CN107589191A - 金贝口服液hplc 指纹图谱建立和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了金贝口服液HPLC指纹图谱建立和检测方法。根据金贝口服液中所含组分的理化性质，结合君臣佐使，结合《中国药典》2015年版对各味药材定量测定的要求，最终以金银花、黄芩、丹参的主要成分绿原酸、黄芩苷、丹酚酸B为指标性成分，建立HPLC法同时测定3种活性成分的方法，并进行了金贝口服液指纹图谱研究，为金贝口服液质量控制提供参考和依据。
Description
技术领域
本发明涉及药品检测技术领域，特别是涉及金贝口服液HPLC指纹图谱建立和检测方法。
背景技术
金贝口服液是由黄芪、党参、北沙参、丹参、当归、川芎、金银花、连翘、黄芩、川贝母、清半夏、甘草12味药材组成的中药复方制剂，主要用于治疗间质性肺疾病所致之气短、呼吸困难、干咳少痰、胸闷胸痛、紫绀或低热等症，其处方已经有200多例临床验证，疗效确切。
金贝口服液药味多、化学成分复杂，现有的质量标准难以有效控制药品的内在质量。
发明内容
本发明根据金贝口服液中所含组分的理化性质，结合君臣佐使，经过反复实验验证，结合《中国药典》2015年版对各味药材定量测定的要求，最终以金银花、黄芩、丹参的主要成分绿原酸、黄芩苷、丹酚酸B为指标性成分，建立HPLC法同时测定3种活性成分的方法，并进行了金贝口服液指纹图谱研究，为金贝口服液质量控制提供参考和依据，提供金贝口服液HPLC指纹图谱建立和检测方法。
本发明的金贝口服液HPLC指纹图谱建立和检测方法技术方案为，一种金贝口服液HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备，所述供试品为金贝口服液；
(2)对照品溶液制备，用甲醇配制含绿原酸、黄芩苷、丹酚酸B的混合对照品溶液；
(3)将步骤(1)中的供试品溶液与步骤(2)中的混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；
(4)将供试品指纹图谱与对照品参照物峰进行比对确定供试品指纹图谱中呈现16个特征峰，其中1，2，3，4，6，7，8，9，13号峰为金银花提供；10，15号峰为黄芩提供；16号峰为丹参提供；与混合对照品图谱对照，4号峰为绿原酸，15号峰为黄芩苷，16号峰为丹酚酸B。
步骤(1)具体为：精密量取金贝口服液20ml，置于具塞锥形瓶中，精密加入60ml甲醇，称定重量，于水浴超声(100w，40kHz)处理30min，放冷，75％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
步骤(2)具体为：精密称取各对照品适量，分别用甲醇配制成含绿原酸1.187mg/ml、黄芩苷0.63mg/ml、丹酚酸B1.1215mg/ml的对照品贮备液；精密量取各对照品贮备液1.0ml，置于同一10ml容量瓶中，混匀，用甲醇定容；得到含绿原酸118.7μg/ml、黄芩苷63μg/ml、丹酚酸B121.5μg/ml的混合对照品溶液。
步骤(3)色谱条件为：采用Inertsil ODS-3 C18色谱柱4.6mm*250mm，5μm；柱温35℃；流动相乙腈-0.1％磷酸溶液，梯度洗脱；体积流量1ml/min；检测波长254nm；分析时间65min；进样量10μl。
梯度洗脱条件具体为：
0-5min时，乙腈体积分数为6％-10％，0.1％磷酸体积分数为90-94％；5-25min时，乙腈体积分数为由6％-10％变化为12-18％，0.1％磷酸体积分数为由90-94％变化为83-87％；
25-30min时，乙腈体积分数为由12-18％变化为19-21％，0.1％磷酸体积分数为由83-87％变化为88-91％；
30-40min时，乙腈体积分数为20％，0.1％磷酸体积分数为80％；
40-45min时，乙腈体积分数为由20％变化为25％，0.1％磷酸体积分数为由80％变化为75％；
45-50min时，乙腈体积分数为25％，0.1％磷酸体积分数为75％；
50-60min时，乙腈体积分数为由25％变化为8％，0.1％磷酸体积分数为由75％变化为92％；
60-65min时，乙腈体积分数为6％-10％，0.1％磷酸体积分数为90-94％。
优选的，梯度洗脱条件具体为：
0-5min时，乙腈体积分数为6％-10％，0.1％磷酸体积分数为90-94％；
5-25min时，乙腈体积分数为由6％-10％变化为12-18％，0.1％磷酸体积分数为由90-94％变化为83-87％；
25-30min时，乙腈体积分数为由12-18％变化为19-21％，0.1％磷酸体积分数为由83-87％变化为88-91％；
30-40min时，乙腈体积分数为20％，0.1％磷酸体积分数为80％；
40-45min时，乙腈体积分数为由20％变化为25％，0.1％磷酸体积分数为由80％变化为75％；
45-50min时，乙腈体积分数为25％，0.1％磷酸体积分数为75％；
50-60min时，乙腈体积分数为由25％变化为8％，0.1％磷酸体积分数为由75％变化为92％；
