CN107561192A - 一种测定板蓝根药材及其制品中r‑告依春和s‑告依春含量的方法 - Google Patents
一种测定板蓝根药材及其制品中r‑告依春和s‑告依春含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测定板蓝根药材及其制品中R‑告依春和S‑告依春含量的方法，所述方法包括：标准曲线的制作、供试品溶液的制备和含量测定步骤，所述供试品溶液的制备是首先对待测定的板蓝根药材或其制品进行回流提取或超声提取，然后对提取液用固相萃取柱进行洗脱，收集的洗脱液经过氮吹干燥后的残渣经溶解、过滤得到；所述含量测定是采用高效液相‑紫外‑圆二色谱法。本发明通过所述方法首次实现了对板蓝根药材及其制品中的R‑告依春和S‑告依春这对对映异构体含量的分别测定，无需使用手性色谱柱就可以快速、简便、准确、高精度测定R‑告依春和S‑告依春这对对映异构体的含量，对监测板蓝根药材及其制品的质量具有显著应用价值。
Description
技术领域
本发明是涉及板蓝根药材及其制品中R-告依春和S-告依春含量的测定方法，属于中药分析技术领域。
背景技术
中药板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fortune)的干燥根，具有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛之功效，广泛用于治疗各种疾病，如流感、腮腺炎、温病发热、风热感冒、咽喉肿烂、流行性乙型脑炎、肝炎等。板蓝根饮片为板蓝根除去杂质、洗净、润透、切厚片、干燥后制得。板蓝根颗粒和复方板蓝根颗粒为常用的非处方药品，是以板蓝根为原料的最具代表性的中药制剂。板蓝根对SARS、H1N1等恶性传染性疾病的防治作用已经得到临床验证，在当下全球流感肆虐之时，板蓝根成为应用最广泛的中药品种之一。
R,S-告依春为板蓝根中的特征性化学成分，R-告依春和S-告依春为一对对应异构体，两者同时存在于板蓝根中。研究表明：板蓝根中R-告依春具有抗病毒活性，而其对映体S-告依春具有致甲状腺肿大的作用。但现有技术均是以R,S-告依春为指标成分对板蓝根药材和饮片进行质量控制，仅能检测和反映R,S-告依春的总含量，不能够分别准确地反映出S-告依春和抗病毒活性成分R-告依春的含量，致使板蓝根药材及其制品的使用存在潜在隐患和风险。因此，有必要研发能对板蓝根药材及其制品中R-告依春和S-告依春这对对映异构体的含量进行分别测定的分析方法。
目前虽有文献报道可采用手性正相-高效液相色谱法(NP-HPLC)测定板蓝根中的R-告依春和S-告依春含量，但是此方法需要使用手性色谱柱和正相-高效液相色谱，不仅成本高，而且不适合常规质量分析。
此外，板蓝根药材及其制品中化学成分复杂多样，除了R-告依春和S-告依春外，还有靛蓝、靛玉红、多种有机酸、核苷、氨基酸等多种成分，并且R-告依春和S-告依春含量低，以致板蓝根药材及其制品中的R-告依春和S-告依春的含量测定具有很多干扰因素，因此至今还未能实现对板蓝根药材及其制品中的对映异构体：R-告依春和S-告依春的含量进行快速、简便、准确测定。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种可以快速、简便、准确地测定板蓝根药材及其制品中R-告依春和S-告依春含量的方法，以实现对板蓝根药材及其制品中R-告依春和S-告依春含量的有效监控。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种测定板蓝根药材及其制品中R-告依春和S-告依春含量的方法，包括：标准曲线的制作、供试品溶液的制备和含量测定步骤，其特征在于：
a)所述供试品溶液的制备方法如下：
精密称取待测定的板蓝根药材或其制品，用去离子水进行回流提取或超声提取；过滤提取液，将所得滤液上样至固相萃取柱中，先用水冲洗，然后用甲醇洗脱，上样和洗脱过程均需控制流速≤1滴/秒；收集甲醇洗脱液，氮吹至干燥，残渣再用甲醇溶解，过滤，所得滤液即为供试品溶液；
b)所述含量测定采用高效液相-紫外-圆二色谱(HPLC-UV-CD)法，具体测定条件为：采用C18色谱柱，紫外检测器和圆二色检测器；流动相由A相与B相按体积比为10：90～15：85组成，其中A相为100％乙腈，B相是质量浓度为0.02％～0.03％的磷酸水溶液；流动相流速为0.5～1.0mL/分钟；紫外检测波长为230nm，圆二色检测波长为280nm；柱温为30℃；进样量为10μL；采集紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA。
作为优选方案，所述标准曲线的制作包括如下步骤：
①对照品溶液的制备
分别精密称定R-告依春对照品和S-告依春对照品适量，用甲醇配制成浓度为0.05～0.6mg/mL的R-告依春对照品溶液和浓度为0.05～0.6mg/mL的S-告依春对照品溶液；按比例混合R-告依春对照品溶液和S-告依春对照品溶液，配制成不同含量的系列对照品溶液；
②采用高效液相-紫外-圆二色谱法按步骤b)所述测试条件对步骤①配制的系列对照品溶液分别进行测定，并以R-告依春的质量百分含量为横坐标X，以圆二色谱峰面积ΔA与紫外色谱峰面积A的比值(g＝ΔA/A)为纵坐标Y，进行回归处理并绘制标准曲线。
