CN103837627A - 一种落花生茎叶药材的指纹图谱建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种河北产落花生茎叶药材指纹图谱的建立方法，所建立的方法包括采用高效液相色谱法检测河北产落花生茎叶药材中的原儿茶酸，液相色谱条件包括：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；流动相包括：流动相A为乙腈，流动相B为酸性水溶液，进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm~400nm；理论塔板数按原儿茶酸峰计算，应不低于6000。采用本发明的建立方法，可有效获得能够全面表征河北产落花生茎叶药材活性组分的指纹图谱，具有精密度、稳定性、重复性高的特点。获得的指纹图谱可用于确保河北产落花生茎叶药材质量的稳定一致，进而保证其用药的安全性和有效性。

Description

一种落花生茎叶药材的指纹图谱建立方法

技术领域

本发明属于药物分析检测领域，涉及一种落花生茎叶药材的指纹图谱建立方法，特别涉及河北产落花生茎叶药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱建立方法。

背景技术

中药作为多组分复杂体系，其化学成分众多，测定少数几种有效成分或指标成分不足以确保药材或制剂的质量，而宏观地综合分析已成为必然的趋势，中药指纹图谱这一质量控制模式便顺应了这个趋势。

中药指纹图谱是指中药材经过适当的处理后，采用一定的分析手段和仪器检测得到的能够标识其中各种组分群体特征的共有峰的图谱，是以系统的化学成分研究和药理学研究为基础，经化学测定或基因鉴定得到的某种或某产地中药及其制剂所共有的、具有特异性的组分群体（某类或数类成分）的特征图谱或图像。

中药指纹图谱能比较全面的反映中药中所含化学成分的种类与数量，尤其是在现阶段绝大多数有效成分没有明确的情况下，虽然它不能代替含量测定，但它比测定任何单一成分所提供的信息都丰富，能更好地反映中药的内在质量，大大提高中药质量控制和评价的技术水平和科技含量，成为建立现代中药质量标准体系的核心。

落花生茎叶收载于《湖南省中药材标准》，为豆科落花生属植物落花生Arachis hypogaea L.的干燥地上部分。本品味甘，性平。具有散瘀消肿，解毒，止汗的功效，用于治疗跌打损伤，各种疮毒和盗汗等症。近年来随着对其化学成分和药理活性的深入研究，使得原本作为农作物废弃物的落花生茎叶药材得到了合理有效的利用，以落花生茎叶药材为主要原料的制剂，如落花安神合剂、降压避风片等被广泛应用于临床。

现有落花生茎叶药材的质量标准仅从外观性状、简单的薄层鉴别角度对其进行控制，显然不能全面准确表征其内在质量。指纹图谱作为中药及其提取物成方制剂质量控制的最优方法，已被大家广为采纳。采用中药指纹图谱方式，一方面可以通过指纹图谱的特征性有效的鉴别样品的真伪和产地，另一方面通过对主要指纹图谱特征峰的面积或比例的控制，能有效控制药材的质量，确保其质量的均一和稳定，从而保证药材的安全性和有效性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种建立落花生茎叶药材指纹图谱的方法，该方法建立的指纹图谱能够全面表征落花生茎叶的药物活性组分，从而表征和控制其内在质量。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种落花生茎叶药材指纹图谱的建立方法，所述方法包括采用高效液相色谱法检测落花生茎叶药材成分，其中，所述高效液相色谱法的条件包括：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2%体积分数甲酸水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比：

0~15min，流动相A为0~5%，流动相B为100%~5%；

15~60min，流动相A为5%~30%，流动相B为95%~70%；

60~80min，流动相A为30%~50%，流动相B为70%~50%；

80~100min，流动相A为50%~100%，流动相B为50%~0%。

优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括：

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：286nm；

理论塔板数按原儿茶酸峰计算，应不低于6000。

优选地，上述建立方法还包括通过以下步骤制备对照品溶液：取原儿茶酸对照品适量，加入甲醇溶解制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。

并且，上述建立方法还包括通过以下步骤制备供试品溶液：取河北产落花生茎叶药材1.0g，置于烧瓶锥形瓶中，加入70%体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取1h，提取液浓缩至干，用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，用0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得。

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，得到指纹图谱：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料；Diamonsil钻石1代C18，5μm，2.5×460mm；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2%体积分数甲酸水溶液，进行梯度洗脱；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

紫外检测波长：286nm。

所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比：

0~15min，流动相A为0~5%，流动相B为100%~5%；

15~60min，流动相A为5%~30%，流动相B为95%~70%；

60~80min，流动相A为30%~50%，流动相B为70%~50%；

80~100min，流动相A为50%~100%，流动相B为50%~0%。

根据上述建立方法得到的指纹图谱中共标记有7个特征吸收峰，其中峰1为对照品原儿茶酸，各峰以峰1为参照峰的计算相对保留时间和相对峰面积如下：

相对保留时间：

峰1：1.000；峰2：1.182；峰3：1.547；峰4：2.221；峰5：2.244；峰6：2.307；峰7：4.333；

相对峰面积：

峰1：1.000；峰2：7.204；峰3：2.594；峰4：1.452；峰5：2.026；峰6：1.023；峰7：0.421。

以下是本发明的详细描述：

色谱条件：采用梯度洗脱的方式；根据落花生茎叶药材成分的特点先后尝试了甲醇-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液等流动相系统，并且尝试了多种不同梯度条件，经过对各种色谱图比较，最后确定乙腈-0.2%体积分数甲酸水溶液系统，采用梯度洗脱方式，得到的多个色谱峰有较好的分离效果。

