进样量为5～15μL。
在本发明中，由淫羊藿、千年健、地枫皮、牛膝四味中药制成的中成药为仙牛腰骶痛颗粒。
作为优选，色谱柱为Kromasil 100-5-C18，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
本发明还提供了一种治疗腰骶痛中成药的HPLC对照特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
采用上述HPLC检测方法检测2～20批次样品，得到2～20批次样品的HPLC特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对特征图谱进行分析，确定共有特征峰，生成由共有峰构成的对照特征图谱。
本发明提供了一种治疗腰骶痛中成药的HPLC检测方法。该方法包括：取由淫羊藿、千年健、地枫皮、牛膝四味中药制成的中成药，加入甲醇水溶液，进行提取，得到供试品溶液；取淫羊藿苷对照品，加入甲醇水溶液，得到参照物溶液；将供试品溶液和参照物溶液分别采用HPLC进行检测，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％～0.15％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为260～340nm。本发明的有益效果如下：
本发明对仙牛腰骶痛颗粒进行了HPLC特征图谱试验研究，建立了特征图谱的质量检测方法，并对所建立方法进行了精密度、重复性等方法学验证试验，结果表明本发明中检测方法稳定可行。本发明克服了仙牛腰骶痛颗粒现有技术中检测方法指标针对性强、覆盖面小的片面性等不足，建立起的特征图谱可全面反映仙牛腰骶痛颗粒复杂的化学成分及其相对比例，是一种符合中药复方特色的质量控制模式，可有效地表征药品质量；
本发明的最佳紫外吸收波长为300nm。采用本发明中方法用DAD检测器对仙牛腰骶痛颗粒进行测定，根据三维扫描图中所有色谱峰出现最大吸收的检测波长结果分别调取各波长下色谱图，当检测波长为300nm时，特征峰数目较多，各峰面积较高且各特征峰之间分离效果也最好。
附图说明
图1示实施例1仙牛腰骶痛颗粒HPLC特征图谱，峰11：淫羊藿苷；
图2示实施例5仙牛腰骶痛颗粒10批次HPLC特征图谱共有模式图；
图3示实施例5仙牛腰骶痛颗粒对照特征图谱；
图4示对比例1仙牛腰骶痛颗粒流动相选择色谱图；
图5示对比例2仙牛腰骶痛颗粒流动相比例选择色谱图；
图6示对比例3仙牛腰骶痛颗粒流动相比例选择色谱图；
图7示对比例4仙牛腰骶痛颗粒不同厂家色谱柱色谱图；
图8示对比例5仙牛腰骶痛颗粒不同提取溶剂(乙醇)色谱图；
图9示对比例5仙牛腰骶痛颗粒不同提取溶剂(甲醇)色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种治疗腰骶痛中成药的HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的治疗腰骶痛中成药的HPLC检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：一种治疗腰骶痛中成药HPLC特征图谱的构建方法
仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；MettlerAE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS205DU电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为纯化水。
试药：淫羊藿苷(均购自中国食品药品检定研究院)。
方法与结果
(1)供试品溶液的制备：取仙牛腰骶痛颗粒约1g，精密称定，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)参照物溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含0.1mg的溶液，即得。
(3)测定：采用Kromasil 100-5-C18(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；检测波长为300nm；柱温为35℃；流速为1.0mL/min。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000。以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱的时间及流动相比例如表1所示：
表1仙牛腰骶痛颗粒特征图谱流动相时间及梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～20 5→15 95→85
20～40 15→25 85→75
40～60 25→35 75→65
60～80 35→45 65→55
80～90 45→5 55→95
精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到仙牛腰骶痛颗粒的HPLC特征图谱，如图1所示。
实施例2：一种治疗腰骶痛中成药HPLC特征图谱的构建方法
仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；MettlerAE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS205DU电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为纯化水。
试药：淫羊藿苷(均购自中国食品药品检定研究院)。
方法与结果
(1)供试品溶液的制备：取仙牛腰骶痛颗粒约0.5g，精密称定，精密加入70％甲醇15mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)45分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)参照物溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含0.05mg的溶液，即得。
(3)测定：采用Kromasil 100-5-C18(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；检测波长为260nm；柱温为30℃；流速为0.5mL/min。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000。以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱的时间及流动相比例同表1。
精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到仙牛腰骶痛颗粒的HPLC特征图谱。
实施例3：一种治疗腰骶痛中成药HPLC特征图谱的构建方法
仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；MettlerAE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS205DU电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为纯化水。
试药：淫羊藿苷(均购自中国食品药品检定研究院)。
方法与结果
(1)供试品溶液的制备：取仙牛腰骶痛颗粒约1.5g，精密称定，精密加入30％甲醇45mL，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)15分钟，放冷，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)参照物溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lmL含0.15mg的溶液，即得。
(3)测定：采用Kromasil 100-5-C18(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；检测波长为340nm；柱温为40℃；流速为1.5mL/min。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于10000。以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱的时间及流动相比例同表1。
精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到仙牛腰骶痛颗粒的HPLC特征图谱。
实施例4：仙牛腰骶痛颗粒特征图谱测定方法学考察