60-65min时，乙腈体积分数为6％-10％，0.1％磷酸体积分数为90-94％。
一种金贝口服液检测方法，将待测金贝口服液的HPLC指纹图谱与权利要求1建立的金贝口服液HPLC指纹图谱进行比较，与金贝口服液HPLC指纹图谱中的16个特征峰相对应。
本发明的有益效果为：本发明根据金贝口服液的特点，加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制。采用指纹图谱方法进行整体质量评价。
附图说明：
图1所示为金银花、黄芩、丹参阴性制剂及供试品、混合对照、空白溶剂对比图，其中1-供试品，2-空白溶剂，3-混合对照，4-丹参阴性，5-黄芩阴性，6-金银花阴性；
图2所示为金贝口服液10批样品指纹图谱，图谱中由下到上依次为S1-S10号样品；
图3所示为实施例1中2.5.1所述的典型色谱图；
图4所示为混合对照和金贝口服液供试品溶液色谱图，其中，A-绿原酸，B-黄芩苷，C-丹酚酸B；
图5所示为金贝口服液供试品溶液色谱图(254nm甲醇-0.1％磷酸)；
图6所示为金贝口服液供试品溶液色谱图(254nm乙腈-0.1％磷酸)；
图7所示为金贝口服液供试品溶液色谱图(280nm)；
图8所示为金贝口服液供试品溶液色谱图(300nm)。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
1.仪器与试药
1.1仪器 Acchrom S6000高效液相色谱仪；十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器。
1.2试药 绿原酸(批号110753-201716)、黄芩苷(批号110715-201619)、丹酚酸B(批号111562-201313)对照品均购自中国食品药品检验研究院。
金贝口服液由山东宏济堂制药集团研发，批号1706001-1706003、1707001-1707003、1708001-1708004。
甲醇为色谱纯和分析纯；乙腈为色谱纯；磷酸为色谱纯；水为超纯水。
2.方法与结果
2.1.色谱条件
Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6mm*250mm，5μm)；柱温35℃；流动相乙腈-0.1％磷酸，梯度洗脱(程序见表1-1、表1-2、表1-3、表1-4)；体积流量1ml/min；检测波长254nm；分析时间65min；进样量10μl。
表1-1 流动相梯度洗脱条件1
表1-2 流动相梯度洗脱条件2
表1-3 流动相梯度洗脱条件3
表1-4 梯度条件1-3各共有峰保留时间
梯度洗脱条件1到条件3均能建立指纹图谱方法，梯度洗脱条件2方法最优。
2.2.供试品溶液制备
精密量取金贝口服液20ml，置于具塞锥形瓶中，精密加入60ml甲醇，称定重量，于水浴超声(100w，40kHz)处理30min，放冷，75％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.3.对照品溶液制备
精密称取各对照品适量，甲醇分别配制成含绿原酸1.187mg/ml、黄芩苷0.63mg/ml、丹酚酸B1.1215mg/ml的对照品贮备液。精密量取各对照品贮备液1.0ml，置于同一10ml容量瓶中，混匀，用甲醇定容至刻度，即得含绿原酸118.7μg/ml、黄芩苷63μg/ml、丹酚酸B121.5μg/ml的混合对照品溶液。
2.4.方法学考察
2.4.1.精密度试验
精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下方法进样测定。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％(数据见表2、表3)，表明本方法精密度良好。
表2 金贝口服液HPLC指纹图谱精密度共有峰的相对保留时间
注：本发明部分表格由于项目过多，横向超出文本规定格式，因此纵向放置。
表3 金贝口服液HPLC指纹图谱精密度共有峰的相对峰面积
2.4.2.重复性试验
取金贝口服液样品6份，按2.2项下制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进样测定。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％(数据见表4、表5)，表明本方法重复性良好。
表4 金贝口服液HPLC指纹图谱重复性共有峰的相对保留时间
表5 金贝口服液HPLC指纹图谱重复性共有峰的相对峰面积
2.4.3.稳定性试验
稳定性试验取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、18、24h，按“2.1”项下方法进样测定。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％(数据见表6、表7)，表明供试品溶液24h内稳定。
表6 金贝口服液HPLC指纹图谱稳定性共有峰的相对保留时间
表7 金贝口服液HPLC指纹图谱稳定性共有峰的相对峰面积
2.4.4.专属性试验
