CN111562324B - 一种消乳散结胶囊多指标成分含量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种消乳散结胶囊多指标成分含量检测方法，该检测方法采用HPLC‑DAD法同时测定本发明药物制剂中的芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷和丹皮酚6个成分的含量。采用的6种成分为参照标准的可起到全面检测药物内在质量及稳定性的作用，以保证其该产品用药的安全性和有效性。

Description

一种消乳散结胶囊多指标成分含量检测方法

技术领域

本发明涉及属于药物成分检测分析领域，尤其具体涉及一种消乳散结胶囊多指标成分含量检测方法。

背景技术

本发明所述的药物制剂是由柴胡、白芍、香附、夏枯草、当归、黄芩、丹参、牡丹皮等十六药组成。该药物制剂的组方制备成的上市药品是山东步长神州制药有限公司的妇科核心口服制剂产品(消乳散结胶囊)，具有疏肝解郁，化痰散结，活血止痛的功效，在中医临床上用于肝郁气滞，痰淤凝聚所致的乳腺增生，乳膀胀痛的疾病。该药国药准字号为Z20055636，现今执行的国家药品标准编号为WS3－056(Z-010)-2001(Z)，有研究表明其临床疗效优于单纯西药组，在疗效和安全性方面有着自己独特的优势。本申请人对该产品之前已经申请多件发明专利申请：其专利申请号为02153458.6、200410022071.8、201110284980.9、201110285687.4、201110285688.9、201110285686.X，上述专利保护内容主要集中在处方、生产工艺、滴丸等以及子宫肌瘤临床新用途方面。而目前该产品的执行标准为国家食品药品监督管理局标准WS-11330(ZD-1330)-2002-2011Z，但其质量检测方法仅对α-香附酮、当归对照药材、黄芩苷进行薄层鉴别(TLC)，以及芍药苷单一指标成分进行含量测定，对产品的质量控制方式尚且单一，需要进行更深入的研究。

对现有技术文献中涉及到“本发明药物制剂含量”测定方法进行系统检索整理分析如下，该含量检测方法主要包括：高效液相色谱，薄层鉴别等。如张磊，闫勇，消乳散结胶囊质量标准研究，广东化工，2016-06。该文章采用TLC法对消乳散结胶囊中丹参、香附、当归、黄芩、玄参、牡丹皮进行鉴别；采用HPLC法对白芍及牡丹皮中芍药苷进行了含量测定。史亚军，唐志书等人，消乳散结胶囊提取工艺中芍药苷转移率探究，中国医药生物技术，2011-08。周灿，安军等人，该文章介绍了：采用以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡对照药材进行薄层色谱鉴别，并以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d为指标进行液相色谱测定。张静，杨俊，HPLC法测定消乳散结胶囊中芍药苷的含量，该文章采用HPLC法,色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液(25∶75)，流速为1.0mL/min，检测波长为230nm，柱温为室温。但上述含量检测方法并未对消乳散结胶囊中的各味中药关键组分测定，不能体现该中成药的内在质量评价体系。

据深入研究发现本发明药物组成中芍药苷是白芍和牡丹皮的主要有效成分，具有抗抑郁、调节免疫、镇静催眠等多种药理作用；夏枯草和丹参中均含有迷迭香酸，具有抗氧化、抗抑郁活性。黄芩苷、汉黄芩苷作为黄芩药材的质控指标，具有抗炎、抗病毒、抗癌活性，丹酚酸B作为丹参活性最高的成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，牡丹皮的指标性成分丹皮酚可保护心脑血管系统、促进微循环等。

由于本发明药物制剂是由多种中药材经过加工、炮制、提取、加工等步骤制备而成，其包括多个药效成分的综合效应的结果，而中药制剂的多中心多靶点特点使得单一成分或指标难以表达中药的质量，采用中药指纹图谱这种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。为了更全面地评价本发明药物的质量，完善其质量评价标准，根据本发明药物处方组成与《中国药典》2015年版中记载的本发明药物的上市制剂消乳散结的质量标准，再结合药理活性来确定质量控制指标。

