CN114636760A - 一种治疗肾脏疾病的中药组合物的指纹图谱建立方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗肾病的中药组合物的指纹图谱建立方法及其应用，所述方法采用高效液相色谱法进行测定，该指纹图谱建立方法可应用于治疗肾病的中药组合物的有效成分检测方法。本发明提供的方法较已公开报道的方法洗脱梯度变化较缓，针对特定成分保留时间调节相应洗脱梯度，并采用变波长采集，可以较好地识别和分离更多的共有峰。另外，本发明提供的方法识别了肾衰宁药物中生物碱类、蒽醌类、有机酸类、苷类、酚酸类等药效成分，更好的体现了药效成分群的表征，对控制治疗肾病的中药组合物，尤其是肾衰宁药物的质量和保证疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种治疗肾脏疾病的中药组合物，特别是肾衰宁药物的指纹图谱建立方法，还涉及所述指纹图谱建立方法在治疗肾脏疾病的中药组合物，特别是肾衰宁药物的有效成分检测方法中的应用。
背景技术
肾功能衰竭等肾脏疾病是临床常见重病，通常采用透析和肾移植来治疗，但医疗费用过高，一般家庭在经济上无法负担。透析治疗过程易引发并发症。肾移植手术后还普遍存在排斥反应。对此，患者及其家属普遍较难承受。应用传统中药，如肾衰宁等则能够有效避免上述情况发生，其能够有效缓解症状，减少患者痛苦。为保障以高质量的中药，例如肾衰宁对这些肾病进行治疗，并使其在临床上充分发挥功效，延缓疾病进展，提高患者生活质量，对此类中药的有效成分检测和质量控制至关重要。
肾衰宁是一种有效的治疗肾病的中药组合物，其原料包括丹参、大黄、太子参、黄连、牛膝、半夏、红花、茯苓、陈皮和甘草。对于肾衰宁药物的质量控制，山西德元堂药业申请的“肾衰宁颗粒的指纹图谱检测方法(申请号201510797254.5)”公开了一种肾衰宁颗粒剂的HPLC指纹图谱及其建立方法，该专利采用乙腈-甲酸-水系统，分析时间较短，体系极性变化较快，成分分离效果有限，尤其是大极性到中等极性成分的分离度较差，基线不平稳，药效成分，如生物碱类、蒽醌类、酚酸类成分未能得到很好的分离，不利于建立物质基础与药效之间的关系。此外，该专利未对共有峰的标定识别进行说明，未采用混合对照品，仅公开了分析方法的建立过程。秦皇岛山海关药业申请的“一种肾衰宁片有效成分的测定方法(申请号201610712681.3)”公开了一种肾衰宁片剂的HPLC指纹图谱及其建立方法，该专利建立完整的肾衰宁片指纹图谱，采用混合对照品和对照药材进行简单的峰归属，但该专利未识别化合物组分，其指纹图谱洗脱梯度变化较快，化合物峰分离度有限，中等极性成分“扎堆”，关键药效成分色谱峰及有效物质群色谱峰表征体现较弱。另有李钥等发表了“HPLC-DAD法同时测定肾衰宁胶囊中9种成分的含量”的文献，但该文献仅报道了一种HPLC一测多评的含量测定方法，并非建立指纹图谱的方法。所以，基于现有技术的不足之处，需要建立一种能够更好地进行质量控制的肾衰宁药物的指纹图谱检测方法，以解决肾衰宁药物，尤其是肾衰宁胶囊没有前瞻性的全面检测有效成分的方法的问题。
发明内容
为了解决上述问题，一方面，本发明提供了一种治疗肾病的中药组合物的指纹图谱建立方法，其可以用于全面检测治疗肾病的中药组合物，例如肾衰宁药物中的有效成分。
本发明提供的治疗肾病的中药组合物的指纹图谱建立方法采用高效液相色谱法，所述高效液相色谱法的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以20mmol/L乙酸铵水溶液为流动相B，按照0至160分钟内流动相A与流动相B的体积比从3：97变化至100：0的梯度进行洗脱；检测波长在0至100min内为274nm，在100至160min内为262nm；
其中，所述治疗肾病的中药组合物由以下重量份数的原料制成：太子参20-30份，半夏20-30份，茯苓16-24份，丹参56-84份，红花8-12份，黄连8-12份，陈皮8-12份，大黄32-48份，牛膝16-24份和甘草8-12份；优选地，所述半夏为法半夏。
具体地，所述治疗肾病的中药组合物由以下重量份数的原料制成：太子参25份，法半夏25份，茯苓20份，丹参70份，红花10份，黄连10份，陈皮10份，大黄40份，牛膝20份和甘草10份。
根据本发明所述的指纹图谱建立方法，优选地，所述洗脱的梯度如下所示：
根据本发明所述的指纹图谱建立方法，优选地，所述洗脱的流动相流速在0至85min内为1.0至0.8mL/min；在85至110min内为0.8mL/min；在110至120min内为0.8至1.0mL/min；在120至160min内为1.0mL/min。
根据本发明所述的指纹图谱建立方法，优选地，所述高效液相色谱的条件还包括：柱温为15～40℃；更优选地，柱温为20℃；优选地，进样量为10μL；优选地，所述高效液相色谱的理论板数按盐酸小檗碱计算不低于50000。
根据本发明所述的指纹图谱建立方法，优选地，所述乙酸铵水溶液的pH为4。
根据本发明的一个实施方案，所述指纹图谱建立方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取对照品，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述治疗肾病的中药组合物，加甲醇或甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)测定方法：分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱。
更优选地，所述指纹图谱建立方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取对照品，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述治疗肾病的中药组合物0.8g，加入体积比为70％甲醇水溶液25mL，超声处理10～60分钟，例如30分钟，放冷，用体积比为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)测定方法：分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱。
根据本发明的一个具体实施方案，所述指纹图谱建立方法包括如下步骤：
1.混合对照品溶液的制备：分别精密称取盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚、盐酸药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、芸香柚皮苷、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素、丹酚酸B、甘草苷、甘草酸单铵，分别溶于甲醇中，另取鸟苷溶于体积比为50％的甲醇水溶液，再分别吸取各对照品溶液混匀，稀释，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得1mL含各对照品0.1μg的混合对照品溶液；
