CN110988234B - 一种灯盏花药材的质量控制方法 - Google Patents

一种灯盏花药材的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药材质量控制技术领域，特别涉及一种灯盏花药材的质量控制方法。该方法包括：将灯盏花药材供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法进行检测，高效液相色谱法的条件为：C18色谱柱，以磷酸水溶液‑乙腈为流动相进行梯度洗脱，根据获得的供试品溶液色谱图，用中位数法生成灯盏花药材的对照指纹图谱，计算各共有峰的相似度。本发明检测灯盏花药材指纹图谱以及同时测定绿原酸、灯盏花乙素、3,5‑二咖啡酰奎宁酸、4,5‑二咖啡酰奎宁酸4个指标成分的含量。该质量控制方法具有设备要求低、操作简便、分离度高、稳定性和重现性好，既可用作灯盏花药材指纹图谱的检测方法，又可用于同时测定药材中灯盏花乙素等四个成分的含量检测。

Description

一种灯盏花药材的质量控制方法
技术领域
本发明涉及中药材质量控制技术领域，特别涉及一种灯盏花药材的质量控制方法。
背景技术
灯盏花又名灯盏细辛，为菊科植物短葶飞蓬[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz.]的干燥全草，其味辛、微苦，性温；归心、肝经，具有活血通络止痛，祛风散寒的功效。灯盏花含有黄酮类、咖啡酰类、香豆素类、木脂素类、萜类等多类化学成分，其中黄酮类和咖啡酰类是灯盏花的特征成分。
目前，《中国药典》2015版灯盏花药材质量标准中，尚未规定指纹图谱检测方法，所用流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液(40:60)恒梯度，该方法分离效果不理想，无法有效分离灯盏花药材中各个成分，且只对灯盏花乙素(又称野黄芩苷)单一成分的含量进行测定，不利于药材质量全面控制。
申请号为201811608899.X的专利公开了一种灯盏花药材质量检测方法：供试品前处理采用乙醇对灯盏花药材进行提取，以乙腈：四氢呋喃：0.1-0.2％磷酸＝7:14:79为流动相，恒梯度洗脱，该方法分离效果不佳，仅可用于测定灯盏花乙素单一成分的含量，无法用于灯盏花药材指纹图谱检查，亦无法同时测定绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸4个指标成分的含量。
申请号为200910102818.3的专利公开了采用超高压液相色谱(UPLC-PDA)发同时测定灯盏花药材中飞蓬苷、绿原酸、灯盏花苷、野黄芩苷、3,4,-O-二咖啡酰基奎宁酸，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、灯盏花甲素、4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量。该方法具有检测快速、准确等特点，但是存在设备和色谱柱技术要求高，普通高压液相色谱仪和普通分析性色谱柱无法满足检测条件等不足，在方法可及性和普及型方面受到局限。
通过文献检索，有报道采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)-四氢呋喃(C)为流动相，梯度洗脱(0～10min，10％～12％B，1％C；10～15min，12～20％B，1％～1.5％C；15～27min，20％B，1.5％～2.0％C；27～37min，20％～22％B，2.0％C；37～50min，22％～58％B，2.0％～0％C；50～60min，58％～78％B，0％C)，进样量10μl，柱温30℃，流速0.8mL/min，检测波长330nm。以上述色谱条件对灯盏花药材中的绿原酸、咖啡酸、洋蓟素、灯盏花乙素、异绿原酸B、灯盏花甲素、异绿原酸A、异绿原酸C八种成分进行含量测定，从色谱图中可以看出该方法有以下不足：1.基线不平稳，这会导致在计算八种成分含量时计算不准确，无法得出真实值；2.分离效果不佳，最明显的是灯盏花乙素与之后的峰的分离度较小；3.流动相配制颇为复杂。
谢兴亮等人以KromasilC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱为固定相，甲醇(A)－乙腈(B)－0.1％三氟乙酸(C)为流动相，梯度洗脱(0～30min，11％～13％A，11％～15％B；30～40min，0％A，11％B；40～50min，0％A，20％B；50～65min，20％～65％B，0％～10％C)，流速为1mL·min－1，柱温为35℃，检测波长335nm建立灯盏花药材的指纹图谱。从色谱图可知，该方法可使灯盏花乙素得到很好的分离，但是未能使灯盏花药材中其他成分达到基线分离，仅可用于灯盏花乙素的含量测定，不具有通用性。
有文献采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇(A)－0.3％甲酸溶液(B)，梯度洗脱(0～20min，A为35％→45％；20～50min，A为45％→75％)；流速为0.6mL·min－1；柱温为35℃；检测波长为335nm，建立灯盏细辛破壁饮片的指纹图谱。该方法分离效果不佳。
亦有文献采用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈(A)-0.3％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～10min，12％～15％A，10～32min，15％A，32～33min，15％～20％A，33～50min，20％～22％A)，流速1mL·min－1，检测波长335nm与327nm，柱温30℃。供试品溶液前处理采用70％甲醇测定灯盏花药材中不同部位绿原酸、灯盏花乙素、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸含量，混合对照品采用甲醇溶解。从色谱图中可知，该色谱图中灯盏花乙素和4，5-二咖啡酰奎宁酸峰与其他相邻峰未达到有效分离，影响指标成分定量的准确性，药材采用70％甲醇提取回收率偏低，混合对照品采用甲醇溶解，对照品峰旁边会产生馒头峰，影响分离度。无法用此方法建立灯盏花药材的指纹图谱。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种灯盏花药材的质量控制方法。该质量控制方法具有操作简便、分离度高、稳定性和重现性好，既可用作灯盏花药材指纹图谱的检测方法，又可用于同时测定药材中灯盏花乙素等四个成分的含量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种灯盏花药材的质量控制方法，包括以下步骤：
将灯盏花药材供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法进行检测，高效液相色谱法的条件为：C18色谱柱，以0.1vt％～0.4vt％磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0002246467100000031
根据获得的供试品溶液色谱图，用中位数法生成灯盏花药材的对照指纹图谱，计算各共有峰的相似度，以相似度≥0.98为检验质控标准。