发明内容

本发明的目的是提供一种消乳散结胶囊多指标成分含量检测方法，该检测方法采用HPLC-DAD法同时测定本发明药物制剂中芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷和丹皮酚6个成分的含量。该检测方法同时结合化学计量学分析进行综合评价，可为本发明药物制剂的内在质量控制提供科学参考依据。该检测方法克服现有技术中薄层色谱法和单一成分检测方法的缺陷。采用的6种成分为参照标准的可起到全面检测本发明药物制剂的内在质量及稳定性的作用，以保证其该产品用药的安全性和有效性。

本发明药物制剂的组方是由柴胡、白芍、香附、夏枯草、当归、黄芩、丹参、牡丹皮等十六药组成，该组成配比为：柴胡84g、白芍84g、香附63g、玄参84g、昆布105g、瓜蒌63g、夏枯草105g、牡蛎84g、当归63g、猫爪草84g、黄芩63g、丹参84g、土贝母42g山慈菇21g、全蝎21g、牡丹皮84g。

本发明药物制剂的制备方法为：以上十六味药材，其中香附、全蝎、牡丹皮三味，粉碎成细粉，备用；柴胡、当归、玄参、丹参、土贝母五味，加60％乙醇回流提取二次，每次1.5小时，滤过，滤液减压回收乙醇，清膏备用；另取白芍等其余八味，加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.08～1.10(60℃)的清膏，加乙醇使含醇量达50％，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，加入上述清膏，并继续浓缩至相对密度为1.32～1.35(60℃)的稠膏，减压干燥，粉碎，与上述细粉混匀，加入淀粉，混匀，即得。本发明药物制剂不局限于所研究对象特指的消乳散结胶囊，其还包括柴胡、白芍、香附、夏枯草、当归、黄芩、丹参、牡丹皮等相类似中药材制备而成的药物制剂。

本发明药物制剂加入药用辅料制成药剂学上允许的常用药物口服制剂，如：胶囊剂、片剂、口服液、丸剂、颗粒剂等。

本发明药物制剂含量检测方法所提供的技术方案如下：

一种消乳散结胶囊多指标成分含量检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)、供试品溶液的制备：取本发明药物制剂内容物适量混匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入60～80％甲醇溶剂，超声处理20～40min，取出，放冷，用60～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤膜，即得；

(2)、混合对照品标准液的制备：分别精密称取迷迭香酸、汉黄芩苷、芍药苷、黄芩苷、丹酚酸B、丹皮酚对照品，再加60～80％甲醇溶解并稀释至刻度，即得；

(3)、阴性样品溶液的制备：按照本发明消乳散结胶囊处方工艺分别制备缺少炒白芍和牡丹皮、夏枯草、黄芩、丹参的阴性样品，在依照“步骤1”项下方法制成阴性样品溶液；

(4)、色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～5min，15％A；5～20min，15％A→20％A；20～30min，20％A→24％A；30～50min，24％A→43％A)；检测流速：0.8～1.2mL·min^-1，检测波长：230～280nm，检测柱温：23～27℃；

(5)、色谱峰测定：将上述步骤⑴、⑵和⑶所制得的供试品、对照品溶液、阴性样品溶液，注入液相色谱仪，按照上述步骤⑷的色谱条件，测定记录色谱图，即得。

作为本发明药物制剂含量检测方法液的制备中，所述甲醇浓度为70％。

所述步骤⑵对照品标准液的制备中，其中所述迷迭香酸的浓度为2.48～99.2μg·mL^-1、汉黄芩苷的浓度为2.60～104.0μg·mL^-1、芍药苷的浓度为16.13～645.2μg·mL^-1、黄芩苷的浓度为11.41～456.4μg·mL^-1、丹酚酸B的浓度为9.80～392.0μg·mL^-1、丹皮酚的浓度为15.26～610.4μg·mL^-1。

