CN107727753B - 百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。本发明以百乐眠胶囊内容物溶液为供试品溶液，以溶解有槲皮苷、2,3,5,4’‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑D葡萄糖苷、五味子醇甲、丹酚酸B和大黄素的溶液为对照品溶液，通过HPLC色谱仪测定分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱；将得到的液相色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，经多点校正、数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。标定了24个共有峰，指认了5个共有特征峰，选择9号峰槲皮苷作为指纹图谱中的参照峰，确定了各共有峰的相对保留时间。本发明指纹图谱能较全面的反映百乐眠胶囊的质量信息，保证产品质量均一稳定。

Description

百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。

背景技术

目前的失眠治疗药物主要有西药与中药两大类，西药主要为苯二氮卓类及非苯二氮卓类药物，但这两类药物均因不良反应明显、副作用大等原因不宜长期服用。而中成药因具有增效减毒的作用，备受关注。百乐眠胶囊由老中医高鹏翔教授结合50年临床经验及经典方改良而成，是国家食品药品监督管理局唯一批准的针对肝郁阴虚型失眠症的药物。

百乐眠胶囊是由百合，刺五加(生)，首乌藤，合欢花，珍珠母，石膏，酸枣仁，茯苓，远志，玄参，地黄(生)，麦冬，五味子，灯心草，丹参15种药材制成的中药复方制剂，具有滋阴清热﹐养心安神的作用。本品用于肝郁阴虚型失眠症﹐症见入睡困难、多梦易醒、醒后不眠、头晕乏力、烦躁易怒、心悸不安等。自2002年批准上市销售至今，百乐眠胶囊能有效改善失眠、疗效显著优于同类传统中成药及中药复方制剂，明显改善其它疾病伴有的焦虑症状、不良反应少，备受医生及消费者好评。

目前，百乐眠胶囊通过国家药品标准WS3-752(Z-209)-2006(Z)来进行质量控制，即通过测定单一药材首乌藤中的大黄素含量对百乐眠胶囊进行质量控制。然而，百乐眠胶囊处方中药材较多，所含的化学成分种类众多、且各化学成分的含量差异较大，仅仅通过一种成分的含量测定来对百乐眠胶囊的质量进行检测和控制，不能从整体上反映百乐眠胶囊的质量。

因此，为了更好地对药品质量进行控制，保证临床疗效，需建立全面评价该制剂的质量控制方法。建立一种百乐眠胶囊的质量控制方法具有重要的现实意义，以指纹图谱作为中药制剂的质量控制方法，已成为国际共识。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的百乐眠胶囊质量检测方法无法从整体上全面反应百乐眠胶囊的质量的问题,提供一种百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，通过此方法可以保证百乐眠胶囊的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保百乐眠胶囊的安全性和有效性。

本发明的另一目的是提供一种由上述方法得到的百乐眠胶囊指纹图谱，该图谱基本代表百乐眠胶囊的物质基础。

本发明的第三个目的是将所提供的百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法应用在百乐眠胶囊的质量检测或质量控制方面。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，其以百乐眠胶囊内容物溶液为供试品溶液，以溶解有槲皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、五味子醇甲、丹酚酸B和大黄素的溶液为对照品溶液，通过HPLC色谱仪测定分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱；将得到的液相色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，经多点校正、数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。其中测定液相色谱时，流动相采用乙腈-磷酸-水体系，检测波长为230-280nm。

在一种方案中，每1mL对照品溶液中含有20～195μg槲皮苷、40～135μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、16～144μg五味子醇甲、24～216μg丹酚酸B和4～12μg 大黄素。在一种优选方案中，每1mL对照品溶液中含有60～70μg槲皮苷、40～50μg 2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、45～51μg五味子醇甲、69～75μg丹酚酸B和 4～12μg大黄素。

对照品溶液的溶剂可采用甲醇、水或者甲醇水混合溶液，优选采用甲醇水溶液，更优选采用体积分数为70％-100％甲醇水溶液，进一步优选采用体积分数为70％～80％甲醇水溶液。

本发明以百乐眠胶囊内容物为供试品，可将百乐眠胶囊内容物在溶剂中溶解后经过过滤，例如微孔滤膜过滤，即可得到供试品溶液。供试品溶液的溶剂可采用甲醇、水或者甲醇水混合溶液，优选采用甲醇水溶液，更优选采用体积分数为70％-100％甲醇水溶液，进一步优选采用体积分数为70％～80％甲醇水溶液。