2.供试品溶液的制备：肾衰宁胶囊去囊壳，内容物混匀，精密称取0.8g于具塞三角瓶中，加体积比为70％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30min，取出放冷，补重，滤过，滤液再过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得；
3.测定方法：分别精密取吸取步骤(1)制备的混合对照品溶液和步骤(2)制备的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照以下高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱：
采用YMC-Triart C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，日本YMC公司)；以乙腈(A)和20mmol/L乙酸铵水溶液(以乙酸调至pH 4.00)(B)为流动相，洗脱梯度见下表；流动相流速为：0→85min，1.0→0.8mL/min；85→110min，维持0.8mL/min；110→120min，0.8→1.0mL/min；120→160min，维持1.0mL/min；检测波长为：0→100min，274nm；100→160min，262nm；柱温为20℃。
优选地，根据本发明所述的指纹图谱建立方法还包括按照上述高效液相色谱法的条件获得的多个治疗肾病的中药组合物样品的高效液相图谱，根据所述多个高效液相图谱中的参照物色谱峰，对其中共有色谱峰的保留时间进行校对和匹配，计算相似度，生成共有峰模式图谱。
另一方面，本发明还提供了一种治疗肾病的中药组合物的有效成分检测方法，其包括采用上述治疗肾病的中药组合物的指纹图谱建立方法获得高效液相指纹图谱，按照上述高效液相色谱法的条件获得治疗肾病的中药组合物待测样品的高效液相图谱，以及将两者进行比较。
根据本发明的一个具体实施方案，所述有效成分检测方法包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：肾衰宁胶囊去囊壳，内容物混匀，精密称取0.8g于具塞三角瓶中，加体积比为70％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30min，取出放冷，补重，滤过，滤液再过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得；
(3)测定方法：分别精密取吸取步骤(1)制备的参照物溶液和步骤(2)制备的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照以下高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱：
采用YMC-Triart C18色谱柱；以乙腈为流动相A和20mmol/L乙酸铵水溶液(以乙酸调至pH 4.00)为流动相B，洗脱梯度如下所示：
流动相流速在0至85min内为1.0至0.8mL/min；在85至110min内为0.8mL/min；在110至120min内为0.8至1.0mL/min；在120至160min内为1.0mL/min；检测波长在0至100min内为274nm，在100至160min内为262nm；柱温为20℃。
根据本发明所述的指纹图谱建立方法或有效成分检测方法，优选地，所述治疗肾病的中药组合物为肾衰宁药物；更优选地，所述治疗肾病的中药组合物为肾衰宁胶囊。
本发明提供的肾衰宁药物指纹图谱的特征在于所述指纹图谱为HPLC标准指纹图谱，其按照上述高效液相色谱方法对肾衰宁药物供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的肾衰宁药物标准指纹图谱。所述指纹图谱可以通过将不同批次肾衰宁药物HPLC图谱导入相关软件，例如“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”中进行对照。可以通过选取参照峰，对共有峰的保留时间进行校对和匹配，计算相似度，采用“中位数法”生成共有模式图谱。
所述指纹图谱至少包括8个共有特征峰，其相对于参照峰盐酸小檗碱峰的相对保留时间范围分别为：0.490～0.542、0.606～0.670、0.909～1.005、1.000、1.145～1.265、1.268～1.402、0.503～0.555和1.046～1.156。上述8个共有特征峰的前6个共有特征峰的各峰面积占总峰面积的百分比范围分别为：5.00～8.00、1.50～2.70、4.50～8.00、18.0～28.0、0.70～1.80、1.90～3.50。
所述指纹图谱包括28个指纹峰，其相对于参照峰盐酸小檗碱峰(峰19)的相对保留时间(RRt，单峰与小檗碱峰保留时间之比值)范围如下表所示：
本发明提供的上述肾衰宁药物指纹图谱可应用在肾衰宁药物的质量控制中。优选地，所述肾衰宁药物是肾衰宁胶囊。在通过上述方法得到肾衰宁药物指纹图谱之后，按照相同条件制备供试品图谱。评价标准为：1.指纹图谱对照：(1)供试品图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.97；(2)供试品图谱中应有28个指纹峰，与参照物相应的峰19为S峰，计算各指纹峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内；(3)供试品图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的4％。2.特征图谱对照：特征图谱制备方法同指纹图谱。供试品特征图谱中应有8个特征峰，与参照物相应的峰4为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，规定值为：0.516(峰1)、0.638(峰2)、0.957(峰3)、1.000(峰4)、1.205(峰5)、1.335(峰6)、0.529(峰7)、1.101(峰8)。计算峰1～峰6各峰面积占总峰面积的百分比，其百分比应在规定范围之内，规定范围为(％)：5.00～8.00(峰1)、1.50～2.70(峰2)、4.50～8.00(峰3)、18.0～28.0(峰4)、0.70～1.80(峰5)、1.90～3.50(峰6)。
本发明的发明人在肾衰宁胶囊指纹图谱的研究过程中，先后开发筛选了多种分析方法及特征图谱。首先选择乙腈-三氯乙酸体系、280nm定波长的方案，后考虑到对大极性成分以及生物碱类成分的分离效果，调整了色谱洗脱条件，即延缓洗脱体系的极性改变，延长大极性体系的洗脱时间，确定了乙腈-乙酸铵盐体系、280nm定波长的条件；为了更好识别小极性段洗脱出的蒽醌类、部分生物碱以及部分有机酸类，发明人在洗脱体系小极性段采用变波长扫描，采集低波长吸收的成分的色谱图，最终确定了乙腈-三氯乙酸体系、274nm→262nm变波长，识别28个指纹峰的技术方案。
