CN111751472A

CN111751472A - 一种槐芩软膏的质量评价方法

Info

Publication number: CN111751472A
Application number: CN202010674574.2A
Authority: CN
Inventors: 许丽丽; 林永强; 刘群; 栾永福; 臧远芳; 刘洪超; 徐兴燕; 于雅萌; 高登璐; 何军
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2020-10-09

Abstract

本发明公开了一种槐芩软膏的质量评价方法，其特征在于，采用指纹图谱相似度分析和指标成分相对含量分析相结合的方法，当待测槐芩软膏的指纹图谱与槐芩软膏对照指纹图谱相似度高于0.95时，进行指标成分相对含量分析，槐芩软膏的指纹图谱相似度分析和指标成分相对含量分析采用HPLC‑DAD法。该方法经精密度、稳定性、重复性等方法学验证，准确，灵敏，比较指纹图谱中21个共有峰的有无，信息量较大，能有效评价槐芩软膏的质量，可以实现定性分析。采用槐角苷、芍药苷和黄芩苷来实现对21个成分同步监控，更高效便捷，尤其在缺少对照品的情况下，可实现槐芩软膏21种指标成分的相对含量控制，且能有效降低多组分含量测定的成本。

Description

一种槐芩软膏的质量评价方法

技术领域

本发明属于中药分析评价领域，具体涉及一种槐芩软膏的质量评价方法。

背景技术

槐芩软膏由槐角（炒）、赤芍、牡丹皮、当归、防风、枳壳、黄芩和制川乌八味药组成，临床用于Ⅰ、Ⅱ期内痔或混合痔兼有内痔Ⅰ、Ⅱ期湿热下注证，症见便血、坠痛、局部不适、痔核脱垂。方中槐角具有清热解毒、凉血止血功效，为君药；黄芩具有清热燥湿解毒之功效，牡丹皮清热凉血，增君药清热凉血之功，为臣药；当归养血活血，赤芍凉血祛瘀，共助君臣之药，祛邪而不伤正，防风、祛风止血，枳壳破气消积，制川乌麻醉止痛，五药合用为佐药。全方共奏清热止血、消肿止痛之功效。槐芩软膏执行标准为国家药品标准YBZ01182015，含量测定项下仅有有芦丁和黄芩苷两个指标成分。尚未见有槐芩软膏指纹图谱和多组分定量测定的研究。

中药指纹图谱是指某种（或某产地）中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱。中药指纹图谱作为一种国际公认的现代中药监督手段，从中药多组分、多靶点的角度出发，运用现代分析检测技术，用光谱或色谱图来表征中药中具有特征性的某类或几类成分，具有真实、稳定和准确的优点，可鉴别中药真伪、评价质量一致性和制剂稳定性。根据质量控制目可分为指纹图谱和特征图谱两类。指纹图谱在整体信息基础上，用于中药质量的整体评价，确保其内在质量的一致和稳定。特征图谱作为控制中药质量的重要鉴别手段，是通过选取图谱中某些重要的特征峰信息进行评价。目前中药指纹图谱是被世界卫生组织接受作为有效评价中药质量的手段，已广泛运用到中药质量分析领域，主要有随行对照评价、特征峰分析评价、相似度评价3 种模式。指纹图谱不仅符合中医理论整体控制的可行模式，也体现了现代分析技术在建立符合中医药特点的质量标准体系方面的优势。

中药复方中化学成分类型多样，常规的多成分测定外标法具有所需对照品种类多、成本高、方法学考察复杂等不足。现有的槐芩软膏现有质量标准相对简单，不能满足实际生产质控的问题，为了更全面地评价槐芩软膏的质量，完善其质量评价标准，有必要建立一种新的槐芩软膏的质量评价方法。

发明内容

针对现有技术中存在的槐芩软膏现有质量标准相对简单，对多组分进行测定时对照品价格昂贵且供应量少的问题，本发明提供了一种槐芩软膏的质量评价方法，该方法将指纹图谱相似度分析和定量分析相结合，方法准确、高效、重复性及稳定性好、特征性强，可用于槐芩软膏的质量控制。