作为优选，供试品溶液的制备方法为：将灯盏花药材粉末与30vt％～60vt％甲醇水溶液混合，超声提取，微孔滤膜滤过，取续滤液。
作为优选，甲醇水溶液的浓度为50vt％。
作为优选，超声提取的时间为20～50min。
优选地，超声提取的时间为30min。
作为优选，对照品溶液的制备方法为：取绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸，用40vt％～100vt％甲醇水溶液或甲醇溶解，制成分别含绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸0.05～1mg/mL的混合对照品溶液。
在本发明提供的实施例中，对照品溶液为每1ml含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
作为优选，C18色谱柱为Kinetex XB-C18、Welch Ultimate XB-C18、WatersSymmetry C18、Agilent Zorbax SB-C18、Phenomenex Luna C18、Alltima C18中的一种。
优选地，C18色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱、WelchUltimate XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱、Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱中的一种。
作为优选，磷酸水溶液的浓度为0.1vt％～0.2vt％，梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0002246467100000041
在本发明提供的一具体实施例中，梯度洗脱程序如下：
t(min) 0.1％磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0-10 91-86 9-14
10-30 86-85 14-15
30-50 85-73 15-27
50-51 73-45 27-55
51-60 45-25 55-75
在本发明提供的另一具体实施例中，梯度洗脱程序如下：
t(min) 0.2％磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0-10 91-86 9-14
10-30 86 14
30-30.1 86-85 14-15
30.1-50 85-73 15-27
50-51 73-45 27-55
51-60 45-25 55-75
在本发明提供的另一具体实施例中，梯度洗脱程序如下：
t(min) 0.1％磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0-10 90-85 10-15
10-30 85-84 15-16
30-50 84-72 16-28
50-51 72-45 28-55
51-60 45-25 55-75
作为优选，高效液相色谱法的柱温为30～40℃。
优选地，高效液相色谱法的柱温为35℃。
作为优选，高效液相色谱法的检测波长为320～350nm。
优选地，高效液相色谱法的检测波长为330～335nm。
作为优选，高效液相色谱法的流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，高效液相色谱法的流速为0.9～1.0mL/min。
本发明提供了一种灯盏花药材的质量控制方法，该方法包括以下步骤：将灯盏花药材供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法进行检测，高效液相色谱法的条件为：C18色谱柱，以0.1vt％～0.4vt％磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，根据获得的供试品溶液色谱图，用中位数法生成灯盏花药材的对照指纹图谱，计算各共有峰的相似度，以相似度≥0.98为检验质控标准。本发明具有如下技术效果：
本发明采用乙腈(A)-磷酸水溶液(B)为流动相，C18(4.6mm×250mm，5μm)为固定相，甲醇水溶液为溶解溶剂，检测灯盏花药材指纹图谱以及同时测定绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸4个指标成分的含量。该质量控制方法有效克服了现有技术中分离度差、重现性差，无法同时测定4个指标成分等的不足。具有操作简便、分离度高、稳定性和重现性好，既可用作灯盏花药材指纹图谱的检测方法，又可用于同时测定药材中灯盏花乙素等四个成分的含量检测。
本发明得到的灯盏花药材指纹图谱中共有20个共有峰，依据相似度数值，应用于灯盏花药材的质量控制。20个共有峰中2号峰为绿原酸，保留时间为9.0-11min，10号峰为灯盏花乙素保留时间为30-32min，13号峰为3,5-二咖啡酰奎宁酸保留时间为42-44min，15号峰为4,5-二咖啡酰奎宁酸保留时间为44.5-46.5min。
附图说明
图1示对照指纹图谱；
图2示指纹图谱共有模式；
图3示混合对照品溶液色谱图；
图4示供试品溶液色谱图；
图5示灯盏花药材不同部位色谱图；
图6示泸西基地灯盏花药材色谱图；
图7示南涧基地灯盏花药材色谱图；
图8示宣威基地灯盏花药材色谱图；
图9示对比例1中供试品溶液色谱图；
图10示对比例2中供试品溶液色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种灯盏花药材的质量控制方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明解决的技术问题在于，提供一种灯盏花药材的质量控制方法，通过该质量控制方法，可建立灯盏花药材的指纹图谱且可同时测定灯盏花药材中灯盏花乙素等四个成分的含量，对所述的灯盏花药材质量进行全面、客观、准确的评价，对灯盏花药材的质量控制具有重要意义。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种灯盏花药材的质量控制方法，包括：
(1)供试品溶液的制备
精密称取灯盏花药材粉末(过四号筛)，置锥形瓶中，加入30％-60％甲醇，称重，超声提取20-50min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得灯盏花药材供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备
分别精密称取绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸适量，置于同一容量瓶中，加40％-100％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。
(3)HPLC检测
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.1％-0.4％磷酸水-乙腈为流动相梯度洗脱，梯度洗脱程序如下；柱温：30-40℃；检测波长：320-350nm；流速：0.8-1.2mL/min。
Figure BDA0002246467100000071