本发明的方法得到的指纹图谱较已有公开报道的洗脱梯度变化较缓，针对特定成分的保留时间调节相应洗脱梯度，并采用变波长采集，较好地识别和分离更多的共有峰，最终识别了57个共有峰，其中占总峰面积1％以上的共有峰22个，另有6个占总峰面积1％以下的已知峰，最终选择8个共有峰用于产品质量控制。另外，本发明的方法识别了肾衰宁胶囊中的生物碱类、蒽醌类、有机酸类、苷类、酚酸类等药效成分，更好地体现了药效成分群的表征。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1的样品溶剂空白实验的HPLC色谱图；
图2显示了实施例1的样品测定时间的确定结果；
图3显示了实施例1的HPLC指纹图谱的精密度考察结果；
图4显示了实施例1的HPLC指纹图谱的稳定性考察结果；
图5显示了实施例1的HPLC指纹图谱的重复性试验结果；
图6为实施例1的肾衰宁胶囊的HPLC色谱图，其中R为对照品溶液；S1为代表性样品溶液；9-丹酚酸B；10-橙皮苷；12-非洲防己碱；13-表小檗碱；14-药根碱；15-黄连碱；17-巴马汀；19-小檗碱；20-大黄酸；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；23-鸟苷；24-甘草苷；25-芸香柚皮苷；26-甘草酸；27-大黄素；28-大黄素甲醚；
图7显示了实施例1的肾衰宁胶囊的HPLC图谱及共有模式R的生成，其中S1-S18：样品编号(见表1)；R：共有模式图谱；B：参照峰(小檗碱)；
图8显示了实施例1的肾衰宁胶囊的HPLC对照指纹图谱DZ及28个指纹峰。其中，9-丹酚酸B；10-橙皮苷；12-非洲防己碱；13-表小檗碱；14-药根碱；15-黄连碱；17-巴马汀；19-小檗碱；20-大黄酸；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；23-鸟苷；24-甘草苷；25-芸香柚皮苷；26-甘草酸；27-大黄素；28-大黄素甲醚；
图9显示了实施例1的肾衰宁胶囊的HPLC图谱及特征峰。其中，9-丹酚酸B；10-橙皮苷；17-巴马汀；19-小檗碱；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；24-甘草苷；26-甘草酸。其中，积分参数：斜率灵敏度为0.54；峰宽为0.73；最小峰面积为3.33；最小峰高为0.38；
图10显示了实施例1的肾衰宁胶囊的对照指纹图谱。其中，积分参数为：斜率灵敏度为0.54；峰宽为0.73；最小峰面积为3.33；最小峰高为0.38；
图11显示了实施例1的肾衰宁胶囊的对照特征图谱。其中，1-丹酚酸B；2-橙皮苷；3-巴马汀；4-小檗碱；5-芦荟大黄素；6-大黄酚；7-甘草苷；8-甘草酸；积分参数同图10所示对照指纹图谱。
图12为对比例1供试品的HPLC色谱图。
图13为对比例2供试品的HPLC色谱图。
图14为对比例3供试品的HPLC色谱图。
图15为对比例4供试品的HPLC色谱图。
图16为对比例5供试品的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，以下实施例只是描述性的，不意味着将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该意识到，本发明涵盖了权利要求书范围内可能包括的所有改进方案、备选方案和等效方案。
实施例1
一、仪器、试药与样品
Agilent 1260分析型高效液相色谱仪；KH-250E型超声波清洗器(中国昆山禾创公司)；AL104型万分之一分析天平(瑞士梅特勒公司)，Sartius PB-21型pH计。
对照品盐酸小檗碱(berberine hydrochloride，批号0713-9906，纯度98％)、橙皮苷(hesperidin，批号110721-200211，纯度≥98％)、大黄素(emodin，批号110756-200110，纯度≥98％)、大黄酚(chrysophanic acid，批号110796-200309，纯度≥98％)均购于中国药品生物制品检定所；盐酸药根碱(jatrorrhizine hydrochloride，批号17110702，纯度94％)、非洲防己碱(columbamine，批号17031901，纯度99％)、表小檗碱(epiberberine，批号17072011，纯度99％)、黄连碱(coptisine，批号17072010，纯度99％)和巴马汀(palmatine，批号17062804，纯度99％)均购于成都曼思特生物科技有限公司；芸香柚皮苷(narirutin，批号PRF7051642，纯度≥98％)、大黄素甲醚(physcion，批号PRF8030726，纯度≥98％)、大黄酸(rhein，批号PRF7080541，纯度≥98％)、芦荟大黄素(aloe emodin，批号PRF7021845，纯度≥98％)、丹酚酸B(salvianolic acid B，批号PRF7060301，纯度≥98％)、甘草苷(liquiritin，批号PRF8110742，纯度99％)和甘草酸单铵(monoammoniumglycyrrhizize，批号PRF8032142，纯度99％)均购于成都普瑞法科技开发有限公司；鸟苷(guanoine，批号DST170906-235，纯度99％)购于成都德思特生物技术有限公司。乙腈为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
肾衰宁胶囊样品(云南理想药业)一共18批次，批号如表1所示。
表1.肾衰宁胶囊样品信息
二、实验方法：
1.供试品溶液制备
肾衰宁胶囊去囊壳，内容物混匀，精密称取0.8g于具塞三角瓶中，加70％甲醇水溶液25mL，称重，超声处理30min，取出放冷，补重，滤过，滤液再过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得。
2.混合对照品溶液制备
分别精密称取盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚、盐酸药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、芸香柚皮苷、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素、丹酚酸B、甘草苷、甘草酸单铵各10mg，分别置于50ml容量瓶，分别加甲醇溶解，定容至刻度，另取鸟苷10mg置于50ml容量瓶，加50％甲醇水溶液溶解，定容至刻度，作为对照品储备液。分别量取以上17种对照品储备液各5ml于100ml容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
3.色谱条件