在制备供试品溶液的过程中，可采用在溶液中超声或加热回流的方式加快或促进供试品的溶解。实验发现，供试品溶液制备过程中分别采用超声与回流条件，在其他条件相同的情况下，按本发明方法分别得到的两种指纹图谱色谱峰行为基本一致，部分色谱峰峰面积有所不同；回流条件下，10个主要色谱峰相对含量均高于超声条件下其相对含量，其中峰22相对含量RSD值差异较大，故在优选条件下，选择回流进行供试品的提取。

本方法中的色谱条件可按现有方法中的各种具体条件，但现有条件有各种各样，我们发现采用以下HPLC色谱条件时可以最有效地维持本方法的精密度、重复性和稳定性：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温25～35℃，流速为0.8-1.2mL/min，检测波长为230-280nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.06-0.2％磷酸水溶液为流动相B，在体积比为5～80:95～20的范围内梯度洗脱。

本发明中采用乙腈-磷酸-水的流动相体系，可以得到归属药材多且清晰、峰面积合适、杂峰干扰小的指纹图谱，利用该图谱可以更准确并有效地对百乐眠胶囊的质量进行监测，而采用其他流动相，例如乙腈-水、甲醇-磷酸-水、甲醇-乙腈-磷酸-水等体系，则难以同时达到上述要求。另外，本方法中对流动相B中磷酸的浓度也有明显要求，其体积分数需在0.06-0.2％范围内，优选0.06-0.18％、更优选0.08-0.15％、最优选0.1％。实验发现，流动相B中磷酸的含量过高或过低时，不仅会严重影响主要色谱峰的峰面积，还会影响主要色谱峰的出峰，造成色谱中某一或某些主要特征峰的缺失，从而影响所得指纹图谱的质量。

本发明中的色谱柱可采用C18色谱柱，具体可采用Kromasil 100-5C18(4.6*250mm， 5um)、Agilent ZORBAX SB C18(4.6*250mm，5um)、Shim pack VP-ODS C18(4.6*250mm， 5um)等，在综合考虑主要特征峰的分离效果、色谱峰保留时间等情况下，优选采用Agilent ZORBAX SB C18色谱柱。

本方法中的检测波长为230-280nm，优选240-280nm，过低的检测波长会造成部分特征峰与其他峰的峰面积差异较大，且会产生过多的干扰峰影响基线，过大的检测波长会影响部分特征峰的出峰，也会造成部分特征峰与其他峰的峰面积差异较大。

一种更优选的HPLC色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为256nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～30min，A：B为 5％：95％→15％：85％；30～60min，A：B为15％：85％→22％：78％；60～70min，A：B 为22％：78％→28％：72％；70～90min，A：B为28％：72％→45％：55％；90～100min， A：B为45％：55％→60％：40％；100～105min，A：B为60％：40％→80％：20％；105～110min， A：B为80％：20％；110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％。

本方法中，得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱后，利用现有的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经过数据导入、多点校正、数据匹配，即可分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。其中的中药色谱指纹图谱相似度评价系统可采用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，例如中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。

本发明提供了一种具体的百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将百乐眠胶囊内容物加溶剂，称重，回流或超声溶解，冷却至室温，补重，滤过，取续滤液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加溶剂分别制成每1mL含有20～195μg槲皮苷、40～135μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、16～144μg五味子醇甲、24～216μg丹酚酸B和4～12μg大黄素的对照品溶液；(在一种优选方案中，制成每1mL含有60～70μg槲皮苷、40～50μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、45～51μg五味子醇甲、69～75μg丹酚酸B和4～12μg大黄素的对照品溶液)；

(3)HPLC色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温25～35℃，流速为0.8-1.2mL/min，检测波长为230-280nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.06-0.2％磷酸水溶液为流动相B，在体积比为5～80:95～20的范围内梯度洗脱。

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5～20μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱；

(5)利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经液相色谱数据导入、多点校正和数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

本发明提供了一种更具体的百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物(如1.0g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70％-100％甲醇水溶液(如25mL)，称定重量，加热回流30-90min或超声20-40min进行溶解，放冷，用体积分数为70％-100％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加体积分数为70％-100％甲醇水溶液分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯 -2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为256nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～30min，A：B为5％：95％→ 15％：85％；30～60min，A：B为15％：85％→22％：78％；60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；70～90min，A：B为28％：72％→45％：55％；90～100min，A：B为45％： 55％→60％：40％；100～105min，A：B为60％：40％→80％：20％；105～110min，A：B 为80％：20％；110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％。