分别制备金银花、黄芩、丹参缺味制剂，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”条件进行测定分析。空白溶剂(75％甲醇)、金银花、黄芩、丹参阴性制剂均无干扰，结果见说明书附图图1金银花、黄芩、丹参阴性制剂及供试品、混合对照、空白溶剂对比图。
2.5.指纹图谱的建立
2.5.1.共有峰标定
指纹图谱及共有峰的标定取自10批次金贝口服液样品，按“2.2”方法制备供试品溶液，照“2.1”条件进行测定分析。将10批样品的指纹图谱依次导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)》，生成指纹图谱共有模式，结果见图2金贝口服液10批样品指纹图谱。将化学信息较多的S1号样品(即图2中最下方的图谱)设为典型色谱图，标定共有峰16个，结果见图3。在各批次样品图谱中15号峰的色谱峰分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定15号峰为参比峰，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表8、表9。
表8
表9
相似度评价：采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》对10批金贝口服液样品的HPLC指纹图谱进行相似度评价，S1～S10金贝口服液样品相似度评价结果见表10，分析结果显示10批金贝口服液样品相似度均在0.950以上，表明10批样品具有较高的相似度。相比于单个主成分含量测定而言，指纹图谱能从整体层面综合反映中药复方制剂的质量，该方法可为金贝口服液的质量评价及控制提供依据，有助于课题组后续开展谱效关系研究。
表1010 批金贝口服液样品的相似度结果
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 对照 | |
| S1 | 1 | ||||||||||
| S2 | 0.958 | 1 | |||||||||
| S3 | 0.947 | 0.98 | 1 | ||||||||
| S4 | 0.945 | 0.98 | 0.999 | 1 | |||||||
| S5 | 0.928 | 0.928 | 0.956 | 0.955 | 1 | ||||||
| S6 | 0.927 | 0.928 | 0.955 | 0.954 | 0.999 | 1 | |||||
| S7 | 0.879 | 0.879 | 0.926 | 0.926 | 0.939 | 0.939 | 1 | ||||
| S8 | 0.885 | 0.884 | 0.93 | 0.931 | 0.943 | 0.943 | 0.998 | 1 | |||
| S9 | 0.898 | 0.898 | 0.944 | 0.944 | 0.956 | 0.956 | 0.961 | 0.967 | 1 | ||
| S10 | 0.963 | 0.998 | 0.982 | 0.983 | 0.937 | 0.936 | 0.888 | 0.894 | 0.907 | 1 | |
| 对照 | 0.956 | 0.967 | 0.988 | 0.988 | 0.982 | 0.981 | 0.961 | 0.965 | 0.971 | 0.973 | 1 |
2.5.2.金贝口服液与药材相关性
取金银花、黄芩及丹参各缺味阴性制剂、及金银花、黄芩及丹参单味药材样品、金贝口服液检测可发现金贝口服液指纹图谱中的16个共有特征峰在金银花、黄芩、丹参3味药材中的归属，其中1，2，3，4，6，7，8，9，13号峰为金银花提供；10，15号峰为黄芩提供；16号峰为丹参提供；与混合对照品图谱对照，经鉴定4号峰为绿原酸，15号峰为黄芩苷，16号峰为丹酚酸B。
2.5.3.样品含有量测定
取10批金贝口服液样品，按“2.2”方法制备供试品溶液，照“2.1”条件进行供试品溶液和混合对照品溶液测定并记录色谱图，见图4，分析计算绿原酸、黄芩苷、丹酚酸B含量测定结果，结果见表11。
表11 样品含有量测定结果(μg/ml)
3.讨论与结论
3.1.流动相选择
以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1％磷酸溶液分别作为流动相进行了梯度洗脱，结果显示，以乙腈-0.1％磷酸作为流动相进行梯度洗脱所得色谱峰的基线平稳、分离度良好并且峰形对称，故选择乙腈-0.1％磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱。请见说明书附图图5和图6。
3.2.提取溶剂选择
供试品溶液制备时，对提取溶剂(20％、50％、75％甲醇和20％、50％、75％乙醇)进行了研究，通过考察分离度、色谱峰形、出峰数目及各主要共有峰面积大小，最终确定了以75％甲醇超声30min作为供试品溶液的制备方法，具体结果见表12。
表12 不同提取溶剂条件下绿原酸和黄芩苷含量测定结果
3.3.检测波长选择