采用YMC-Triart C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，日本YMC公司)；以乙腈(A)﹣20mmol/L乙酸铵水溶液(以乙酸调至pH 4.00)(B)为流动相，洗脱梯度见表2。流速为：0→85min，1.0→0.8mL/min；85→110min，维持0.8mL/min；110→120min，0.8→1.0mL/min；120→160min，维持1.0mL/min。检测波长为：0→100min，274nm；100→160min，262nm。柱温为20℃。进样量10μL。二极管阵列检测器(型号为Agilent G4212B DAD检测器)。
表2.梯度洗脱条件
4.方法学考察
(1)空白试验
精密吸取70％甲醇水溶液(样品溶剂)10μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。结果(见图1)表明，样品溶剂对测定结果无干扰。
(2)测定时间的确定
精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，160min后，继续洗脱30min。结果(见图2)显示，保留时间160min后无色谱峰，故将时间确定为160min。
(3)精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10μL，连续进样6次，按上述色谱条件进行测定(见图3)。将所得图谱导入由国家药典委员会组织制定和建立的中药色谱指纹图谱电子标准图谱及其相似度评价软件系统“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)中，以小檗碱峰(B)作为参照峰，进行保留时间校对和匹配，计算相似度，采用“中位数法”生成共有模式图谱R。与共有模式图谱R相比，6次进样图谱的相似度均为1.000(相似度在0.90以上为合格)，表明仪器精密度良好，符合要求。
(4)稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在0、6、12、24、48h进样10μL，按色谱条件测定(见图4)。将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)中，以小檗碱峰(B)作为参照峰，进行保留时间校对和匹配，计算相似度，采用“中位数法”生成共有模式图谱R。与共有模式图谱R相比，48h内图谱的相似度均在0.999以上(要求相似度在0.90以上)，表明样品在48小时内的稳定性较好，符合要求。
(5)重复性试验：精密称取同一样品6份，平行制备供试品溶液，分别进样10μL，按照上述色谱条件测定(见图5)。将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)中，以小檗碱峰(B)作为参照峰，进行保留时间校对和匹配，计算相似度，采用“中位数法”生成共有模式图谱R。与共有模式图谱R相比，6份样品图谱的相似度均为1.000(要求相似度在0.90以上)，表明该方法重复性良好。
三、肾衰宁胶囊HPLC指纹图谱评价方法和限量标准
1.指纹图谱的制备
将对照品溶液和制备好的18批肾衰宁胶囊溶液按照上述色谱条件进行测定，记录色谱图，见图6。通过分析对比，标定了22个占总峰面积1％以上的共有峰(峰1～峰22)，经与对照品对照，其中的14个峰分别为丹酚酸B(9)、橙皮苷(10)、非洲防己碱(12)、表小檗碱(13)、药根碱(14)、黄连碱(15)、巴马汀(17)、小檗碱(19)、大黄酸(20)、芦荟大黄素(21)和大黄酚(22)。此外，还有6个占总峰面积1％以下的已知共有峰，分别为23(鸟苷)、24(甘草苷)、25(芸香柚皮苷)、26(甘草酸)、27(大黄素)和28(大黄素甲醚)。
2.对照指纹图谱的建立和相似度计算
将18批次肾衰宁胶囊HPLC图谱结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)中。由于峰19(小檗碱)的色谱峰分离良好，峰大、峰形稳定，且为共有峰，故将其作为参照峰B，进行保留时间校对和匹配，计算相似度，采用“中位数法”生成共有模式图谱R。18批次药物的HPLC指纹图谱和共有模式分别见图7，相似度计算结果见表3。
表3. 18批次肾衰宁胶囊HPLC指纹图谱的相似度
3.共有指纹峰的标定
将各批次药物图谱与之进行比较，得到各批次胶囊的相似度。
指纹图谱分析结果显示，18批次药物HPLC图谱共有57个共有峰，其中占总峰面积1％以上的共有峰22个(峰1～峰22)，另有6个占总峰面积1％以下的已知峰(峰23～峰28)(见图6)。以18批次胶囊指纹图谱的共有模式R作为对照指纹图谱(DZ)，将这28个共有峰作为对照指纹图谱的指纹峰(见图8)，以小檗碱(峰19)作为参照峰，分别计算各指纹峰的相对保留时间(各峰与小檗碱保留时间之比)(见表4)和相对峰面积(各峰与小檗碱峰面积之比)(见表5)。
结果显示，28个指纹峰相对保留时间的RSD为0.08％～0.72％，定位准确度高，表明可以采用相对保留时间对各指纹峰进行定位。而相对峰面积的RSD为12.0％～77.7％，变异较大，但大多数峰(22个)的峰面积变异系数都在40％以下，5个峰(峰25、16、20、8、4)为41.1％～59.3％，只有1个峰(峰5)为77.7％。
表4.肾衰宁胶囊指纹峰的相对保留时间
9-丹酚酸B；10-橙皮苷；12-非洲防己碱；13-表小檗碱；14-药根碱；15-黄连碱；17-巴马汀；19-小檗碱；20-大黄酸；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；23-鸟苷；24-甘草苷；25-芸香柚皮苷；26-甘草酸；27-大黄素；28-大黄素甲醚。
表5.肾衰宁胶囊指纹峰的相对峰面积
9-丹酚酸B；10-橙皮苷；12-非洲防己碱；13-表小檗碱；14-药根碱；15-黄连碱；17-巴马汀；19-小檗碱；20-大黄酸；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；23-鸟苷；24-甘草苷；25-芸香柚皮苷；26-甘草酸；27-大黄素；28-大黄素甲醚。
4.药物质量稳定性的指纹图谱评价方法
(1)相似度评价方法及限量标准
分别将各批次胶囊的HPLC图谱和对照指纹图谱DZ导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行两两比较。以小檗碱(峰19)作为参照峰B，进行保留时间校对和匹配，分别计算药物样品HPLC图谱与对照指纹图谱DZ的相似度。由表3和表6的相似度计算结果可见，18批次药物一起与DZ图谱比较(表3)和各药物样品与DZ图谱两两比较(表6)的相似度是有差异的，但差异不大。前者的相似度为0.947～0.994，其中17个样品为0.977～0.994，仅1个样品(S18)为0.947；后者的相似度为0.953～0.996，其中17个样品为0.972～0.996，仅1个批次(S18)为0.953。总的来看，所建立的指纹图谱DZ无论是采用批量样品比较还是单个样品比较，都具有很好的稳定性和重现性，同时建议将相似度0.97作为判别不同批次药物质量稳定性的内控限量标准。