作为优选方案，所述含量测定包括如下步骤：
1)精密称定R,S-告依春对照品适量，用甲醇配制成浓度为0.05～0.6mg/mL的R,S-告依春对照品溶液；
2)采用高效液相色谱柱-紫外检测器测定供试品，采集供试品的紫外色谱峰面积A，并以外标法计算供试品中R,S-告依春的质量含量；
3)采用高效液相色谱柱-圆二色检测器测定供试品，采集供试品的圆二色谱峰面积ΔA，由计算的g＝ΔA/A值和标准曲线，得到供试品中R-告依春的质量百分含量；
4)由得到的R,S-告依春的质量含量和R-告依春的质量百分含量，计算得到R-告依春的质量含量，进而计算得到S-告依春的质量含量，从而实现对供试品中R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定。
本发明中所述板蓝根制品包括板蓝根饮片和板蓝根制剂。
作为优选方案，所述回流提取的时间为30～90分钟。
作为优选方案，所述超声提取的时间为10～30分钟。
作为优选方案，步骤a)对收集的甲醇洗脱液进行氮吹干燥的温度为30～60℃。
作为优选方案，所述流动相由100％乙腈与质量浓度为0.02％的磷酸水溶液按体积比为10：90组成。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明首次实现了对板蓝根药材及其制品中的R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定，而且操作简单，准确度高，检测精度可达微克级，对监测板蓝根药材及其制品的质量具有显著应用价值。
附图说明
图1为实施例1获得的R-告依春对照品的高效液相-紫外色谱图；
图2为实施例1获得的R-告依春对照品的高效液相-圆二色谱图；
图3为实施例1获得的S-告依春对照品的高效液相-紫外色谱图；
图4为实施例1获得的S-告依春对照品的高效液相-圆二色谱图；
图5为实施例1获得的R,S-告依春对照品的高效液相-紫外色谱图；
图6为实施例1获得的R,S-告依春对照品的高效液相-圆二色谱图；
图7为实施例1获得的板蓝根药材样品的高效液相-紫外色谱图；
图8为实施例1获得的板蓝根药材样品的高效液相-圆二色谱图；
图9为实施例2获得的板蓝根饮片样品的高效液相-紫外色谱图；
图10为实施例2获得的板蓝根饮片样品的高效液相-圆二色谱图；
图11为实施例3获得的板蓝根颗粒剂样品的高效液相-紫外色谱图；
图12为实施例3获得的板蓝根颗粒剂样品的高效液相-圆二色谱图；
图13为实施例4获得的复方板蓝根颗粒剂样品的高效液相-紫外色谱图；
图14为实施例4获得的复方板蓝根颗粒剂样品的高效液相-圆二色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案做进一步详细、完整地说明。下面实施例所用的实验方法无特殊说明，均为常规方法和实验条件。
实施例1：测定板蓝根药材中R-告依春和S-告依春的含量
1.1主要仪器与试药
高效液相色谱仪(1260型，美国安捷伦科技有限公司，包括四元泵，柱温箱，自动进样器，DAD检测器和数字转换器)；
圆二色检测器(CD-2095型，日本Jasco公司)；
电子分析天平(AE200型，北京Mettler仪器有限公司)；
数控超声波清洗器(KQ-250DB型，昆山市超声仪器有限公司)；
Oasis WAX固相萃取柱(美国沃特斯公司)；
R,S-告依春、R-告依春和S-告依春的对照品(上海中药标准化研究中心)；
乙腈、磷酸均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；
板蓝根药材，产地：安徽芜湖，批号：20110205。
1.2测定条件
SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：由100％乙腈与质量浓度为0.02％的磷酸水溶液按体积比为10：90组成；
紫外检测波长为230nm；圆二色检测波长为280nm；
流动相的流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL。
1.3对照品溶液的制备
分别精密称定R,S-告依春、R-告依春和S-告依春的对照品适量，用甲醇配制成浓度为0.5036mg/mL的R,S-告依春对照品溶液、浓度为0.5488mg/mL的R-告依春对照品溶液和浓度为0.5080mg/mL的S-告依春对照品溶液；
1.4供试品溶液的制备
取板蓝根药材粉末(粉碎过三号筛)约1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入水20mL，回流提取60分钟，放冷，过滤，将1mL滤液转移至预先处理好(先用3mL甲醇活化，再用3mL水平衡)的固相萃取柱中，先用水2mL冲洗，然后用2mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱溶液，于50℃氮吹干燥，残渣再用甲醇溶解，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
1.5线性关系考察
首先，将R-告依春和S-告依春的对照品溶液按表1所示比例进行混合，配制成不同含量的系列对照品溶液；