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液5～20μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经液相色谱数据导入、多点校正和数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

本发明提供了另一种更具体的百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70％甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流30min或超声30min进行溶解，放冷，用体积分数为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加体积分数为70％甲醇水溶液分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′--四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为256nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～30min，A：B为5％：95％→ 15％：85％；30～60min，A：B为15％：85％→22％：78％；60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；70～90min，A：B为28％：72％→45％：55％；90～100min，A：B为45％： 55％→60％：40％；100～105min，A：B为60％：40％→80％：20％；105～110min，A：B 为80％：20％；110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％。

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经液相色谱数据导入、多点校正和数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

通过本发明的方法，可以得到一种百乐眠胶囊指纹图谱，该指纹图谱共有峰包括和 2,3,5,4′--四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷对应的8号峰、和槲皮苷对应的9号峰(S峰)、和丹酚酸B对应的13号峰、和五味子醇甲对应的17号峰、和大黄素对应的19号峰，其相对保留时间分别为0.818、1.000、1.328、1.835、1.957，这些共有峰可分别归属于首乌藤、合欢花、丹参、五味子、首乌藤药材。

进一步的，本发明得到的百乐眠胶囊指纹图谱中，其共有峰还包括相对保留时间为 0.213的1号峰、相对保留时间为0.240的2号峰、相对保留时间为0.415的3号峰、相对保留时间为0.680的4号峰、相对保留时间为0.747的5号峰、相对保留时间为0.764的6 号峰、相对保留时间为0.796的7号峰、相对保留时间为1.062的10号峰、相对保留时间为1.124的11号峰、相对保留时间为1.221的12号峰、相对保留时间为1.428的14号峰、相对保留时间为1.520的15号峰、相对保留时间为1.547的16号峰、相对保留时间为1.911 的18号峰、相对保留时间为1.987的20号峰、相对保留时间为2.050的21号峰、相对保留时间为2.106的22号峰、相对保留时间为2.122的23号峰、相对保留时间为2.156的 24号峰。

本方法所建立的百乐眠胶囊指纹图谱基本代表百乐眠胶囊的物质基础，将其应用于检测时可更有效地监控百乐眠胶囊的质量，为百乐眠胶囊的生产和使用提供了更准确和精密的方法。

本发明还提供的上述方法在百乐眠胶囊的质量检测和质量控制中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明所提供的方法建立的百乐眠胶囊HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.95，能有效表征其质量。

(2)本发明建立了百乐眠胶囊HPLC指纹图谱共有模式，标定了24个共有峰，指认了5个共有特征峰，24个共有峰归属于百乐眠胶囊处方中多味药材。本法选择9号峰槲皮苷作为指纹图谱中的参照峰，确定了各共有峰的相对保留时间。

(3)本发明建立百乐眠胶囊指纹图谱的方法，具有良好的稳定性、精密度、重复性等优点，获得的对照指纹图谱能够客观评价百乐眠胶囊的质量，可以用于百乐眠胶囊生产过程监测及质量控制中，从而确保百乐眠胶囊质量的稳定性和均一性，保证临床用药的安全性和有效性。

附图说明

图1为5种对照品HPLC色谱图；

图中，A:2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷，B:槲皮苷对照品，C:丹酚酸B对照品，D:五味子醇甲对照品，E:大黄素对照品；

图2是本发明测得的百乐眠胶囊的共有模式图谱；

图中，8.2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷，9.槲皮苷，13.丹酚酸B，17.五味子醇甲，19.大黄素；