表6.各批次肾衰宁胶囊HPLC图谱与对照指纹图谱DZ的相似度
(2)指纹峰相对保留时间评价方法
按照2015年版《中国药典》对中药注射剂指纹图谱评价的规定，采用HPLC指纹峰峰面积比值进行指纹图谱评价，对峰面积比值的要求为：(1)保留时间小于或等于30min的共有峰，Ai(单峰面积)≥20％At(总峰面积)，RSD≤±20％；10％At≤Ai<20％At，RSD≤±25％；5％At≤Ai<10％At，RSD≤±30％；Ai<5％At，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。(2)保留时间超过30min的共有峰，Ai≥10％At，同上述规定；Ai<10％At，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。
18批次肾衰宁胶囊HPLC指纹图谱中28个指纹峰的相对保留时间和相对峰面积如表4、表5所示，其中峰1～峰4、峰23的保留时间为9.23～13.63min，其余都在44.19min(峰5)以后，其中占总峰面积超过10％的单峰只有峰19(小檗碱)，而该峰也是参照峰，药典标准有含量测定项，因此肾衰宁胶囊共有指纹峰的评价主要是需要标定28个共有峰指纹峰。
根据18批次药物指纹图谱测定结果，以峰19(小檗碱)为参照峰，计算供试品中28个指纹峰(图8所示)的相对保留时间(RRt，单峰与小檗碱峰保留时间之比值)。供试品的HPLC图谱出峰顺序应如图8所示，各峰的RRt值应在表7各对应峰号规定值的±5％之内。
表7.共有指纹峰相对保留时间(RRt)规定值
9-丹酚酸B；10-橙皮苷；12-非洲防己碱；13-表小檗碱；14-药根碱；15-黄连碱；17-巴马汀；19-小檗碱；20-大黄酸；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；23-鸟苷；24-甘草苷；25-芸香柚皮苷；26-甘草酸；27-大黄素；28-大黄素甲醚。
四、肾衰宁胶囊HPLC特征图谱评价方法与限量标准
(1)共有峰和非共有峰总峰面积占比的分析
将各批次胶囊HPLC图谱和对照指纹图谱DZ导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行两两比较。以峰19(小檗碱)为参照峰，进行保留时间校对和匹配，通过与对照指纹图谱DZ比较，确定样品HPLC图谱与对照指纹图谱的共有峰、非共有峰和28个指纹峰，并计算其总峰面积占HPLC指纹图谱总峰面积的百分比，结果如表8所示。
18批次样品共有峰总峰面积占HPLC图谱总峰面积比值为96.1％～99.6％，平均值为98.7％，RSD为0.99％，说明对照指纹图谱DZ代表了肾衰宁胶囊化学成分的整体特征，稳定性好，能够用于药品质量的表征。28个共有指纹峰占总峰面积比值为76.4％～84.1％，平均值为80.4％，RSD为2.99％，表明28个指纹峰能够较好地体现HPLC指纹图谱的整体特征，而且数值较为稳定，也说明不同批次肾衰宁胶囊质量的稳定性较好。
非共有峰占总峰面积的比值从两个方面来看。与对照指纹图谱DZ相对比，样品HPLC图谱中出现的非共有峰是DZ图谱中没有、样品中增加的峰，不同批次样品非共有峰总峰面积变异较大，为0.38％～3.87％，平均值为1.27％，RSD为76.9％；而DZ图谱中出现的非共有峰是DZ图谱中有但样品中缺失的峰，不同批次样品非共有峰总峰面积的变异也较大，为0.11％～3.06％，平均值为1.44％，RSD为59.9％。
非共有峰面积占比的变异往往和药材来源和质量关系较大，是需要重点管控的。2015版《中国药典》对中药注射剂的要求，供试品图谱与指纹图谱相比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的5％。根据本实验结果，建议将非共有峰总面积不得大于总峰面积的4％作为肾衰宁胶囊质量稳定性的内控限量标准，即：供试品图谱与指纹图谱相比较，无论是增加的还是缺失的非共有峰总面积，均不得大于总峰面积的4％。
表8.与对照指纹图谱DZ相比的共有峰、非共有峰及指纹峰
*DZ的总峰面积为46128mAU
(2)特征图谱的建立与评价方法
18批次药物样品指纹图谱中各个指纹峰占总峰面积之百分比(％)计算结果如表9所示。由结果可见，峰19(小檗碱)占总峰面积的比值最高为23％；峰9(丹酚酸B)和峰17(巴马汀)分别为6.65％和6.07％；其余25个峰均在3.73％(峰15，黄连碱)以下。
表9.各共有指纹峰占总峰面积的比值(％)
9-丹酚酸B；10-橙皮苷；12-非洲防己碱；13-表小檗碱；14-药根碱；15-黄连碱；17-巴马汀；19-小檗碱；20-大黄酸；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；23-鸟苷；24-甘草苷；25-芸香柚皮苷；26-甘草酸；27-大黄素；28-大黄素甲醚；红色为特征峰。
由于大多数指纹峰的峰面积很小，故从中选择归属明确、RSD≤30％且分属于不同药材的8个指纹峰作为特征峰。如图9、表10所示，以峰19(小檗碱)为参照峰，计算其余7个峰的相对保留时间(单峰与参照峰保留时间之比)，用于特征峰定位；对于其中的6个峰(峰9、10、17、19、21、22)，以各峰占总峰面积比值的平均数(表9)上下浮动20％(±20％)为基础，结合18批次样品的测定结果适当调整放宽，制定了各峰占总峰面积比值限量的参考标准(表10)，18批次药材中超此范围的数据约为7.4％)；其余2个峰(峰24、26)仅进行定位。供试品图谱与特征图谱相比较，8个特征峰的出峰顺序如图9所示，相对保留时间应符合表10规定，其中6个特征峰与总峰面积的百分比应在表10规定范围之内。
表10. 8个特征峰的相对保留时间和占总峰面积比值规定值
五、肾衰宁胶囊HPLC指纹图谱与特征图谱质量标准草案
色谱条件或系统适应性试验(照《中国药典》(2015年版)高效液相色谱法(通则0512)测定)：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(YMC-Triart C18色谱柱，4.6mm×250mm，粒径5μm)；以乙腈为流动相A，以20mmol/L乙酸铵水溶液(以乙酸调pH至4.00)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0→85min，1.0→0.8mL/min，85→110min，维持0.8mL/min，110→120min，0.8→1.0mL/min，120→160min，维持1.0mL/min；检测波长为0→100min，274nm；100→160min，262nm；柱温为20℃。理论板数按小檗碱计算应不低于50000。
表11.洗脱梯度
参照物溶液制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。
