CN103728387A - 参芪降糖制剂hplc标准指纹图谱及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱及其构建方法，该构建方法，包括供试品溶液和对照品溶液的制备，采用线性梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%(v/v)磷酸水溶液，检测波长为203nm，柱温为25~35℃，流速为0.8~1.2mL/min，以高效液相色谱法进行测定，得参芪降糖制剂指纹图谱，以至少10批指纹图谱的共有特征峰作为标准指纹图谱的特征峰；标准指纹图谱共有38个特征峰，归属于人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、地黄、覆盆子的特征峰分别有13、4、7、3、4个。本发明方法及标准指纹图谱能全面、准确评价参芪降糖制剂的整体质量，有利于保证参芪降糖制剂的质量及临床疗效。

Description

参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种参芪降糖制剂的检测方法，特别涉及一种参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱的构建方法，以及由此法得到的参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱。

背景技术

中药指纹图谱系指中药原料药材、饮片、半成品、成品等经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其特征的共有峰的图谱。中药指纹图谱能客观地揭示和反映中药内在质量的整体性和特征性，用以评价中药的真实性、有效性、稳定性和一致性。中药的临床疗效并非由单一活性成分的作用或多种活性成分作用的简单相加，复方制剂更是如此。用已知某一个或几个活性成分或有效成分为质量指标，通过定性和定量分析来判断药品质量的优劣，显然是不全面的。中药质量的评价需要综合的、宏观的、非线性的质量评价体系，中药指纹图谱就是能较好地适应这一特点的一种质量评价与控制模式。在国际上，如日本、德国、美国、加拿大、印度等许多国家，对一些传统药、天然药和草药，都把指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。欧共体对草药质量的指南中也称，单靠测定某有效成分考察质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中规定：如果草药的活性成分不明，可以提供特征色谱图谱，以证明产品质量的一致。因此指纹图谱是中药现代化和国际化的关键技术之一。

参芪降糖制剂是纯中药制剂，由人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、山药、地黄、麦冬、茯苓、天花粉、泽泻、枸杞子、覆盆子十一味药材组成，具有益气养阴、滋脾补肾的功效，主治消渴症，用于II型糖尿病。该药有调节受体水平作用，对应激性高血糖、胰岛损伤性高血糖、糖代谢异常后的脂质过氧化物以及细胞受体有调节代谢作用。且能对人胚肺二倍体细胞的生长与代谢产生影响，特别是对晚代细胞的增殖和细胞内糖元含量有正向促进作用。

中华人民共和国卫生部部标准(WS₃-180(Z-35)-95(Z))所载参芪降糖片质量标准采用薄层色谱法分别以人参皂苷Re、Rg₁、Rb₁对照品和五味子对照药材在各特定色谱条件下的薄层斑点为对照鉴别，并采用薄层扫描测定人参皂苷Re的含量，其不足之处在于：①所采用的检测方法步骤繁琐，而且参芪降糖制剂含有十一味药材的有效成分，这并不能全面的反映该制剂的化学成分的种类和含量，也不能全面地对该制剂的质量进行监控，没有对其中主要多味药材中的化学成分进行全面、系统的检测。②不能全面监控中间体，成品的质量。

发明内容

为了解决上述问题，本发明建立了一种合理、准确评价参芪降糖片药品整体性质量的标准指纹图谱，以及该指纹图谱的构建方法。

本发明的目的在于提供一种参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱的构建方法。

本发明的另一目的在于提供参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱。

本发明所采取的技术方案是：

一种参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

1)制备参芪降糖制剂供试品溶液：粉碎参芪降糖制剂，置于带塞的锥形瓶中，加入甲醇，使参芪降糖制剂的浓度为40～60mg/mL，密塞，称定重量，超声处理30～60min，功率400W，频率40KHz，静置放冷，再称定重量，用甲醇弥补减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液，置蒸发皿中蒸干，残渣加去离子水使其溶解，去离子水的体积为滤液的0.4～0.8倍，再用去离子水饱和的正丁醇萃取3～4次，每次使用的去离子水饱和的正丁醇体积为滤液的0.6～1.0倍，合并每次萃取后的正丁醇液，置于蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即可；