本发明通过以下技术方案实现：

一种槐芩软膏的质量评价方法，采用指纹图谱相似度分析和指标成分相对含量分析相结合的方法，当待测槐芩软膏的指纹图谱与槐芩软膏对照指纹图谱相似度高于0.95时，进行指标成分相对含量分析。

进一步地，所述的槐芩软膏的指纹图谱相似度分析和指标成分相对含量分析采用HPLC-DAD法。

进一步地，所述的HPLC的色谱条件为：色谱柱，Agilent Extend C18，250mm×4.6mm；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液；梯度洗脱，0~10min，13%乙腈；10~40 min，13%乙腈→16%乙腈；50~60 min，40%乙腈→50%乙腈；流速，1.0mL/min；柱温，25℃，进样量，10μL。

进一步地，所述的槐芩软膏对照指纹图谱的构建方法为：

（1）供试品溶液的制备：取槐芩软膏1g，加入70%甲醇25mL，超声处理30min，取出，放冷，置于-20℃冷冻30min，取出过滤，滤液过0.45μm滤膜，即得供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备：称取芍药苷、芦丁、染料木苷、槐角苷、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、丹皮酚为对照品，加甲醇溶解得到质量浓度分别为0.1688、0.0986、0.0958、0.0876、0.1058、0.0687、0.1444、0.0961、0.1450mg·mL^-1的混合溶液，即为对照品溶液；

（3）高效液相色谱分析：将对照品溶液与供试品溶液各注入高效液相色谱仪中，测定10批槐芩软膏并进行分析比较，得到由槐芩软膏共有特征峰构成的槐芩软膏对照指纹图谱。

进一步地，步骤（3）中所述的检测波长为230nm。

进一步地，所述的相似度评价，以槐角苷为参照峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价（2012A 版）软件进行相似度评价。

进一步地，所述的指标成分相对含量分析方法为：以槐角苷、芍药苷和黄芩苷为参照，波长切换法同时测定其它特征峰成分的相对含量。

进一步地，对槐芩软膏对照指纹图谱中的21个峰按出峰顺序进行编号，在260nm检测波长下，以浓度为0.0876mg/ml槐角苷对照品为参照，计算峰1、2、5、6、7、8、10、11、12的相对含量；在230nm检测波长下，以浓度为0.1668 mg/ml芍药苷对照品为参照，计算峰3、4、9、19的相对含量；在280nm检测波长下，以浓度为0.1444 mg/ml黄芩苷对照品为参照，计算峰13、14、15、16、17、18、20、21的相对含量。

有益效果

1.研究建立了槐芩软膏指纹图谱的方法，经精密度、稳定性、重复性等方法学验证，准确，灵敏，比较指纹图谱中21个共有峰的有无，信息量较大，能有效评价槐芩软膏的质量，可以实现定性分析；

2.本发明选择价格低廉、易得的槐角苷、芍药苷和黄芩苷为参照峰，建立21个峰与相应参照峰峰面积和浓度间的相对含量计算方法，可实现多组分同时定量测定，为槐芩软膏的质量控制和鉴定提供科学参考；

3.采用3个对照成分来实现对21个成分同步监控，更高效便捷，尤其在缺少对照品的情况下，可实现槐芩软膏21种指标成分的相对含量控制，且能有效降低多组分含量测定的成本。

附图说明

图1为槐芩软膏（10批）的HPLC指纹图谱（A）、对照指纹图谱（B）、混合对照品HPLC图（C）；

图2为槐芩软膏中各味药材共有峰色谱图；

图3为槐芩软膏阴性样品中共有峰色谱图；

图4为对照指纹图谱中21个峰的DAD吸收光谱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明实施例中使用的仪器为Waters 2695 高效液相色谱系统；XSE205十万分之一电子天平（METTLER公司）；BK-600C超声波清洗仪（巴克超声设备有限公司）。