供试品溶液制备 取本品内容物约0.8g精密称定，加入70％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30min，取出放冷，用70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，记录160分钟的色谱图，即得。
指纹图谱 按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，(1)供试品图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.97；(2)供试品图谱中应有28个指纹峰，与参照物相应的峰19为S峰，计算各指纹峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值如表12所示。(3)供试品图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的4％。对照指纹图谱见图10。
表12. 28个指纹峰相对保留时间(RRt)规定值
峰号：9-丹酚酸B；10-橙皮苷；12-非洲防己碱；13-表小檗碱；14-药根碱；15-黄连碱；17-巴马汀；19-小檗碱；20-大黄酸；21-芦荟大黄素；22-大黄酚；23-鸟苷；24-甘草苷；25-芸香柚皮苷；26-甘草酸；27-大黄素；28-大黄素甲醚。
特征图谱 特征图谱制备方法同指纹图谱。供试品特征图谱中应有8个特征峰，与参照物相应的峰4为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，规定值为：0.516(峰1)、0.638(峰2)、0.957(峰3)、1.000(峰4)、1.205(峰5)、1.335(峰6)、0.529(峰7)、1.101(峰8)。计算峰1～峰6各峰面积占总峰面积的百分比，其百分比应在规定范围之内，规定范围为(％)：5.00～8.00(峰1)、1.50～2.70(峰2)、4.50～8.00(峰3)、18.0～28.0(峰4)、0.70～1.80(峰5)、1.90～3.50(峰6)。对照特征图谱见图11。
对比例1：
色谱条件：采用YMC-Triart C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，日本YMC公司)，乙腈-0.4g/L三氯乙酸水溶液为流动相按下表进行梯度洗脱，检测波长280nm，柱温20℃，流速1.0ml/min，进样量10μl。
对照品溶液的制备：同实施例1。
供试品溶液的制备：肾衰宁胶囊去囊壳，内容物混匀，精密称量约0.7g，加甲醇15ml，超声提取30min，滤过，离心10min(4℃，12000rpm)，取上清液即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
洗脱梯度如下：
实验结果：供试品HPLC谱图见图12。
由此可见，实施例1的方案相对于该方案能识别更多的共有峰，具有更好的分离度，标定识别的化合物具备更好的药效指导意义。实施例1的方案采用较低的流动相极性变化梯度，对肾衰宁中的大极性成分、水溶性成分的分离效果较好，后段洗脱采用多段梯度洗脱，细分更多极性段，利于大黄、黄连、甘草等药材的有效成分表征。流动相更换为乙腈-乙酸铵体系，利于生物碱类成分表征。
对比例2：
色谱条件：采用YMC-Triart C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，日本YMC公司)；以乙腈(A)﹣20mmol/L乙酸铵水溶液(以乙酸调至pH 4.00)(B)为流动相，洗脱梯度、柱温同实施例1。检测波长固定为280nm。
对照品溶液的制备：同实施例1。
供试品溶液的制备：肾衰宁胶囊去囊壳，内容物混匀，精密称取0.8g于具塞三角瓶中，加70％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30min，取出放冷，补重，滤过，滤液再过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实验结果：供试品HPLC谱图见图13。
由此可见，实施例1的方案相对于该方案具有更好更全面的特征成分识别性。实施例1的方案针对后段洗脱出的化合物光谱特性做出调整，在洗脱后段采用较低波长扫描，使得不同光谱特性的成分表征于同一图谱，更全面的控制药效成分质量。
对比例3
色谱条件：采用Agilent SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温35℃，甲醇-乙腈50：50(体积比)作为A相，体积比为0.1％的甲酸水溶液作为B相，梯度洗脱，流速0.9ml/min，切换检测波长，0-15min为345nm，15-20min为203nm，20-50min为254nm，50-60min为280nm，60-100min为403nm。
洗脱梯度如下：
供试品溶液的制备：取肾衰宁胶囊内容物，研细，称取0.15g，精密称定，精密加入80％甲醇水溶液10mL，称定重量，超声提取40min，放冷，用80％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实验结果：见图14。
由此可见，实施例1的方案相对于该方案具有更好的分离效果，基线平稳，色谱峰数量更多，不同极性段的化合物均得到较好的体现，更易于实现肾衰宁胶囊中各种复杂组分的表征。
对比例4
色谱条件：采用Agilent SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温20℃，乙腈作为A相，体积比为0.1％的甲酸水溶液作为B相，梯度洗脱，流速1ml/min，检测波长为280nm。
洗脱梯度如下：
供试品溶液的制备：取肾衰宁胶囊内容物，研细，称取0.5g，精密称定，精密加入70％甲醇水溶液25mL，称定重量，超声提取45min，放冷，用70％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实验结果：见图15。
由此可见，实施例1的方案相对于该方案，成分分离效果较好，尤其是大极性到中等极性成分分离度较好，基线平稳，药效成分如核苷类、生物碱类、蒽醌类、酚酸类成分能实现很好的分离。
对比例5
色谱条件：采用Agilent SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温20℃，乙腈作为A相，体积比为0.1％的磷酸水溶液作为B相，梯度洗脱，流速1ml/min，检测波长为280nm。
洗脱梯度如下：
供试品溶液的制备：取肾衰宁胶囊内容物，研细，称取1.0g，精密称定，精密加入50％甲醇水溶液50mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用50％甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实验结果：见图16。