2)对照品溶液的制备：称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素，加甲醇溶解，分别制成相对应的对照品溶液；

3)参芪降糖制剂的HPLC指纹图谱的建立：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，进样，用高效液相色谱仪测定，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分数为0.1％的磷酸水溶液，线性梯度洗脱，洗脱程序为：

检测波长为203nm，柱温为25～35℃，流速为0.8～1.2mL/min，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，即得到参芪降糖制剂HPLC指纹图谱；

4)参芪降糖制剂HPLC的标准指纹图谱：高效液相色谱仪测定至少10批芪降糖制剂样品供试品溶液的指纹图谱，并进行分析比较，得到由共有特征峰构成的指纹图谱为芪降糖制剂HPLC的标准指纹图谱。

进一步的，步骤1)所述的参芪降糖制剂是的剂型选自片剂、颗粒剂和胶囊剂。

进一步的，步骤1)所述的参芪降糖制剂由人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、山药、地黄、麦冬、茯苓、天花粉、泽泻、枸杞子、覆盆子11味药材制成。

参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱中有38个共有特征峰，从左到右编号为1至38，以编号28特征峰为参照峰分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至38的特征峰相对保留时间依次分别为：0.105～0.111min、0.115～0.121min、0.127～0.135min、0.154～0.162min、0.165～0.171min、0.246～0.251min、0.336～0.339min、0.368～0.370min、0.438～0.441min、0.542～0.544min、0.546～0.547min、0.590～0.592min、0.596～0.598min、0.616～0.622min、0.694～0.698min、0.708～0.710min、0.770～0.772min、0.813～0.819min、0.890～0.892min、0.904～0.906min、0.915～0.917min、0.929～0.931min、0.936～0.938min、0.938～0.942min、0.954～0.956min、0.962～0.966min、0.967～0.969min、1.000min、1.105～1.017min、1.048～1.409min、1.098～1.099min、1.180～1.182min、1.269～1.271min、1.324～1.326min、1.367～1.369min、1.403～1.406min、1.440～1.442min、1.473～1.475min。

进一步编号分别为1至38的38个共有特征峰中：

归属于人参茎叶皂苷的特征峰编号为15、16、18、19、20、21、23、25、26、27、28、30、32一共13个，其中15号峰为人参皂苷Rg₁、16号峰为人参皂苷Re、28号峰为人参皂苷Rd；

归属于黄芪的特征峰编号为10、17、22、24一共4个，其中10号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、24号峰为黄芪甲苷；

归属于五味子的共有峰编号为5、29、31、33、34、35、36一共7个，其中29号峰为五味子醇甲、35号峰为五味子甲素、36号峰为五味子乙素；

归属于地黄的特征峰编号为11、12、14一共3个，其中12号峰为毛蕊花糖苷；

归属于覆盆子的特征峰编号为7、13、37、38一共4个。

本发明的有益效果是：

1)本发明建立参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱，代表着参芪降糖制剂成品中大部分的化学成分，能有效地表征参芪降糖制剂成品的质量，从而实现对参芪降糖制剂最大可能的化学成分进行检测，有利于对成品质量的全面监控。

2)本发明建立参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱作为一个整体，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定参芪降糖制剂整体质量的片面性，本发明为更全面、准确评价参芪降糖制剂的质量提供了新的对照标准，将更加保证参芪降糖制剂的质量及其临床的疗效。

3)本发明具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好，适用于参芪降糖制剂的整体质量控制。

4)本发明建立的指纹图谱能够表达该产品的特征，给出了所有共有特征峰分别归属的原料药材，且给出了其中9个共有特征峰所代表的具体物质，具有较好的专属性。

5)本发明采用指纹图谱的检测方法，注重特征峰的联系性和整体性，全面反映复方制剂的内在特征和质量，避免了参芪降糖制剂质量控制的单一性和片面性，合理准确地评价药物的质量，保证制剂的有效性；并且还可以用于原料药材、中间体和成品制剂的定性检测，全方位控制药材的质量，适用范围广泛。