所述步骤⑷色谱条件，所述色谱柱型号为：Hypersil GOLD C₁₈。

所述步骤⑷色谱条件，所述检测流速0.8～1.2mL·min^-1。

所述步骤⑷色谱条件，所述检测波长为230nm。

所述步骤⑷色谱条件，所述检测柱温为：25℃。

为了突出本发明药物制剂含量检测方法技术方案创新性，我们将本实验过程中筛选的部分实验提供如下。

①、检测波长的选择

对于药物制剂复杂体系的含量测定，检测波长的选择至关重要。参考相关文献报道基础上，本试验对供试品溶液进行全波长扫描，结合各成分的最大吸收波长，芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚的最大吸收波长分别在230nm、330nm、280nm、286nm、280nm、274nm，并能使各成分有较高响应，最终确定230nm，此波长可同时兼顾六个成分，响应和峰形较好。

②、柱温的选择

试验中发现柱温对芍药苷、黄芩苷和丹酚酸B的分离度有较大影响，故考察不同的温度(20，25，30，35℃)，柱温高于25℃时黄芩苷和丹酚酸B的分离度不佳，柱温20和25℃时，芍药苷峰形较好，且黄芩苷和丹酚酸B的分离度能够达到要求，但waters仪器控制20℃有波动，对保留时间有所影响，因此综合考虑，选择25℃作为柱温。

③、其他指标成分探索

本发明药物制剂(消乳散结胶囊)的疏肝解郁功效相对应的主要为柴胡的功效，本试验也尝试测定柴胡中代表性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，但未能检测出相关色谱峰，初步分析醋柴胡所含的经过醋制或提取工艺后，其化学成分发生了变化。共有模式图3中3号峰为当归中阿魏酸，但未达到定量限，因此本试验不再进行定量考察。

本发明药物制剂含量检测方法具有以下有益效果：

(1)药物制剂中芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚均能达到基线分离，其线性关系良好，13批消乳散结胶囊中上述6个成分的含量测定结果分别为2.592～4.509、0.582～0.978、2.343～3.743、2.373～4.743、0.522～1.049、2.949～3.928mg·g^-1。化学计量学分析表明不同批次产品存在一定差异，区分各类样品的强特征峰为芍药苷、丹酚酸B和黄芩苷，本发明所建立的检测方法准确、专属性强，可用于消乳散结胶囊的质量控制。

⑵、本发明建立上述成分的含量检测方法，其精密度试验测定结果显示，芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚峰面积精密度RSD≤0.8％，其稳定性试验结果显示，测定峰面积。芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚峰面积分别为RSD≤1.6％。其稳定性试验结果显示，测定峰面积。芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚峰面积分别为RSD分别为RSD≤1.6％。其重复性试验结果可知，芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚峰面积分别为RSD为≤1.8％。其芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚峰面积平均回收率分别为100.2％、96.8％、99.6％、97.6％、97.4％、100.3％，RSD均≤1.44％，由此可知，本发明所采用的检测方法的精密度、稳定性、重复性良好。综上所述，本发明药物制剂的检测方法检测指标成分全面、高效、准确度高的特点，在该产品工艺化大生产质量控制检测应用中有广阔的前景。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。本发明所述供试品为消乳散结胶囊。

图1-芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚混合对照品HPLC色谱图；

图2-供试品溶液HPLC色谱图；

图3-缺少白芍、牡丹皮阴性溶液HPLC色谱图；

图4-缺少丹参阴性溶液HPLC色谱图；

图5-缺少夏枯草阴性溶液HPLC色谱图；

图6-缺少黄芩阴性溶液HPLC色谱图；

其中图1-图6的HPLC色谱图(图中标记色谱峰，其中上述图谱中1号峰为芍药苷、2号峰为迷迭香酸、3号峰为黄芩苷、4号峰为丹酚酸B、5号峰为汉黄芩苷、6号峰丹皮酚。

图7-供试品溶液样品含量雷达图；

图8-供试品溶液共有模式和特征峰色谱图，其中色谱图中标记的2号色谱峰为芍药苷、6号色谱峰为迷迭香酸、7号色谱峰黄芩苷、8号色谱峰丹酚酸B、10号色谱峰汉黄芩苷、12号色谱峰为丹皮酚。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1：

1仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱系统(Waters公司)；Chem Pattern 2017pro软件(科迈恩(北京)科技有限公司)。XSE205十万分之一电子天平(METTLER公司)；BK-600C超声波清洗仪(巴克超声设备有限公司)。

对照品芍药苷(批号110736-201539，以96.4％计)、迷迭香酸(批号111871-201706，以90.5％计)、黄芩苷(批号110715-201821，以95.4％计)、丹酚酸B(批号111562-201615，以96.2％计)、汉黄芩苷(批号112002-201702，以98.5％计)和丹皮酚(批号110708-201407，以99.9％计)均购于中国食品药品检定研究院；

本发明药物上市产品消乳散结胶囊13批(山东神州步长制药有限公司，批号170207、170301、180105、180404、180405、190410、190503、190504、190506、190910、191103、191204、191211)。

乙腈(Honeywell B&J)和磷酸(上海阿拉丁生物科技有限公司)均为色谱纯；其余试剂均为分析纯。Milli-Q超纯水(Millipore Co.)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～5min，15％A；5～20min，15％A→20％A；20～30min，20％A→24％A；30～50min，24％A→43％A)；流速：1.0mL·min^-1，检测波长：230nm，柱温：25℃，进样量10μL。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备

分别精密称取对照品迷迭香酸、汉黄芩苷对照品10.98、10.25mg，分别置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度为0.1088、0.1010mg·mL^-1的混合溶液。

分别精密称取对照品芍药苷、黄芩苷、丹酚酸B、丹皮酚对照品16.73、11.96、10.19、15.28mg，置同一100ml量瓶中，加入上述对照品溶液25ml，用70％甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚质量浓度分别为0.1613、0.0248、0.1141、0.0980、0.0260、0.1526mg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取消乳散结胶囊内容物适量混匀，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，超声(功率250W，频率40kHz)处理30min，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备

按照消乳散结胶囊处方工艺分别制备缺少炒白芍和牡丹皮、夏枯草、黄芩、丹参的阴性样品，依照“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液，HPLC色谱图参见说明书附图3-6。

2.3含量测定

2.3.1线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液适量，稀释为1、2、5、10、20、30、40倍的混合对照品溶液，精密吸取各混合对照品溶液10μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以测得的响应信号峰和被测成分的进样浓度用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的回归方程及线性范围，结果见表1。试验结果表明，各成分在各自的浓度范围内呈良好线性关系。同时以仪器的信噪比S/N为10时测定量限(LOQ)，结果见表1。

表1 6个成分的标准曲线

2.3.2精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，计算6个成分峰面积的RSD，结果芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚的RSD分别为0.5％、0.3％、0.1％、0.1％、0.8％、0.2％，结果表明仪器精密度良好。

2.3.3稳定性试验

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h，精密吸取10μL进样，按“2.1”项下色谱条件测定，测定峰面积。按峰面积计算，芍药苷、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、丹皮酚的RSD分别为1.6％、1.4％、0.9％、0.8％、1.2％、0.9％。结果表明该方法稳定性良好。

2.3.4重复性试验

取同一批号(批号190503)的消乳散结胶囊6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定6个成分的含量分别为3.697、0.940、3.501、3.228、0.824、3.771mg·g^-1，并计算RSD分别为1.3％、0.5％、0.6％、1.8％、1.1％、0.7％，结果表明该方法重复性良好。

2.3.5加样回收率试验

精密称取已知含量的样品(批号190503)0.5g，共6份。精密称定，置于锥形瓶中，分别精密加入芍药苷1.91mg、迷迭香酸0.40mg、黄芩苷1.88mg、丹酚酸B1.58mg、汉黄芩苷0.44mg、丹皮酚1.99mg。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算6个成分的回收率。结果见表3。试验结果表明该方法准确度良好。

2.3.6样品含量测定

取13批消乳散结胶囊适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定6个成分的含量，结果见表4。为进一步显示样品的含量特征，绘制了样品含量雷达图，见图2。

表2加样回收率试验(n＝6)