图3是13个批次百乐眠胶囊指纹图谱叠加图谱；

图4为首乌藤药材指纹图谱色谱图；

图5为百合药材指纹图谱色谱图；

图6为合欢花药材指纹图谱色谱图；

图7为远志药材指纹图谱色谱图；

图8为灯心草药材指纹图谱色谱图；

图9为地黄药材指纹图谱色谱图；

图10为五味子药材指纹图谱色谱图；

图11为丹参药材指纹图谱色谱图；

图12为刺五加药材指纹图谱色谱图；

图13为乙腈-水体系的指纹图谱图；

图14为乙腈-0.05％磷酸体系的指纹图谱图；

图15为乙腈-0.1％磷酸体系的指纹图谱图；

图16为乙腈-0.2％磷酸体系的指纹图谱图；

图17为λ＝210nm的指纹图谱图；

图18为λ＝230nm的指纹图谱图；

图19为λ＝256nm的指纹图谱图；

图20为λ＝286nm的指纹图谱图；

图21为λ＝300nm的指纹图谱图；

图22为λ＝320nm的指纹图谱图；

图23为λ＝335nm的指纹图谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于以下各实施例。

实施例1：

本实施例百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70％甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，用体积分数为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密取称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′-—四羟基二苯乙烯-2-O-D 葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加体积分数为70％甲醇水溶液分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件的确定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以ZORBAXSB-C18(250mm×4.6mm、5μm)为色谱柱，柱温30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为256nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、 B的比例变化为：0～30min，A：B为5％：95％→15％：85％；30～60min，A：B为15％： 85％→22％：78％；60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；70～90min，A：B为28％： 72％→45％：55％；90～100min，A：B为45％：55％→60％：40％；100～105min，A：B 为60％：40％→80％：20％；105～110min，A：B为80％：20％； 110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％。

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，经数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

实施例2：

本实施例百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70％甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流60min，放冷，用体积分数为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密取称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′—四羟基二苯乙烯-2-O-D 葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加体积分数为70％甲醇水溶液分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件的确定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以ZORBAXSB-C18(250mm×4.6mm、5μm)为色谱柱，柱温25℃，流速为0.8mL/min，检测波长为250nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.05％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、 B的比例变化为：0～30min，A：B为5％：95％→15％：85％；30～60min，A：B为15％：85％→22％：78％；60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；70～90min，A：B为28％： 72％→45％：55％；90～100min，A：B为45％：55％→60％：40％；100～105min，A：B 为60％：40％→80％：20％；105～110min，A：B为80％：20％； 110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％。

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，经数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

实施例3：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流90min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密取称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′—四羟基二苯乙烯-2-O-D 葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加甲醇分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件的确定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以ZORBAXSB-C18(250mm×4.6mm、5μm)为色谱柱，柱温35℃，流速为1.2mL/min，检测波长为265nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、 B的比例变化为：0～30min，A：B为5％：95％→15％：85％；30～60min，A：B为15％： 85％→22％：78％；60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；70～90min，A：B为28％： 72％→45％：55％；90～100min，A：B为45％：55％→60％：40％；100～105min，A：B 为60％：40％→80％：20％；105～110min，A：B为80％：20％； 110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％。

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，经数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

实施例4：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70％甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，用体积分数为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密取称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D 葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加体积分数为70％甲醇水溶液分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件的确定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以Shim-pack VP-ODS C18(250mm×4.6mm、5μm)为色谱柱，柱温30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为286nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：0～30min，A：B为5％：95％→15％：85％；30～60min，A： B为15％：85％→22％：78％；60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；70～90min， A：B为28％：72％→45％：55％；90～100min，A：B为45％：55％→60％：40％；100～105min， A：B为60％：40％→80％：20％；105～110min，A：B为80％：20％； 110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％。

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，经数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

实验例:

1仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD检测器)；ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm、5μm)为色谱柱；METTLER TOLEDO电子天平(XS205DU型)；超声波清洗器(KH-700DB 型，昆山禾创超声仪器)；普析通用超纯水器(GWA-UN2-C30型)；水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)

1.2试药

槲皮苷对照品(批号：11538-201105，含量：92.7％)、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D 葡萄糖苷对照品(批号：110844-201512，含量：91.0％)、五味子醇甲对照品(批号：110857-201513，含量：99.9％)丹酚酸B对照品(批号：111562-201313，含量：97.0％)、大黄素对照品(批号：110756-201512，含量：98.7％)，以上对照品均购自中国药品生物制品鉴定研究院。

百乐眠胶囊(批号：16111541、16111641、16112141、16112541、16112641、16112741、 16112841、16120541、16120641、16120741、16120841、16121241、16121341，依次编号为S1-S13)由扬子江药业集团有限公司生产，首乌藤、百合、合欢花、远志、灯心草、地黄、玄参、丹参、五味子、刺五加、茯苓、酸枣仁、麦冬均由扬子江药业集团有限公司提供，经测定符合中国药典2015年版一部项下的有关要求。

乙腈、甲醇均为色谱纯(美国天地)，水为超纯水，磷酸为色谱纯(阿拉丁)。

2流动相的梯度洗脱程序

表1梯度洗脱程序

3百乐眠胶囊指纹图谱的建立

按如下方法建立百乐眠胶囊的指纹图谱

取槲皮苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、五味子醇甲、丹酚酸B、大黄素5种对照品溶液，以及13个批次经现行标准检测合格的百乐眠胶囊(批号：16111541、16111641、16112141、16112541、16112641、16112741、16112841、16120541、16120641、16120741、16120841、16121241、16121341)制备的供试品溶液，按照实施例1的方法建立百乐眠胶囊的指纹图谱。