附图说明

图1是参芪降糖片在203nm波长处的HPLC参照指纹图谱；

图2是在203nm波长处混标的HPLC指纹图谱；

图3是参芪降糖片批间HPLC指纹图谱相似度评价结果示意图；

图4是参芪降糖片指纹图谱各成分峰归属图谱，该图中字母分别代表：a地黄；b黄芪；c人参茎叶皂苷；d五味子；e覆盆子；

图5是参芪降糖片精密度试验相似度评价结果示意图；

图6是参芪降糖片稳定性试验相似度评价结果示意图；

图7是参芪降糖片重复性试验相似度评价结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详述，但并不局限于此。

实施例1：

参芪降糖制剂是由人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、山药、地黄、麦冬、茯苓、天花粉、泽泻、枸杞子、覆盆子11味药材制成，其剂型包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂等药学上常见的剂型。

1、仪器与试药

仪器：LC-高效液相色谱仪(DAD检测器、LC-20AT泵、DGU-12A在线脱气机)，日本岛津公司；实验室专用超纯水机，重庆利迪现代水技术设备有限公司；CP225D型分析天平，德国sartorius公司；HWS24型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；KQ-400KPE超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6×250mmi.d.，5μm)。

试药：对照品

对照药材：人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、地黄、覆盆子均由广东万年青制药有限公司提供。

参芪降糖片：广东万年青制药有限公司产品，国药准字Z10920045，为片剂(薄膜衣)，每片重0.35g。

2、高效液相色谱的测定条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6×250mmi.d.，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分数为0.1％的磷酸水溶液为流动相B；洗脱方式为：线性梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长为：203nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。

表1梯度洗脱程序

3、HPLC指纹图谱的建立

1)供试品和对照品的制备

参芪降糖片供试品溶液的制备：取参芪降糖片研磨细粉2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理45分钟(功率400W，频率40KHz)，静置放冷，再称定重量，用甲醇弥补减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加水15mL使其溶解，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20mL，合并正丁醇液，正丁醇液置于蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移到5mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得参芪降糖片供试品；

对照品溶液的制备：精密称取适量的人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素适量，加甲醇溶解，分别制成相对应的对照品溶液；各对照品溶液的浓度分别为：人参皂苷Re浓度为0.76mg/mL、人参皂苷Rg1浓度为1.09mg/mL、人参皂苷Rd浓度为0.47mg/mL、黄芪甲苷0.21mg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为0.04mg/mL、毛蕊花糖苷浓度为0.02mg/mL、五味子醇甲浓度为0.13mg/mL、五味子甲素浓度为0.13mg/mL、五味子乙素浓度为0.09mg/mL。

2)参芪降糖片HPLC指纹图谱的建立

分别精密吸取对照品溶液和参芪降糖片供试品溶液各10μL，进样，用高效液相色谱仪测定，得到色谱图。比较供试品的指纹图谱和对照品的指纹图谱，确定各药材成分的色谱峰。以对照品的色谱峰相对保留时间的峰面积为1，计算供试品的在相应保留时间的相对峰面积，即得到参芪降糖片HPLC指纹图谱，见附图1，从附图1中可看出参芪降糖片HPLC指纹图谱中有1～38共38个特征峰。

对附图1中的主要峰进行定性，通过将参芪降糖片HPLC指纹图谱和对照品指纹图谱进行比较，确定10号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、12号峰为毛蕊花糖苷、15号峰为人参皂苷Rg₁、16号峰为人参皂苷Re、24号峰为黄芪甲苷、28号峰为人参皂苷Rd；29号峰为五味子醇甲；35号峰为五味子甲素；36号峰为五味子乙素，如附图2中所示的混标的指纹图谱。