由此可见，实施例1的方案相对于该方案，化合物峰分离程度好，尤其是中等极性成分分离度较好，各个成分可以很均衡地出峰，并体现在色谱图不同洗脱强度位置，有效物质色谱峰得到较好表征。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (12)
1.一种治疗肾病的中药组合物的指纹图谱建立方法，其采用高效液相色谱法，所述高效液相色谱法的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以20mmol/L乙酸铵水溶液为流动相B，按照0至160分钟内流动相A与流动相B的体积比从3：97变化至100：0的梯度进行洗脱；检测波长在0至100min内为274nm，在100至160min内为262nm；
其中，所述治疗肾病的中药组合物由以下重量份数的原料制成：太子参20-30份，半夏20-30份，茯苓16-24份，丹参56-84份，红花8-12份，黄连8-12份，陈皮8-12份，大黄32-48份，牛膝16-24份和甘草8-12份；优选地，所述半夏为法半夏。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱建立方法，其中所述洗脱的梯度如下所示：
3.根据权利要求1或2所述的指纹图谱建立方法，其中所述洗脱的流动相流速在0至85min内为1.0至0.8mL/min；在85至110min内为0.8mL/min；在110至120min内为0.8至1.0mL/min；在120至160min内为1.0mL/min。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的指纹图谱建立方法，其中所述高效液相色谱的条件还包括：柱温为15～40℃，优选为20℃；优选地，进样量为10μL；优选地，所述高效液相色谱的理论板数按盐酸小檗碱计算不低于50000。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的指纹图谱建立方法，其中所述乙酸铵水溶液的pH为4。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的指纹图谱建立方法，其包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取对照品，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述治疗肾病的中药组合物，加甲醇或甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)测定方法：分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱。
7.根据权利要求6所述的指纹图谱建立方法，其包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取对照品，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述治疗肾病的中药组合物0.8g，加入体积比为70％甲醇水溶液25mL，超声处理10～60分钟，例如30分钟，放冷，用体积比为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)测定方法：分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的指纹图谱建立方法，其包括如下步骤：
(1)混合对照品溶液的制备：分别精密称取盐酸小檗碱、橙皮苷、大黄素、大黄酚、盐酸药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、芸香柚皮苷、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素、丹酚酸B、甘草苷、甘草酸单铵，分别溶于甲醇中，另取鸟苷溶于体积比为50％的甲醇水溶液，再分别吸取各对照品溶液混匀，稀释，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得1mL含各对照品10μg的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：肾衰宁胶囊去囊壳，内容物混匀，精密称取0.8g于具塞三角瓶中，加体积比为70％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30min，取出放冷，补重，滤过，滤液再过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得；
(3)测定方法：分别精密取吸取步骤(1)制备的混合对照品溶液和步骤(2)制备的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照以下高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱：
采用YMC-Triart C18色谱柱；以乙腈为流动相A和20mmol/L乙酸铵水溶液(以乙酸调至pH 4.00)为流动相B，洗脱梯度如下所示：
流动相流速在0至85min内为1.0至0.8mL/min；在85至110min内为0.8mL/min；在110至120min内为0.8至1.0mL/min；在120至160min内为1.0mL/min；检测波长在0至100min内为274nm，在100至160min内为262nm；柱温为20℃。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的指纹图谱建立方法，其还包括按照所述高效液相色谱法的条件获得多个治疗肾病的中药组合物样品的高效液相图谱，根据所述多个高效液相图谱中的参照物色谱峰，对其中共有色谱峰的保留时间进行校对和匹配，计算相似度，生成共有峰模式图谱。
10.一种治疗肾病的中药组合物的有效成分检测方法，其包括采用权利要求1至9中任一项所述的治疗肾病的中药组合物的指纹图谱建立方法获得高效液相指纹图谱，按照所述高效液相色谱法的条件获得治疗肾病的中药组合物待测样品的高效液相图谱，以及将两者进行比较。
11.根据权利要求10所述的有效成分检测方法，其中按照所述高效液相色谱法的条件获得治疗肾病的中药组合物待测样品的高效液相图谱包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：肾衰宁胶囊去囊壳，内容物混匀，精密称取0.8g于具塞三角瓶中，加体积比为70％甲醇水溶液25ml，称定重量，超声处理30min，取出放冷，补重，滤过，滤液再过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得；
(3)测定方法：分别精密取吸取步骤(1)制备的参照物溶液和步骤(2)制备的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照以下高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱：