对照品芍药苷（批号110736-201842）、芦丁（批号：100080-201409）、染料木苷（111709-200501）、槐角苷（111695-201502）、柚皮苷（110722-200108）、新橙皮苷（111857-201703）、黄芩苷（批号110715-201318）、汉黄芩苷（批号112002-201702）、丹皮酚（批号110708-201407）均购于中国食品药品检定研究院；槐角（批号：121214-201502）、黄芩（批号：120955-201309）、赤芍（批号：121093-201303）、牡丹皮（批号：121490-201603）、当归（批号：120927-201617）、防风（批号：120947-201810）、枳壳（批号：120981-201605）对照药材均购于中国食品药品检定研究院。

槐芩软膏10批，山东中大千方制药有限公司，批号190501051（S1）、190501052（S2）、190501053（S3）、190801051（S4）、190801052（S5）、190801053（S6）、191101051（S7）、191101052（S8）、191101053（S9）、191201051（S10）。

乙腈（Honeywell B&J）和磷酸（上海阿拉丁生物科技有限公司）均为色谱纯；其余试剂均为分析纯。Milli-Q超纯水（Millipore Co.）。

实施例1

（1）色谱条件

色谱柱：Agilent ExtendC ₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A） -0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~10min，13%A；10~40 min，13%A →16%A；50~60 min，40%A →50%A）；流速：1.0mL·min^-1，检测波长：230 nm，柱温：25℃，进样量10μL。

（2）混合对照品溶液的制备

分别精密称取芍药苷、芦丁、染料木苷、槐角苷、柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、丹皮酚对照品适量，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度分别为0.1688、0.0986、0.0958、0.0876、0.1058、0.0687、0.1444、0.0961、0.1450mg·mL^-1的混合溶液。

（3）供试品溶液的制备

取槐芩软膏内容物适量混匀，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30min，取出，放冷，置-20℃冰箱中冷冻30分钟，取出，迅速过滤，续滤液过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

（4）对照药材溶液的制备

取槐角、黄芩、赤芍、牡丹皮、当归、防风、枳壳对照药材粉末，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30min，取出，过滤，续滤液过0.45μm滤膜，即得对照药材溶液。

（5）阴性样品溶液的制备

按照槐芩软膏处方工艺分别制备缺少槐角、黄芩、赤芍、牡丹皮、当归、防风、枳壳的阴性样品。按步骤（3）供试品溶液制备方法，制成相应的阴性样品溶液。

（6）指纹图谱方法学考察

a）精密度试验

取 S1 号样品，按步骤（3）所述的方法制备供试品溶液，按步骤（1）所述的色谱条件下连续进样6次，以11号色谱峰（槐角苷）的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果21个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的 RSD（n=6）均小于2.0%，6 次采集的指纹图谱（以第 1 次采集的色谱图为参照图谱）的相似度均大于0.95，说明仪器和试验方法精密度良好。

b）稳定性试验

取 S1 号样品，按步骤（3）供试品溶液制备方法制备S1供试品溶液，在室温下放置 0、4、8、12、18、24 h 按步骤（1）所述的色谱条件下进样，以11号峰（槐角苷）的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果21个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD（n=6）均小于3.0%，6次采集的指纹图谱（以放置0 h采集的色谱图为参照图谱）的相似度均大于0.95，表明 S1号供试品溶液在室温条件下放置24 h内稳定。

c）重复性试验

取 S1 号槐芩软膏样品 6 份，按步骤（3）供试品溶液制备方法平行制备供试品溶液，按步骤（1）所述的色谱条件下进样，以11号峰（槐角苷）的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果21个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD（n=6）均小于2.0%，6次采集的指纹图谱（以第1份供试品溶液采集的色谱图为参照图谱）的相似度均大于0.95，说明该仪器方法重复性良好。