(4)将(3)获得的供试品溶液色谱图导出，并导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，选择不同生长期灯盏花药材的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，用中位数法生成灯盏花药材的对照指纹图谱，计算各共有峰的相似度，并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，供试品溶液的制备：称取灯盏花药材粉末(过四号筛)0.1-0.3g，置锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，称重，超声30min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得灯盏花药材供试品溶液。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，各取1mL于同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸52.0μg、灯盏花乙素107.3μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸104.2μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸100.5μg的混合对照溶液。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，所述流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈梯度洗脱，梯度洗脱优选如下：
Figure BDA0002246467100000081
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，所述柱温为30-40℃。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，所述检测波长为320-335nm。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，所述流速为0.8-1.2mL/min。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，得到的灯盏花药材指纹图谱中共有20个共有峰，依据相似度数值，应用于灯盏花药材的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.98为检验质控标准。
优选地，以上所述的灯盏花药材质量控制方法，20个共有峰中2号峰为绿原酸，保留时间为9.0-11min，10号峰为灯盏花乙素保留时间为30-32min，13号峰为3,5-二咖啡酰奎宁酸保留时间为42-44min，15号峰为4,5-二咖啡酰奎宁酸保留时间为44.5-46.5min。
本发明提供的灯盏花药材的质量控制方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1不同浓度甲醇提取灯盏花药材
1仪器与试药
Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司，G1379A真空脱气机、G1311A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A紫外检测器)；BS210S型万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司，编号：12336597)；SK40-180小型超声波清洗机(张家港市神科超声电子有限公司)。
野黄芩苷(中国食品药品检定研究院，纯度≥91.7％，批号：110842-201709)；绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度≥96.8％，批号：110753-201817)；3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(中国食品药品检定研究院，纯度≥94.3％，批号：111782-201807)；4,5-O-二咖啡酰奎宁酸(中国食品药品检定研究院，纯度≥94.1％，批号：111894-201102)；乙腈为色谱纯；水为纯化水；其余试剂均为分析纯。
灯盏花药材共12批，采集于云南省宣威市热水镇灯盏花药材GMP种植基地，均为地上部分，收集信息见表1。
表1不同生长期灯盏花药材收集信息
样品序号 批号 采收时间
S1 DZH-20190419 2019.04.19
S2 DZH-20190429 2019.04.29
S3 DZH-20190509 2019.05.09
S4 DZH-20190519 2019.05.19
S5 DZH-20190529 2019.05.29
S6 DZH-20190609 2019.06.09
S7 DZH-20190619 2019.06.19
S8 DZH-20190629 2019.06.29
S9 DZH-20190709 2019.07.09
S10 DZH-20190719 2019.07.19
S11 DZH-20190729 2019.07.29
S12 DZH-20190809 2019.08.09
2不同浓度甲醇提取灯盏花药材四个指标成分含量测定
(1)供试品溶液的制备
精密称取灯盏花药材(S12)适量于锥形瓶中，分别使用30％-100％不同浓度的甲醇溶液10mL为提取溶剂，超声30min，放冷，取续滤液，即得供试品溶液。
(2)混合对照品溶液的制备
精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸加50％甲醇溶解并定容至刻度，灯盏花乙素加甲醇溶解并定容至刻度，各取适量于同一容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
(3)不同浓度甲醇提取灯盏花药材含量测定
将按上述方法制备的供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件：以AgilentZorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱为固定相，以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱见表2，流速1mL·min-1，检测波长335nm，柱温35℃，进样量10μL。
表2梯度洗脱表
t(min) 0.1％磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0-10 91-86 9-14
10-30 86-85 14-15
30-50 85-73 15-27
50-51 73-45 27-55
51-60 45-25 55-75
含量测定结果见下表3：
表3不同浓度甲醇提取含量测定结果
Figure BDA0002246467100000101
Figure BDA0002246467100000111
结论：随着甲醇浓度的升高，四个指标成分的提取量均下降，且当甲醇浓度超过60％时，色谱图中指标成分峰旁有馒头峰，影响峰分离度。