精密度试验：取仙牛腰骶痛颗粒，按实施例1供试品溶液制备方法制成供试品溶液，连续进样6次，依法检测。结果：6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2％，表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取仙牛腰骶痛颗粒，按实施例1供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别在0、2、4、8、12小时依法进行检测。结果：5次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2％，表明供试品溶液在12小时之内稳定。
重复性试验：取同一批仙牛腰骶痛颗粒，按实施例1供试品溶液制备方法制成6份供试品溶液，依法测定。结果：6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2％，表明方法的重复性较好。
考察了实施例2、3的方法的精密度、稳定性、重复性，结果与实施例1方法的结果相近，同样显示了良好的精密度、稳定性、重复性。
实施例5：构建仙牛腰骶痛颗粒的对照特征图谱
取仙牛腰骶痛颗粒10批，按实施例1的条件进行测定，得到10批次样品HPLC特征图谱，如图2所示。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对10批特征图谱进行比较，确定共有特征峰，生成由14个共有峰构成的对照特征图谱，如图3所示。其中参照峰为淫羊藿苷峰(11号峰)。
相似度分析：计算10批供试品特征图谱与生成的对照特征图谱的相似度，结果均大于0.90。相似度比较结果如表2所示。
表2仙牛腰骶痛颗粒HPLC特征图谱相似度评价结果
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 R
S1 1 0.999 0.997 0.952 0.968 0.997 0.946 0.998 0.942 0.994 0.976
S2 0.999 1 0.998 0.966 0.972 0.998 0.965 0.999 0.952 0.995 0.978
S3 0.997 0.998 1 0.971 0.975 1 0.957 1 0.962 0.993 0.980
S4 0.952 0.966 0.971 1 0.946 0.969 0.918 0.968 0.957 0.971 0.973
S5 0.968 0.972 0.975 0.946 1 0.974 0.945 0.974 0.966 0.968 0.905
S6 0.997 0.998 1 0.969 0.974 1 0.956 1 0.966 0.994 0.980
S7 0.946 0.965 0.957 0.918 0.945 0.956 1 0.956 0.957 0.959 0.985
S8 0.998 0.999 1 0.968 0.974 1 0.956 1 0.958 0.994 0.980
S9 0.942 0.952 0.962 0.957 0.966 0.966 0.957 0.958 1 0.966 0.971
S10 0.994 0.995 0.993 0.971 0.968 0.994 0.959 0.994 0.966 1 0.978
R 0.976 0.978 0.980 0.973 0.905 0.980 0.985 0.980 0.971 0.978 1
对比例1：
该对比例与实施例1相近，唯一不同的是流动相选择甲醇-0.1％磷酸，其特征图谱见图4。将该图与以乙腈-0.1％磷酸溶液作为流动相得到的图谱相比，显示色谱图中色谱峰数目较少，表明以甲醇-0.1％磷酸为流动相时不利于表征样品整体质量情况。
对比例2：
该对比例与实施例1相近，唯一不同的是洗脱程序不同，该对比例的洗脱程序如下：
0～20min，A相：5～15％、B相：95～85％；
20～30min，A相：15～25％、B相：85～75％；
30～60min，A相：25～35％、B相：75～65％；
60～70min，A相：35～45％、B相：65～55％；
70～80min，A相：45～5％、B相：65～95％。
特征图谱见图5。结果显示，色谱图中各色谱峰集中在相对保留时间20～50分钟，各峰分离效果较差，基线不平稳。
对比例3：
该对比例与实施例1相近，唯一不同的是洗脱程序不同，该对比例的洗脱程序如下：
0～25min，A相：5～17.5％、B相：95～82.5％；
25～30min，A相：17.5～25％、B相：82.5～75％；
30～65min，A相：25～35％、B相：75～65％；
65～75min，A相：35～45％、B相：65～55％；
75～80min，A相：45～5％、B相：55～95％。
特征图谱见图6。结果显示，色谱图中各色谱峰集中在相对保留时间20～50分钟，各峰分离效果较差，基线不平稳。
对比例4：
该对比例与实施例1相近，唯一不同的是采用色谱柱的厂家和型号不同，该对比例采用的是ZORBAX SB-C18色谱柱(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)，其特征图谱见图7。
结果显示，供试品色谱图中，5～25分钟之间色谱峰分离效果与采用Kromasil100-5-C18色谱柱测定色谱图比较差，且杂峰较多。
对比例5：
该对比例与实施例1相近，唯一不同的是供试品提取溶剂不同，该对比例的供试品提取溶剂为乙醇(100％)、甲醇(100％)。其特征图谱见图8、9。
结果显示，以乙醇、甲醇为溶剂供试品色谱中，各别色谱峰吸收值均较小且峰个数较少。表明以乙醇、甲醇为溶剂时不利于表征样品整体质量情况。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种治疗腰骶痛中成药的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
取由淫羊藿、千年健、地枫皮、牛膝四味中药制成的中成药，加入甲醇水溶液，进行提取，得到供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品，加入甲醇水溶液，得到参照物溶液；
将供试品溶液和参照物溶液分别采用HPLC进行检测，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％～0.15％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序：
0～20min，A相5％～15％；B相95％～85％；
20～40min，A相15％～25％；B相85％～75％；
40～60min，A相25％～35％；B相75％～65％；
60～80min，A相35％～45％；B相65％～55％；
80～90min，A相45％～5％；B相55％～95％；
检测波长为260～340nm。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积百分浓度为30％～70％。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提取为超声提取，所述超声提取的功率为500～700W，频率为30～50kHz，时间为15～45分钟。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述参照物溶液的浓度为0.05～0.15mg/mL，供试品溶液的浓度为0.01～0.1g/mL。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述流动相B为0.1％磷酸水溶液。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述HPLC的柱温为30～40℃。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述HPLC的流速为0.5～1.5mL/min，进样量为5～15μL。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述由淫羊藿、千年健、地枫皮、牛膝四味中药制成的中成药为仙牛腰骶痛颗粒。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的构建方法，其特征在于，色谱柱为Kromasil 100-5-C18，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
10.一种治疗腰骶痛中成药的HPLC对照特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用权利要求1至9中任一项所述HPLC检测方法检测2～20批次样品，得到2～20批次样品的HPLC特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对特征图谱进行分析，确定共有特征峰，生成由共有峰构成的对照特征图谱。
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