将图谱导入指纹图谱相似度评价软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版) 分析，以S1批次样品图谱为参照图谱，以中位数法，多点校正，生成叠加色谱图(见图3)和对照图谱(见图2)。将13批百乐眠胶囊指纹图谱与生成的对照指纹图谱进行相似度分析，结果显示13批百乐眠胶囊的指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.95，见表2。表2 13批百乐眠胶囊指纹图谱相似度

经与5种对照品比对，确定42.401min峰为2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷 (8号峰)、51.808min峰为槲皮苷(9号峰)、68.798min峰为丹酚酸B(13号峰)、95.043min 峰为五味子醇甲(17号峰)、101.371min峰为大黄素(19号峰)。其中，选取分离度较好，峰面积较大且稳定，保留时间适中的槲皮苷峰为参照峰(S)。以槲皮苷为参照峰的HPLC指纹图谱共确定24个共有峰。以参照峰的相对保留时间为1，计算其它各共有峰的相对保留时间，结果见表3。

4方法学考察

4.1精密度试验

取百乐眠胶囊(批号:16102541)，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中色谱条件连续进样6针，得到6张色谱图。以槲皮苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算RSD值，结果见表4和表5。

表4百乐眠胶囊指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表5百乐眠胶囊指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表4和表5可知，各共有色谱峰的相对峰面积RSD＜5％，相对保留时间RSD＜2％，说明该方法精密度良好。

4.2重复性试验

取百乐眠胶囊(批号:16102541)，平行称取6份，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，得到6张色谱图。以槲皮苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算RSD值，结果见表6和表7。

表6百乐眠胶囊指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表7百乐眠胶囊指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表6和表7可知，各共有色谱峰的相对峰面积RSD＜5％，相对保留时间RSD＜2％，说明该方法重复性较好。

4.3稳定性试验

取百乐眠胶囊(批号:16102541)，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件，分别于0h、8h、12h、18h、24h、28h、30h条件进样，得到7张色谱图。以槲皮苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算RSD值，结果见表8和表9。

表8百乐眠胶囊指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表9百乐眠胶囊指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表8和表9可知，各共有色谱峰的相对峰面积RSD＜5％，相对保留时间RSD＜2％，说明供试品溶液在30h内基本稳定。

5百乐眠胶囊样品与各原料药材指纹图谱相关性及共有峰归属分析

按实施例1方法测定百乐眠胶囊中各药材的指纹图谱，通过DAD检测器对百乐眠胶囊样品指纹图谱与各药材指纹图谱中色谱峰的紫外吸收进行分析，并将各药材指纹图谱分别和百乐眠胶囊对照图谱导入指纹图谱相似度评价软件中(中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版)，通过比较色谱峰保留时间标示其对共有峰的贡献，最终确定百乐眠胶囊样品指纹图谱中共有色谱峰在药材图谱上的归属峰。

5.1首乌藤药材指纹图谱

首乌藤药材指纹图谱色谱图见图4，共有峰归属见表10

表10样品共有峰归属首乌藤药材

5.2百合药材指纹图谱

百合药材指纹图谱色谱图见图5，共有峰归属见表11

表11样品共有峰归属百合药材

5.3合欢花药材指纹图谱

合欢花药材指纹图谱色谱图见图6，共有峰归属见表12

表12样品共有峰归属合欢花药材

5.4远志药材指纹图谱

远志药材指纹图谱色谱图见图7，共有峰归属见表13

表13样品共有峰归属远志药材

5.5灯心草药材指纹图谱

灯心草药材指纹图谱色谱图见图8，共有峰归属见表14

表14样品共有峰归属灯心草药材

5.6地黄药材指纹图谱

地黄药材指纹图谱色谱图见图9，共有峰归属见表15

表15样品共有峰归属地黄药材

5.7五味子药材指纹图谱

五味子药材指纹图谱色谱图见图10，共有峰归属见表16

表16样品共有峰归属五味子药材

5.8丹参药材指纹图谱

丹参药材指纹图谱色谱图见图11，共有峰归属见表17

表17样品共有峰归属丹参药材

5.9刺五加药材指纹图谱

刺五加药材指纹图谱色谱图见图12，共有峰归属见表18

表18样品共有峰归属刺五加药材

百乐眠胶囊与各药材指纹图谱共有峰归属分析：

如图4-12所示，百乐眠胶囊指纹图谱中的24个共有峰，在处方的首乌藤、百合、合欢花、远志、灯心草、地黄、五味子、丹参、刺五加9味药材指纹图谱中，基本找到明确归属。处方中茯苓、酸枣仁、麦冬、玄参在该色谱条件下，没有发现百乐眠胶囊指纹图谱中的共有峰。处方中珍珠母、石膏为矿物质药材，故未进行检测。