实施例2灯盏花药材指纹图谱的建立
(1)供试品溶液的制备
分别称取上述12批灯盏花药材粉末(过四号筛)0.25g，置锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，称重，超声30min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得灯盏花药材供试品溶液。
(2)混合对照品溶液的制备
精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸加50％甲醇溶解并定容至刻度，灯盏花乙素加甲醇溶解并定容至刻度，各取适量于同一容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
(3)灯盏花药材指纹图谱的建立
将按上述方法制备的供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件：以AgilentZorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱为固定相，以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱见表2，流速1mL·min-1，检测波长335nm，柱温35℃，进样量10μL。
将所得图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件，以S12号图谱为参考，中位数法建立对照指纹图谱(见图1)，时间窗宽度设为0.1min，采用多点校正Mark峰匹配，建立各自指纹图谱并生成指纹图谱共有模式，标定了20个共有峰(见图2)。十二批灯盏花药材相似度均大于0.98，结果见表4。
表4十二批药材相似度评价结果
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12
相似度 0.982 0.998 0.999 1 0.999 0.998 0.997 0.997 0.998 0.998 0.998 0.998
实施例3不同批次灯盏花药材含量测定
1.供试品溶液的制备
分别称取上述12批灯盏花药材粉末(过四号筛)0.25g，置锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，称重，超声30min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得灯盏花药材供试品溶液。
2.混合对照品溶液的制备
精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸加50％甲醇溶解并定容至刻度，灯盏花乙素加甲醇溶解并定容至刻度，各取适量于同一容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
3.色谱条件
以Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱为固定相，以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱见表2，流速1mL·min-1，检测波长335nm，柱温35℃，进样量10μL。
取上述供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图(混合对照品溶液色谱图见图3，供试品溶液色谱图见图4)，使用外标法分别计算灯盏花药材中绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸四个成分的含量，含量测定结果见表5。
表5十二批灯盏花药材含量测定结果
Figure BDA0002246467100000121
Figure BDA0002246467100000131
实施例4不同部位灯盏花药材的含量测定
1.供试品溶液的制备
分别称取灯盏花药材(S12)根、茎、叶、花粉末(过四号筛)0.25g，置锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，称重，超声30min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得不同部位供试品溶液。
2.混合对照品溶液的制备
精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸加50％甲醇溶解并定容至刻度，灯盏花乙素加甲醇溶解并定容至刻度，各取适量于同一容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
3.色谱条件
以Welch Ultimate XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱为固定相，以乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱见表6，流速1mL·min-1，检测波长330nm，柱温35℃，进样量10μL。
表6梯度洗脱表
t(min) 0.2％磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0-10 91-86 9-14
10-30 86 14
30-30.1 86-85 14-15
30.1-50 85-73 15-27
50-51 73-45 27-55
51-60 45-25 55-75
取上述供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图(混供试品溶液色谱图见图5)，使用外标法分别计算灯盏花药材不同部位中绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸四个成分的含量，含量测定结果见表7。
表7灯盏花药材(S12)不同部位4个指标成分含量
Figure BDA0002246467100000141
实施例5不同产地灯盏花药材的含量测定
1.供试品溶液的制备
分别称取不同产地的灯盏花药材粉末(过四号筛)0.25g，置锥形瓶中，精密加50％甲醇25mL，称重，超声30min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得不同部位供试品溶液。
2.混合对照品溶液的制备
精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸加50％甲醇溶解并定容至刻度，灯盏花乙素加甲醇溶解并定容至刻度，各取适量于同一容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
3.色谱条件
以Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱为固定相，以乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱见表8，流速0.9mL·min-1，检测波长330nm，柱温35℃，进样量10μL。
表8梯度洗脱表
t(min) 0.1％磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0-10 90-85 10-15