然后，采用高效液相-紫外-圆二色谱法按上述测试条件对配制的系列对照品溶液分别进行测定，并分别采集紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA(详见表1所示)；图1为获得的R-告依春对照品的高效液相-紫外色谱(HPLC-UV)图，图2为获得的R-告依春对照品的高效液相-圆二色谱(HPLC-CD)图，图3为获得的S-告依春对照品的高效液相-紫外色谱(HPLC-UV)图，图4为获得的S-告依春对照品的高效液相-圆二色谱(HPLC-CD)图，图5为获得的R,S-告依春对照品的高效液相-紫外色谱(HPLC-UV)图，图6为获得的R,S-告依春对照品的高效液相-圆二色谱(HPLC-CD)图；
以R-告依春的质量百分含量为横坐标X，以圆二色谱峰面积ΔA与紫外色谱峰面积A的比值(g＝ΔA/A)为纵坐标Y，进行回归处理得到如下回归方程：
Y＝-0.0057X+0.3105，R2＝0.9998；
可见，R-告依春的质量百分含量与g因子(g＝ΔA/A)呈良好线性关系，说明本发明方法准确性高。
表1
| R-告依春(w％) | CD峰面积(ΔA) | UV峰面积(A) | g因子 |
| 100 | -3624.4 | 14206.5 | -0.2550 |
| 80 | -2087.9 | 14061.5 | -0.1484 |
| 65 | -906.9 | 14027.4 | -0.0648 |
| 50 | 206.5 | 13864.9 | 0.0149 |
| 35 | 1382.6 | 13820.3 | 0.1000 |
| 20 | 2580.6 | 13735.7 | 0.18781 |
| 0 | 4156.8 | 13616.9 | 0.3056 |
1.6g因子稳定性考察
取已知浓度的S-告依春对照品溶液，依次配制成表2所示的五种浓度的溶液，并分别按上述高效液相-紫外-圆二色谱法进行测定，考察浓度对g因子的影响，详细结果见表2所示。
表2浓度对g因子的影响
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD％ |
| 浓度 | 0.5080 | 0.4064 | 0.3048 | 0.2032 | 0.1016 | 0.0508 | / |
| g因子 | 0.3213 | 0.3111 | 0.3083 | 0.3035 | 0.3120 | 0.3104 | 1.88％ |
由表2可见：g因子的相对标准偏差RSD％为1.88％，表明对照品溶液浓度在0.05～0.6mg/mL范围内对g因子影响很小，说明本发明方法的稳定性好，适用性强。
1.7样品含量测定
取板蓝根药材粉末(粉碎过三号筛)约1.0g，精密称定，按“供试品溶液制备”项下操作，制成供试品溶液；精密吸取R,S-告依春对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，采用高效液相-紫外-圆二色谱法按上述测试条件分别进行测定，并分别采集紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA；图7为获得的板蓝根药材样品的高效液相-紫外色谱图，图8为获得的板蓝根药材样品的高效液相-圆二色谱图；
以外标法计算得到测试的板蓝根药材样品中R,S-告依春的质量含量为0.5472mg/g；
依据采集的供试品的紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA，可计算得到g＝ΔA/A＝-0.0811，然后依据标准曲线的线性回归方程(Y＝-0.0057X+0.3105，R2＝0.9998)可得到供试品中R-告依春的质量百分含量为68.7％(-0.0811＝-0.0057X+0.3105)，进而也可得到S-告依春的质量百分含量为31.3％；
由得到的R,S-告依春的质量含量0.5472mg/g和R-告依春的质量百分含量68.7％，可计算得到R-告依春的质量含量为0.3759mg/g(＝0.5472mg/g×68.7％)，进而可计算得到S-告依春的质量含量为0.1713mg/g(＝0.5472-0.3759)，从而实现对板蓝根药材样品中R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定。
实施例2：测定板蓝根饮片中R-告依春和S-告依春的含量
2.1主要仪器与试药
板蓝根饮片，产地：安徽，批号：100709；其余试药与仪器均同实施例1。
2.2供试品溶液的制备
取板蓝根饮片粉末(粉碎过三号筛)约1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入水20mL，回流60分钟，放冷，过滤，将1mL滤液转移至预先处理好(先用3mL甲醇活化，再用3mL水平衡)的固相萃取柱中，先用水2mL冲洗，然后用2mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱溶液，于50℃氮吹干燥，残渣再用甲醇溶解，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3样品含量测定