表3样品测定结果(mg·g^-1，n＝3)

根据样品含量的雷达图，各成分含量存在一定差异，轮廓在某些方向上有明显凹陷，表明该成分含量过低，如芍药苷含量集中在170207(样品的批号)、170301、180105、180404、180405偏低，与样品生产时间较长，已过产品有效期有关；黄芩苷170207、170301、190506、191103、191211相对较低，可说明黄芩不同批次投料，丹酚酸B 191204可反应出该批所用丹参质量情况，丹皮酚170207含量低与过有效期有关。

2.4化学计量学分析

将HPLC采集的色谱数据导入Chem Pattern化学计量学软件，对样品峰面积进行标准化处理，适当校正保留时间，得到样品叠加图谱，建立共有模式，参见附图8。13批样品进行夹角余弦相似度分析，相似度均在0.965以上，说明这些样品色谱行为较为一致。

聚类热图是在常规聚类分析基础上，横向对样品聚类，纵向对特征色谱峰聚类，热图颜色代表共有峰百分比峰面积。13批样品可大体聚为3类，样品12(191204)为一类，17年、18年样品聚为一类，其余7批聚为一类，区分各批次样品的强特征峰为丹皮酚、丹酚酸B、芍药苷，表明其对药品质量差异具有重要影响。雷达图和聚类热图分析结果表明样品间有一定差异，这说明夹角余弦相似度分析存在一定局限性。其局限性在于大峰掩盖小峰，这与文献的结论基本一致。

PCA作为最常见的一种降维分析方法，是将多个变量通过线性变换选出较少个数重要变量。PCA-载荷三维图表明，19年样品除去样品12更为集中紧凑，17年较为分散，离散度较大，PCA-2D图更加直观明显，根据各特征峰的载荷结果，可知2号、5号、7号、8号、12号峰具有较高的主成分载荷值，提示这5个特征峰是有效区别不同批次样品的强特征峰。排名前3个强特征峰为芍药苷、丹皮酚、丹酚酸B，与聚类分析结果一致。

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种消乳散结胶囊多指标成分含量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

⑴、供试品溶液的制备：取消乳散结胶囊内容物适量混匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入60～80％甲醇溶剂，超声处理20～40min，取出，放冷，用60～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤膜，即得；

⑵、混合对照品标准液的制备：分别精密称取迷迭香酸、汉黄芩苷、芍药苷、黄芩苷、丹酚酸B、丹皮酚对照品，再加60～80％甲醇溶解并稀释至刻度，即得；

⑶、阴性样品溶液的制备：按照消乳散结胶囊处方工艺分别制备缺少炒白芍和牡丹皮、夏枯草、黄芩、丹参的阴性样品，再依照“步骤1”项下方法制成阴性样品溶液；

⑷、色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，流动相A：乙腈，流动相B：0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱0～5min，15％A；5～20min，15％A→20％A；20～30min，20％A→24％A；30～50min，24％A→43％A；检测流速：0.8～1.2mL·min^-1，检测波长：230～280nm，检测柱温：23～27℃；

⑸、色谱峰测定：将上述步骤⑴、⑵和⑶所制得的供试品、对照品溶液、阴性样品溶液，注入液相色谱仪，按照上述步骤⑷的色谱条件，测定记录色谱图，即得。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤⑴供试品溶液的制备中，所述甲醇浓度为70％。

3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤⑵对照品标准液的制备中，其中所述迷迭香酸的浓度为2.48～99.2μg·mL^-1、汉黄芩苷的浓度为2.60～104.0μg·mL^-1、芍药苷的浓度为16.13～645.2μg·mL^-1、黄芩苷的浓度为11.41～456.4μg·mL^-1、丹酚酸B的浓度为9.80～392.0μg·mL^-1、丹皮酚的浓度为15.26～610.4μg·mL^-1。

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤⑷色谱条件，所述色谱柱型号为：Hypersil GOLD C ₁₈。

5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤⑷色谱条件，所述检测波长为230nm。

6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤⑷色谱条件，所述检测柱温为：25℃。

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