10-30 85-84 15-16
30-50 84-72 16-28
50-51 72-45 28-55
51-60 45-25 55-75
取上述供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图(混供试品溶液色谱图见图6～8)，使用外标法分别计算不同产地灯盏花药材中绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸四个成分的含量，含量测定结果见下表。
表9不同产地灯盏花药材指标成分含量测定结果
Figure BDA0002246467100000151
对比例1不同色谱条件的考察
1.供试品溶液的制备
取灯盏花粉末0.25g，加甲醇20mL，称重，超声30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.混合对照品溶液的制备
精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸加50％甲醇溶解并定容至刻度，灯盏花乙素加甲醇溶解并定容至刻度，各取适量于同一容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
3.色谱条件
以Ultimate XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱为固定相，以甲醇(A)-0.2％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱见表10，流速1.0mL·min-1，检测波长335nm，柱温40℃，进样量10μL。
表10梯度洗脱表
t(min) 0.2％磷酸水溶液(％) 甲醇(％)
0-12 88-68 12-32
12-40 68 32
40-50 68-60 32-40
50-60 60-12 40-88
取上述供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图(供试品溶液色谱图见图9)，分离效果不佳。
对比例2不同色谱条件的考察
1.供试品溶液的制备
取灯盏花粉末0.25g，加甲醇20mL，称重，超声30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.混合对照品溶液的制备
精密称取绿原酸5.20mg、灯盏花乙素10.03mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸10.42mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸10.05mg分别于10mL容量瓶中，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸加50％甲醇溶解并定容至刻度，灯盏花乙素加甲醇溶解并定容至刻度，各取适量于同一容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，配制成每1mL含绿原酸60.4μg、灯盏花乙素98.294μg、3,5-二咖啡酰奎宁酸88.43μg、4,5-二咖啡酰奎宁酸85.11μg的混合对照溶液。
3.色谱条件
以Welch Materials XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱为固定相，以乙腈(A)-0.3％磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱见表11，流速1.0mL·min-1，检测波长335nm，柱温35℃，进样量10μL。
表11梯度洗脱表
t(min) 0.2％磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0-10 90-80 10-20
10-30 80-67 20-33
30-50 67-40 33-60
50-60 40-90 60-10
取上述供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图(供试品溶液色谱图见图10)，分离效果不佳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种灯盏花药材的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
将灯盏花药材供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法进行检测，所述高效液相色谱法的条件为：C18色谱柱，以0.1vt%~0.2vt%磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
t（min） 磷酸水溶液（%） 乙腈（%） 0-10 (90~91)-(85~86) (9~10)-(14~15) 10-30 (85~86)-(84~86) (14~15)-(14~16) 30-50 (84~86)-(72~73) (14~16)-(27~28) 50-51 (72~73)-45 (27~28)-55 51-60 45-25 55-75
根据获得的供试品溶液色谱图，用中位数法生成灯盏花药材的对照指纹图谱，计算各共有峰的相似度，以相似度≥0.98为检验质控标准；
所述供试品溶液的制备方法为：将灯盏花药材粉末与30vt%~60vt%甲醇水溶液混合，超声提取，微孔滤膜滤过，取续滤液；
所述对照品溶液的制备方法为：取绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸，用40vt%~100vt%甲醇水溶液溶解，制成分别含绿原酸、灯盏花乙素、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸0.05~1mg/mL的混合对照品溶液。
2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法中，所述甲醇水溶液的浓度为50vt%。
3.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述超声提取的时间为20~50min。
4.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Kinetex XB-C18、Welch Ultimate XB-C18、Waters Symmetry C18、Agilent Zorbax SB-C18、Phenomenex Luna C18、Alltima C18中的一种。
5.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为30~40℃。
6.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测波长为320~350nm。
7.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流速为0.8~1.2mL/min。
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