取板蓝根饮片粉末(粉碎过三号筛)约1.0g，精密称定，按“供试品溶液制备”项下操作，制成供试品溶液；精密吸取R,S-告依春对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，采用高效液相-紫外-圆二色谱法按上述测试条件分别进行测定，并分别采集紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA；图9为获得的板蓝根饮片样品的高效液相-紫外色谱图，图10为获得的板蓝根饮片样品的高效液相-圆二色谱图；
以外标法计算得到测试的板蓝根饮片样品中R,S-告依春的质量含量为0.5381mg/g；
依据采集的供试品的紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA，可计算得到g＝ΔA/A＝-0.0657，然后依据标准曲线的线性回归方程(Y＝-0.0057X+0.3105，R2＝0.9998)可得到供试品中R-告依春的质量百分含量为66.0％(-0.0657＝-0.0057X+0.3105)，进而也可得到S-告依春的质量百分含量为34.0％；
由得到的R,S-告依春的质量含量0.5381mg/g和R-告依春的质量百分含量66.0％，可计算得到R-告依春的质量含量为0.3551mg/g(＝0.5381mg/g×66.0％)，进而可计算得到S-告依春的质量含量为0.1830mg/g(＝0.5381-0.3551)，从而实现对板蓝根饮片样品中R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定。
实施例3：测定板蓝根颗粒剂中R-告依春和S-告依春的含量
3.1主要仪器与试药
板蓝根颗粒剂，产地：上海，批号：121102；其余试药与仪器同实施例1。
3.2供试品溶液的制备
取板蓝根颗粒约2.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声(功率：240W，频率：45Khz)提取15分钟，放冷，过滤，将1mL滤液转移至预先处理好(先用3mL甲醇活化，再用3mL水平衡)的固相萃取柱中，先用水2mL冲洗，然后用2mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱溶液，于50℃氮吹干燥，残渣再用甲醇溶解，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
3.3样品含量测定
取板蓝根颗粒约2.0g，研细，精密称定，按“供试品溶液制备”项下操作，制成供试品溶液；精密吸取R,S-告依春对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，采用高效液相-紫外-圆二色谱法按上述测试条件分别进行测定，并分别采集紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA；图11为获得的板蓝根颗粒样品的高效液相-紫外色谱图，图12为获得的板蓝根颗粒样品的高效液相-圆二色谱图；
以外标法计算得到测试的板蓝根颗粒样品中R,S-告依春的质量含量为0.1678mg/g；
依据采集的供试品的紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA，可计算得到g＝ΔA/A＝-0.0606，然后依据标准曲线的线性回归方程(Y＝-0.0057X+0.3105，R2＝0.9998)可得到供试品中R-告依春的质量百分含量为65.1％(-0.0606＝-0.0057X+0.3105)，进而也可得到S-告依春的质量百分含量为34.9％；
由得到的R,S-告依春的质量含量0.1678mg/g和R-告依春的质量百分含量65.1％，可计算得到R-告依春的质量含量为0.1092mg/g(＝0.1678mg/g×65.1％)，进而可计算得到S-告依春的质量含量为0.0586mg/g(＝0.1678-0.1092)，从而实现对板蓝根颗粒样品中R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定。
实施例4：测定复方板蓝根颗粒剂中R-告依春和S-告依春的含量
4.1主要仪器与试药
复方板蓝根颗粒剂，产地：重庆，批号：1304107；其余试药与仪器同实施例1。
4.2供试品溶液的制备
取复方板蓝根颗粒约4.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声(功率：240W，频率：45Khz)提取15分钟，放冷，过滤，将1mL滤液转移至预先处理好(先用3mL甲醇活化，再用3mL水平衡)的固相萃取柱中，先用水2mL冲洗，然后用2mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱溶液，于50℃氮吹干燥，残渣再用甲醇溶解，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
4.3样品含量测定
取复方板蓝根颗粒约4.0g，研细，精密称定，按“供试品溶液制备”项下操作，制成供试品溶液；精密吸取R,S-告依春对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，采用高效液相-紫外-圆二色谱法按上述测试条件分别进行测定，并分别采集紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA；图13为获得的复方板蓝根颗粒样品的高效液相-紫外色谱图，图14为获得的复方板蓝根颗粒样品的高效液相-圆二色谱图；