由此可见，该指纹图谱基本能代表百乐眠胶囊的物质基础。

对比例1

按实施例1的方法，取百乐眠胶囊(批号16102541)，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别采用乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.2％磷酸体系为流动相，吸取相同体积的同一供试品溶液进样分析，比较不同酸浓度色谱条件下，指纹图谱中色谱峰的差异，见图13至图16。

由以上色谱图可知，采用乙腈-水与乙腈-0.05％磷酸体系，10个主要色谱峰中的13 号色谱峰(T＝68min左右)均不存在，色谱图中无10.8min左右色谱峰或峰面积较小，且在19min左右只存在1个色谱峰。

0.1％磷酸与0.2％磷酸体系色谱峰行为基本一致，且主要色谱峰峰面积无明显差异， 0.1％磷酸条件出现10.8min色谱峰，0.2％磷酸体系此峰不存在，0.2％磷酸条件出现12.6min 色谱峰，0.1％磷酸条件此峰不存在，10.8min与12.6min色谱峰极性较大，峰面积较小。对比例2

按实施例1的方法，选择有代表性的210nm、230nm、256nm、286nm、300nm、320nm、335nm波长进行指纹图谱检测波长的考察，见图17至图23。

210nm、230nm波长下，10个主要特征峰均存在，8号峰峰面积与其它峰峰面积差异较大，图谱中在60～90min，基线不稳，干扰峰较多。对比256nm、286nm、300nm，可以看出286nm与300nm波长下9号与17号峰较小，且100min后均存在某些成分未出峰的现象；256nm波长下，主要特征峰的吸收强度差异较小，基线稳定，所需考察的指纹图谱峰均存在。320nm、335nm波长下，17号峰均未出峰，8号峰与其它峰峰面积差异较大，同时也存在100min后某些成分未出峰的现象。

Claims (4)

1.一种百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70％-100％甲醇水溶液，称定重量，加热回流30-90min或超声20-40min进行溶解，放冷，用体积分数为70％-100％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′—四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加体积分数为70％-100％甲醇水溶液分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为256nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：

0～30min，A：B为5％：95％→15％：85％；

30～60min，A：B为15％：85％→22％：78％；

60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；

70～90min，A：B为28％：72％→45％：55％；

90～100min，A：B为45％：55％→60％：40％；

100～105min，A：B为60％：40％→80％：20％；

105～110min，A：B为80％：20％；

110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％；

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液5～20μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经液相色谱数据导入、多点校正和数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于其包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取百乐眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70％甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流30min或超声30min进行溶解，放冷，用体积分数为70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取槲皮苷对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷对照品、五味子醇甲对照品、丹酚酸B对照品、大黄素对照品，加体积分数为70％甲醇水溶液分别制成每1mL含65μg槲皮苷、45μg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-D葡萄糖苷、48μg五味子醇甲、72μg丹酚酸B、4μg大黄素对照品溶液；

(3)HPLC色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为256nm，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为：

0～30min，A：B为5％：95％→15％：85％；

30～60min，A：B为15％：85％→22％：78％；

60～70min，A：B为22％：78％→28％：72％；

70～90min，A：B为28％：72％→45％：55％；

90～100min，A：B为45％：55％→60％：40％；

100～105min，A：B为60％：40％→80％：20％；

105～110min，A：B为80％：20％；

110～113min，A：B为80％：20％→5％：95％；

(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液、对照品溶液的液相色谱；

(5)利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经液相色谱数据导入、多点校正和数据匹配，分析得到百乐眠胶囊指纹图谱。

3.根据权利要求1～2中任意一项所述的百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法，其特征在于所述色谱柱采用C18色谱柱。

4.权利要求1～2中任意一项所述的百乐眠胶囊指纹图谱的建立方法在百乐眠胶囊的质量检测或质量控制中的应用。

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