3)参芪降糖片HPLC标准指纹图谱的建立

为了进一步确定附图1中所示的参芪降糖片HPLC指纹图谱具有代表性，以附图1中的指纹图谱为对照组，另取10批不同批号的参芪降糖片，按照同样的方法制备参芪降糖片供试品溶液，并通过高效液相色谱仪测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行数据处理：以该10批和对照组指纹图谱作为样本集，经软件系统生成指纹图谱间的对比图，如附图3，可见从附图1指纹图谱中的38个特征峰增均为共有特征峰；另外，计算该10批图谱和附图1图谱的相似度，评价批次间的稳定性，结果显示该10批样品与附图1间的相似度良好，均在0.80以上，如表2所示，说明附图1具有代表性，可作为参芪降糖片HPLC标准指纹图谱。

表2不同批参芪降糖片样品间的相似度

根据图3中的结果，计算各共有特征峰相对保留时间，采用峰28为参照峰(S)分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至38的共有特征峰相对保留时间依次分别为：0.105～0.111min、0.115～0.121min、0.127～0.135min、0.154～0.162min、0.165～0.171min、0.246～0.251min、0.336～0.339min、0.368～0.370min、0.438～0.441min、0.542～0.544min、0.546～0.547min、0.590～0.592min、0.596～～0.598min、0.616～0.622min、0.694～0.698min、0.708～0.710min、0.770～0.772min、0.813～0.819min、0.890～0.892min、0.904～0.906min、0.915～0.917min、0.929～0.931min、0.936～0.938min、0.938～0.942min、0.954～0.956min、0.962～0.966min、0.967～0.969min、1.000min、1.105～1.017min、1.048～1.409min、1.098～1.099min、1.180～1.182min、1.269～1.271min、1.324～1.326min、1.367～1.369min、1.403～1.406min、1.440～1.442min、1.473～1.475min。

4、参芪降糖片HPLC指纹图谱中各特征峰的归属

为了进一步确定附图1中38个特征峰分别属于原料药材中的哪种成分，进行以下实验。

1)原料药材供试品溶液的制备：分别将人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、地黄、覆盆子这五味原料药材，按照各味药的处方配比与处方工艺得到相应的原料药材中间品后，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理45分钟(功率400W，频率40KHz)，静置放冷，再称定重量，用甲醇弥补减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加水15mL使其溶解，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20mL，合并正丁醇液，正丁醇液置于蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移到5mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

上述原料药材人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、地黄、覆盆子均由广东万年青制药有限公司提供。

2)各原料药材HPLC指纹图谱的测定：

分别精密吸取各原料药材供试品溶液10μL，进样，用高效液相色谱仪测定，即得各原料药材HPLC指纹图谱，如附图4所示，其中：

归属于人参茎叶皂苷的特征峰为15、16、18、19、20、21、23、25、26、27、28、30、32一共13个，其中15号峰为人参皂苷Rg₁、16号峰为人参皂苷Re、28号峰为人参皂苷Rd；

归属于黄芪的特征峰为10、17、22、24一共4个，其中10号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、24号峰为黄芪甲苷；

归属于五味子的共有峰为5、29、31、33、34、35、36一共7个，其中29号峰为五味子醇甲、35号峰为五味子甲素、36号峰为五味子乙素；

归属于地黄的特征峰为11、12、14一共3个，其中12号峰为毛蕊花糖苷；

归属于覆盆子的特征峰为7、13、37、38一共4个。

5、精密度检测

取同一个参芪降糖片溶液，连续进样6次，得到指纹图谱，如附图5；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行评价，结果显示仪器精密度良好，相似度均大于0.8，如表3所示。

表3参芪降糖片指纹图谱精密度试验相似度结果

6、稳定性检测

取同一批参芪降糖片溶液，分别在0、4、8、12、24、48h进样，测得指纹图谱，如附图6；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行评价，结果显示样品稳定性良好，相似度均大于0.8，如表4所示。

表4参芪降糖片指纹图谱稳定性试验相似度结果

7、重复性检测

取同一批参芪降糖片6份，按照药材样品溶液制备方法制备，分别进样，测得指纹图谱，如附图7；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行评价，结果显示样品重复性良好，相似度均大于0.8，如表5所示。