采用YMC-Triart C18色谱柱；以乙腈为流动相A和20mmol/L乙酸铵水溶液(以乙酸调至pH 4.00)为流动相B，洗脱梯度如下所示：
流动相流速在0至85min内为1.0至0.8mL/min；在85至110min内为0.8mL/min；在110至120min内为0.8至1.0mL/min；在120至160min内为1.0mL/min；检测波长在0至100min内为274nm，在100至160min内为262nm；柱温为20℃。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的指纹图谱建立方法或根据权利要求10或11所述的有效成分检测方法，其中所述治疗肾病的中药组合物为肾衰宁药物；优选地，所述治疗肾病的中药组合物是肾衰宁胶囊。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115060836A (zh) * | 2022-06-24 | 2022-09-16 | 深圳市中医院 | 一种健脾益肾丸高效液相指纹图谱的构建方法及应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009086685A1 (zh) * | 2007-12-29 | 2009-07-16 | Dalian Yaweite Bioengineering Co., Ltd. | 低分子量海藻酸及其盐、应用、制法及药物组合物、食品 |
| CN101816715A (zh) * | 2009-11-24 | 2010-09-01 | 云南理想药业有限公司 | 使用hplc法测定肾衰宁胶囊中丹参素含量的方法 |
| CN101856444A (zh) * | 2009-04-08 | 2010-10-13 | 云南理想药业有限公司 | 肾衰宁片薄膜包衣工艺技术的优化 |
| CN103071006A (zh) * | 2013-02-07 | 2013-05-01 | 云南理想药业有限公司 | 一种治疗肾功能衰竭中药的制备方法及质量检测方法 |
| CN105486790A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-04-13 | 山西德元堂药业有限公司 | 肾衰宁颗粒的指纹图谱检测方法 |
| CN106198823A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-07 | 秦皇岛市山海关药业有限责任公司 | 一种肾衰宁片有效成分的测定方法 |
| WO2017148426A1 (zh) * | 2016-03-03 | 2017-09-08 | 石家庄以岭药业股份有限公司 | 一种中药组合物的指纹图谱的测定方法 |
| US20190219550A1 (en) * | 2012-11-02 | 2019-07-18 | Li Min Pharmaceutical Factory Of Livzon Pharmaceutical Group | System and Method for Identifying Shenqi Fuzheng Injection |
-
2020
- 2020-12-15 CN CN202011476412.4A patent/CN114636760B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009086685A1 (zh) * | 2007-12-29 | 2009-07-16 | Dalian Yaweite Bioengineering Co., Ltd. | 低分子量海藻酸及其盐、应用、制法及药物组合物、食品 |
| CN101856444A (zh) * | 2009-04-08 | 2010-10-13 | 云南理想药业有限公司 | 肾衰宁片薄膜包衣工艺技术的优化 |
| CN101816715A (zh) * | 2009-11-24 | 2010-09-01 | 云南理想药业有限公司 | 使用hplc法测定肾衰宁胶囊中丹参素含量的方法 |
| US20190219550A1 (en) * | 2012-11-02 | 2019-07-18 | Li Min Pharmaceutical Factory Of Livzon Pharmaceutical Group | System and Method for Identifying Shenqi Fuzheng Injection |
| CN103071006A (zh) * | 2013-02-07 | 2013-05-01 | 云南理想药业有限公司 | 一种治疗肾功能衰竭中药的制备方法及质量检测方法 |
| CN105486790A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-04-13 | 山西德元堂药业有限公司 | 肾衰宁颗粒的指纹图谱检测方法 |
| WO2017148426A1 (zh) * | 2016-03-03 | 2017-09-08 | 石家庄以岭药业股份有限公司 | 一种中药组合物的指纹图谱的测定方法 |
| CN106198823A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-07 | 秦皇岛市山海关药业有限责任公司 | 一种肾衰宁片有效成分的测定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| XUJIAO CHEN: "Shen-shuai-ning granule decreased serum concentrations of indoxyl sulphate in uremic patients undergoing peritoneal dialysis", 《BIOSCI REP》, vol. 38, no. 5 * |
| 宋新华;陈旭娇;邓冯沂;高守红;彭辉;: "肾衰宁颗粒指纹图谱研究及3种有效成分含量测定", 药学实践杂志, no. 03 * |
| 段陈平 等: "肾衰宁颗粒的指纹图谱检测方法", 《医药卫生科技》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115060836A (zh) * | 2022-06-24 | 2022-09-16 | 深圳市中医院 | 一种健脾益肾丸高效液相指纹图谱的构建方法及应用 |
| CN115060836B (zh) * | 2022-06-24 | 2023-10-31 | 深圳市中医院 | 一种健脾益肾丸高效液相指纹图谱的构建方法及应用 |
Also Published As
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