中药成分复杂，绿原酸、黄芩苷、丹酚酸B3种成分分别在不同波长下有最大吸收。研究了254nm、280nm、300nm波长，结果发现254nm波长检测时，色谱峰分离较完整，峰较多，故选用254nm作为最终检测波长。具体请见说明书附图6-8。
Claims (7)
1.一种金贝口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备，所述供试品为金贝口服液，金贝口服液是由黄芪、党参、北沙参、丹参、当归、川芎、金银花、连翘、黄芩、川贝母、清半夏、甘草12味药材组成的中药复方制剂；
(2)对照品溶液制备，用甲醇配制含绿原酸、黄芩苷、丹酚酸B的混合对照品溶液；
(3)将步骤(1)中的供试品溶液与步骤(2)中的混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；
(4)将供试品指纹图谱与对照品参照物峰进行比对确定供试品指纹图谱中呈现16个特征峰，其中1，2，3，4，6，7，8，9，13号峰为金银花提供；10，15号峰为黄芩提供；16号峰为丹参提供；与混合对照品图谱对照，4号峰为绿原酸，15号峰为黄芩苷，16号峰为丹酚酸B。
2.根据权利要求1所述的金贝口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(1)具体为：精密量取金贝口服液20ml，置于具塞锥形瓶中，精密加入60ml甲醇，称定重量，水浴超声(100w，40kHz)处理30min，放冷，75％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的金贝口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(2)具体为：精密称取各对照品适量，分别用甲醇配制成含绿原酸1.187mg/ml、黄芩苷0.63mg/ml、丹酚酸B1.1215mg/ml的对照品贮备液；精密量取各对照品贮备液1.0ml，置于同一10ml容量瓶中，混匀，用甲醇定容至刻度；即得含绿原酸118.7μg/ml、黄芩苷63μg/ml、丹酚酸B121.5μg/ml的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的金贝口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)色谱条件为：采用Inertsil ODS-3C18色谱柱4.6mm*250mm，5μm；柱温35℃；流动相乙腈-0.1％磷酸溶液，梯度洗脱；体积流量1ml/min；检测波长254nm；分析时间65min；进样量10μl。
5.根据权利要求4所述的金贝口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，梯度洗脱条件具体为：
0-5min时，乙腈体积分数为6％-10％，0.1％磷酸体积分数为90-94％；
5-25min时，乙腈体积分数为由6％-10％变化为12-18％，0.1％磷酸体积分数为由90-94％变化为83-87％；
25-30min时，乙腈体积分数为由12-18％变化为19-21％，0.1％磷酸体积分数为由83-87％变化为88-91％；
30-40min时，乙腈体积分数为20％，0.1％磷酸体积分数为80％；
40-45min时，乙腈体积分数为由20％变化为25％，0.1％磷酸体积分数为由80％变化为75％；
45-50min时，乙腈体积分数为25％，0.1％磷酸体积分数为75％；
50-60min时，乙腈体积分数为由25％变化为8％，0.1％磷酸体积分数为由75％变化为92％；
60-65min时，乙腈体积分数为6％-10％，0.1％磷酸体积分数为90-94％。
6.根据权利要求4所述的金贝口服液HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，梯度洗脱条件具体为：
0-5min时，乙腈体积分数为8％，0.1％磷酸体积分数为92％；
5-25min时，乙腈体积分数为由8％变化为15％，0.1％磷酸体积分数为由92％变化为85％；
25-30min时，乙腈体积分数为由15％变化为20％，0.1％磷酸体积分数为由85％变化为80％；
30-40min时，乙腈体积分数为20％，0.1％磷酸体积分数为80％；
40-45min时，乙腈体积分数为由20％变化为25％，0.1％磷酸体积分数为由80％变化为75％；
45-50min时，乙腈体积分数为25％，0.1％磷酸体积分数为75％；
50-60min时，乙腈体积分数为由25％变化为8％，0.1％磷酸体积分数为由75％变化为92％；
60-65min时，乙腈体积分数为8％，0.1％磷酸体积分数为92％。
7.一种金贝口服液检测方法，其特征在于，将待测金贝口服液的HPLC指纹图谱与权利要求1建立的金贝口服液HPLC指纹图谱进行比较，与金贝口服液HPLC指纹图谱中的16个特征峰相对应。
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