以外标法计算得到测试的复方板蓝根颗粒样品中R,S-告依春的质量含量为0.0299mg/g；
依据采集的供试品的紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA，可计算得到g＝ΔA/A＝-0.0725，然后依据标准曲线的线性回归方程(Y＝-0.0057X+0.3105，R2＝0.9998)可得到供试品中R-告依春的质量百分含量为67.2％(-0.0725＝-0.0057X+0.3105)，进而也可得到S-告依春的质量百分含量为32.8％；
由得到的R,S-告依春的质量含量0.0299mg/g和R-告依春的质量百分含量67.2％，可计算得到R-告依春的质量含量为0.0201mg/g(＝0.0299mg/g×67.2％)，进而可计算得到S-告依春的质量含量为0.0098mg/g(＝0.0299-0.0201)，从而实现对复方板蓝根颗粒样品中R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定。
通过上述实施例可见：采用本发明所述方法可实现对板蓝根药材及其制品中的R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定，具有操作简单、准确度高、检测精度高、稳定可靠等优点，对监测板蓝根药材及其制品的质量具有显著应用价值。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种测定板蓝根药材及其制品中R-告依春和S-告依春含量的方法，包括：标准曲线的制作、供试品溶液的制备和含量测定步骤，其特征在于：
a)所述供试品溶液的制备方法如下：
精密称取待测定的板蓝根药材或其制品，用去离子水进行回流提取或超声提取；过滤提取液，将所得滤液上样至固相萃取柱中，先用水冲洗，然后用甲醇洗脱，上样和洗脱过程均需控制流速≤1滴/秒；收集甲醇洗脱液，氮吹至干燥，残渣再用甲醇溶解，过滤，所得滤液即为供试品溶液；
b)所述含量测定采用高效液相-紫外-圆二色谱法，具体测定条件为：采用C18色谱柱，紫外检测器和圆二色检测器；流动相由A相与B相按体积比为10：90～15：85组成，其中A相为100％乙腈，B相是质量浓度为0.02％～0.03％的磷酸水溶液；流动相流速为0.5～1.0mL/分钟；紫外检测波长为230nm，圆二色检测波长为280nm；柱温为30℃；进样量为10μL；采集紫外色谱峰面积A和圆二色谱峰面积ΔA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的制作包括如下步骤：
①对照品溶液的制备
分别精密称定R-告依春对照品和S-告依春对照品适量，用甲醇配制成浓度为0.05～0.6mg/mL的R-告依春对照品溶液和浓度为0.05～0.6mg/mL的S-告依春对照品溶液；按比例混合R-告依春对照品溶液和S-告依春对照品溶液，配制成不同含量的系列对照品溶液；
②采用高效液相-紫外-圆二色谱法按步骤b)所述测试条件对步骤①配制的系列对照品溶液分别进行测定，并以R-告依春的质量百分含量为横坐标X，以圆二色谱峰面积ΔA与紫外色谱峰面积A的比值(g＝ΔA/A)为纵坐标Y，进行回归处理并绘制标准曲线。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含量测定包括如下步骤：
1)精密称定R,S-告依春对照品适量，用甲醇配制成浓度为0.05～0.6mg/mL的R,S-告依春对照品溶液；
2)采用高效液相色谱柱-紫外检测器测定供试品，采集供试品的紫外色谱峰面积A，并以外标法计算供试品中R,S-告依春的质量含量；
3)采用高效液相色谱柱-圆二色检测器测定供试品，采集供试品的圆二色谱峰面积ΔA，由计算的g＝ΔA/A值和标准曲线，得到供试品中R-告依春的质量百分含量；
4)由得到的R,S-告依春的质量含量和R-告依春的质量百分含量，计算得到R-告依春的质量含量，进而计算得到S-告依春的质量含量，从而实现对供试品中R-告依春和S-告依春这对对映异构体含量的分别测定。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述板蓝根制品包括板蓝根饮片和板蓝根制剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述的回流提取的时间为30～90分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述的超声提取的时间为10～30分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中对收集的甲醇洗脱液进行氮吹干燥的温度为30～60℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b)中所述的流动相是由100％乙腈与质量浓度为0.02％的磷酸水溶液按体积比为10：90组成。
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