d）指纹图谱的建立

分别将10批槐芩软膏样品按步骤（3）供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按步骤（1）所述的色谱条件下进样分析，记录 HPLC 色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A 版）软件对色谱峰匹配分析，以 S1号样品的色谱图为参考图谱，时间窗宽度设为 0.5min，采用多点校正后自动匹配法建立指纹图谱，并以中位数法生成对照图谱，见图1，结果共标定出21个共有色谱峰，10批槐芩软膏与对照指纹图谱的相似度分别为0.993、0.991、0.992、0.997、0.991、0.993、0.994、0.998、0.996、0.983，相似度均在0.95以上，结果表明这10批槐芩软膏的化学成分一致性较好，质量比较稳定。

e）指纹图谱共有峰的归属与指认

取槐角、赤芍、牡丹皮、当归、防风、枳壳、黄芩7味药材粉末各约0.5 g，精密称定，按步骤（4）制备供试品溶液，按步骤（1）所述的色谱条件下项下色谱条件分析，结果显示 1、2、5、6、7、8、11、12号峰来源于槐角，4号峰来源于牡丹皮、赤芍， 3、19、21号峰来源于牡丹皮，13、14号来源于枳壳，7、9、15、16、17、18、20号峰来自黄芩，10号峰来自防风和枳壳。当归对照药材对此指纹图谱贡献不大，色谱图见图 2。通过比对供试品溶液色谱图与混合对照品溶液色谱图的紫外吸收值指认出9个共有成分，分别是4号芍药苷，7号芦丁，8号染料木苷，11号槐角苷，13号柚皮苷，14号新橙皮苷，15号黄芩苷，18号汉黄芩苷，21号丹皮酚，选择峰形较好，保留时间相对居中的11号槐角苷色谱峰作参照峰，计算其他共有峰相对峰面积和相对保留时间，并计算相应的 RSD，结果21个共有峰的相对保留时间 RSD（n=10）均小于3.0%，相对峰面积及其RSD 见表1。根据表1中10批样品各色谱峰的相对峰面积可知，峰19和21（丹皮酚）相对偏差较大，说明不同批次间样品存在一定差异，主要跟牡丹皮投料相关。另一方面主要是19号峰和21号峰的峰面积相对较小，在整个色谱分析中大峰掩盖小峰，导致偏差较大，因此相似度分析主要用于定性鉴别。

表1槐芩软膏各共有峰的相对峰面积

根据建立的槐芩软膏指纹图谱，只需将不同批次样品的供试品溶液色谱图导入《中药色谱图的指纹图谱评价系统》（2012A 版）软件，与对照指纹图谱进行多点校正，Mark峰匹配，即可得到供试品与对照指纹图谱的匹配结果和相似度分析结果。为保证试验结果的准确性，供试品溶液中各色谱峰的相对保留时间应控制在±5%以内，超出该范围，则判为不合格。供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.95。供试品溶液中如有色谱峰的缺失，则判为不合格，并可根据相关缺失色谱峰进行药味归属，进一步追溯源头药材质量问题。

实施例2

多组分质量控制

（1）相对含量计算方法的建立

由于各化合物的最大吸收波长不同，在指纹图谱整体特征基础上为了实现对多指标成分含量的高灵敏度测定，同时节省对照品的使用，选取各组指标性成分的最大吸收波长下价廉易得、稳定性好的对照品槐角苷、芍药苷和黄芩苷为参照，测定其相对含量。根据21个峰的DAD吸收光谱图，见图4，将其分为A、B、C 3组，A组中峰1、2、5、6、7、8、10、11、12最大吸收波长260nm，在此波长下以峰11槐角苷对照品（浓度0.0876mg/ml）为参照进行计算；B组中峰3、4、9、19的最大吸收波长230nm，在230nm波长下以峰4芍药苷对照品（浓度0.1668mg/ml）为参照进行计算；C组中峰13、14、15、16、17、18、20、21最大吸收波长280nm，在此波长下以峰15黄芩苷对照品（浓度0.1444mg/ml）为参照进行计算，计算各个峰与相应的参照峰对照品峰面积和浓度的比值，公式为：C_x=A_样品/A_参照峰×C_参照峰（A_样品、A_{参照峰分别}为样品和参照峰的峰面积，C_参照峰为参照峰的浓度）。计算结果见表2。