表5参芪降糖片指纹图谱重复性试验相似度结果

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）制备参芪降糖制剂供试品溶液：粉碎参芪降糖制剂，置于带塞的锥形瓶中，加入甲醇，使参芪降糖制剂的浓度为40~60mg/mL，密塞，称定重量，超声处理30~60min，功率400W，频率40KHz，静置放冷，再称定重量，用甲醇弥补减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液，置蒸发皿中蒸干，残渣加去离子水使其溶解，去离子水的体积为滤液的0.4~0.8倍，再用去离子水饱和的正丁醇萃取3~4次，每次使用的去离子水饱和的正丁醇体积为滤液的0.6~1.0倍，合并每次萃取后的正丁醇液，置于蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即可；

2）对照品溶液的制备：称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素，加甲醇溶解，分别制成相对应的对照品溶液； 

3）参芪降糖制剂的HPLC指纹图谱的建立：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，进样，用高效液相色谱仪测定，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分数为0.1%的磷酸水溶液，线性梯度洗脱，洗脱程序为：

检测波长为203nm，柱温为25~35℃，流速为0.8~1.2mL/min，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，即得到参芪降糖制剂HPLC指纹图谱；

4）参芪降糖制剂HPLC 的标准指纹图谱：高效液相色谱仪测定至少10 批参芪降糖制剂样品供试品溶液的指纹图谱，并进行分析比较，得到由共有特征峰构成的指纹图谱为参芪降糖制剂HPLC 的标准指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤1）所述的参芪降糖制剂的剂型选自片剂、颗粒剂和胶囊剂。

3.根据权利要求1所述的一种参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤1）所述的参芪降糖制剂由人参茎叶皂苷、黄芪、五味子、山药、地黄、麦冬、茯苓、天花粉、泽泻、枸杞子、覆盆子11味药材制成。

4.根据权利要求1所述构建方法构建的参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱，其特征在于：该指纹图谱中有38 个共有特征峰，从左到右编号为1至38，以编号28特征峰为参照峰分别计算其他共有特征峰相对保留时间，编号为1至38的特征峰相对保留时间依次分别为：0.105~0.111 min、0.115~0.121 min、0.127~0.135 min、0.154~0.162 min、0.165~0.171 min、0.246~0.251 min、0.336~0.339 min、0.368~0.370 min、0.438~0.441 min、0.542~0.544 min、0.546~0.547 min、0.590~0.592 min、0.596~0.598 min、0.616~0.622 min、0.694~0.698 min、0.708~0.710 min、0.770~0.772 min、0.813~0.819 min、0.890~0.892 min、0.904~0.906min、0.915~0.917 min、0.929~0.931 min、0.936~0.938 min、0.938~0.942 min、0.954~0.956 min、0.962~0.966 min、0.967~ 0.969 min、1.000 min、1.105~1.017 min、1.048~1.409 min、1.098~1.099 min、1.180~1.182 min、1.269~1.271 min、1.324~1.326 min、1.367~1.369 min、1.403~1.406 min、1.440~1.442 min、1.473~1.475 min。

5.根据权利要求4所述的参芪降糖制剂HPLC标准指纹图谱，其特征在于：所述的编号分别为1至38的38 个共有特征峰中：

归属于人参茎叶皂苷的特征峰编号为15、16、18、19、20、21、23、25、26、27、28、30、32一共13个，其中15号峰为人参皂苷Rg₁、16号峰为人参皂苷Re、28号峰为人参皂苷Rd；

归属于黄芪的特征峰编号为10、17、22、24一共4个，其中10号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、24号峰为黄芪甲苷；

归属于五味子的共有峰编号为5、29、31、33、34、35、36一共7个，其中29号峰为五味子醇甲、35号峰为五味子甲素、36号峰为五味子乙素；

归属于地黄的特征峰编号为11、12、14一共3个，其中12号峰为毛蕊花糖苷；

归属于覆盆子的特征峰编号为7、13、37、38一共4个。

Images