（2）仪器波长精密度考察

因不同仪器吸收波长的差异性，特进行测定波长±2nm进行考察，以样品S1进行考察，考察结果见表3。试验结果表明，仪器波长对测定结果有一定影响，RSD均在合理限度范围内。

表2各个峰与相应的参照峰对照品峰面积和浓度的比值

表3 波长精密度考察

（3）重复性试验取 S1 号槐芩软膏样品 6 份，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超声处理30min，取出，放冷，置-20℃冰箱中冷冻30分钟，取出，迅速过滤，续滤液过0.45μm滤膜，进样得到的色谱峰按步骤（1）的方法，计算21个峰与各组相应参照峰的相对含量，结果21个共有峰的相对含量的RSD（n=6）均小于2.0%，说明该仪器方法重复性良好。

（4）结果判定

根据表2中21个峰的相对含量，取其平均值的50%作为规定限度值。将供试品中21个色谱峰（在各分组中的最大吸收波长下）与槐角苷对照品（浓度0.0876mg/ml）、芍药苷对照品（浓度0.1668mg/ml）、黄芩苷对照品（浓度0.1444mg/ml）的峰面积与浓度比值进行计算，1-21号峰限度值为0.042、0.049、0.028、0.110、0.028、0.090、0.026、0.024、0.070、0.018、0.241、0.145、0.058、0.071、0.296、0.028、0.040、0.075、0.015、0.019、0.014。若低于此数值均判为不合格。

在实际应用该方法检验时，三个参照品的浓度会有不同，但因为采用其实际浓度与峰面积比值来计算相应峰的限度值，故对判定结果不会产生影响。

Claims

1.一种槐芩软膏的质量评价方法，其特征在于，采用指纹图谱相似度分析和指标成分相对含量分析相结合的方法，当待测槐芩软膏的指纹图谱与槐芩软膏对照指纹图谱相似度高于0.95时，进行指标成分相对含量分析。

2.根据权利要求1所述的质量评价方法，其特征在于，所述的槐芩软膏的指纹图谱相似度分析和指标成分相对含量分析采用HPLC-DAD法。

3.根据权利要求2所述的质量评价方法，其特征在于，所述的HPLC的色谱条件为：色谱柱，Agilent Extend C18，250mm×4.6mm；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液；梯度洗脱，0~10min，13%乙腈；10~40 min，13%乙腈→16%乙腈；50~60 min，40%乙腈→50%乙腈；流速，1.0mL/min；柱温，25℃，进样量，10μL。

4.根据权利要求2所述的质量评价方法，其特征在于，所述的槐芩软膏对照指纹图谱的构建方法为：

5.根据权利要求4所述的质量评价方法，其特征在于，步骤（3）中所述的检测波长为230nm。

6.根据权利要求2所述的质量评价方法，其特征在于，所述的相似度评价，以槐角苷为参照峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价。

7.根据权利要求2所述的质量评价方法，其特征在于，所述的指标成分相对含量分析方法为：以槐角苷、芍药苷和黄芩苷为参照，波长切换法同时测定其它特征峰成分的相对含量。

8.根据权利要求7所述的质量评价方法，其特征在于，对槐芩软膏对照指纹图谱中的21个峰按出峰顺序进行编号，在260nm检测波长下，以浓度为0.0876mg/ml槐角苷对照品为参照，计算峰1、2、5、6、7、8、10、11、12的相对含量；在230nm检测波长下，以浓度为0.1668 mg/ml芍药苷对照品为参照，计算峰3、4、9、19的相对含量；在280nm检测波长下，以浓度为0.1444 mg/ml黄芩苷对照品为参照，计算峰13、14、15、16、17、18、20、21的相对含量。