供试品溶液采用二极管阵列检测器（DAD）在210~400nm波长范围内进行全梯度扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较。结果表明，在286nm波长处，各色谱峰分离良好，特征峰明显且峰型较好，从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息及反映整体系组成的全貌，因此选定286nm为指纹图谱测定波长。通过对luna、Diamonsil钻石1代、Ameritech，菲罗门-ODS等C18色谱柱比较，最终确定用Diamonsil钻石1代C18（5μm，2.5×460mm）；柱温：30℃；检测波长：286nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.2%体积分数甲酸水溶液；洗脱方式：梯度洗脱：洗脱梯度程序为：0~15min，流动相A为0~5%，流动相B为100%~5%；15~60min，流动相A为5%~30%，流动相B为95%~70%；60~80min，流动相A为30%~50%，流动相B为70%~50%；80~100min，流动相A为50%~100%，流动相B为50%~0%。并记录100分钟色谱图。流速：1.0ml/min。进样量10μL。

优选对照品溶液的制备方法为：取原儿茶酸对照品适量置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

优选供试品溶液的制备方法：通过多次的试验考察确定了本质量控制方法中供试品溶液的制备方法，试验比较了50%体积分数乙醇水溶液、70%体积分数乙醇水溶液、50%体积分数甲醇水溶液、70%体积分数甲醇水溶液、甲醇做提取溶剂对指纹图谱的影响，确定用70%体积分数甲醇水溶液作溶剂效果佳，同时对超声和回流不同提取方法和不同提取时间做了比较。结果表明使用70%体积分数甲醇水溶液超声1h，所得色谱峰较多，峰面积较大。因此，优选条件为取河北产落花生茎叶药材1.0g，置于烧瓶锥形瓶中，加入70%体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取1h，提取液浓缩至干，用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，用0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

以原儿茶酸为参照峰的指纹图谱的制定：

精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，依据所得的图谱，制定标准指纹图谱。以上述方法作为测试手段，将待测定样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，计算相似度，应为0.90~1.00。

与现有技术相比，本发明提供的河北产落花生茎叶药材指纹图谱的建立方法具有以下积极效果：

本发明首次对河北产落花生茎叶药材的指纹图谱进行研究，通过本发明的方法获得的指纹图谱能更全面、完善地表征药物的有效活性组分及其质量。该方法实现了对河北产落花生茎叶最大可能的化学成分的全面检测，能有效地表征其质量。所建立的指纹图谱可以用于质量控制，在保证药材均一稳定的同时，确保了制剂产品的安全性和有效性。

并且，本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。

附图说明

图1为10批河北产落花生茎叶供试品的指纹图谱叠加图；

S1-天津陈咀（2010.10）S2-天津陈咀(2011.10)S3-河北香河（2011.11）S4-河北香河(2010.11)S5-河北香河（2011.6）S6-河北香河(2011.11)S7-河北邢台(2010.6)S8-河北邢台(2011.6)S9-河北邢台(2011.10)S10-河北武安(2011.8)

图2为河北产落花生茎叶HPLC对照指纹图谱。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下各实施例中所使用的对照品来源如下：

原儿茶酸，购自中国药品生物制品检定所。

以下各实施例中所使用的落花生茎叶供试品，具体的采集地点和时间见表1。

表1  落花生茎叶来源

其它仪器及试剂：

采用Agilent 1100液相色谱仪，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器，DAD检测器，柱温箱，Chemstation工作站；AB204-N电子天平(METTLERTOLEDO)；超声仪：Autoscience AS3120；电热恒温水浴锅（江苏省医疗器械厂生产）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHi）；METTLER TOLEDO PB303-N电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

乙腈（色谱纯）购自天津康科德科技有限公司；甲酸（优级纯）购自天津市风船化学试剂科技有限公司；95%乙醇（分析纯）购自天津市凯信化学工业有限公司；甲醇（优级纯）购自天津康科德科技有限公司；娃哈哈纯净水。

实施例1采用HPLC法建立河北产落花生茎叶药材的指纹图谱

对照品溶液的制备：精密称取取原儿茶酸对照品10mg,，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得原儿茶酸对照品溶液（0.1000mg/mL）。

供试品溶液制备：取河北产落花生茎叶药材1.0g，置于烧瓶锥形瓶中，加入70%体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取1h，提取液浓缩至干，用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，用0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液备用。

指纹图谱的测定：吸取上述原儿茶酸对照品溶液和落花生茎叶供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到河北产落花生茎叶HPLC标准指纹图谱，其中测定色谱测定条件包括：

色谱柱为Diamonsil C18(5μm,2.5×460mm)，采用流动相A为乙腈，流动相B为0.2%体积分数甲酸水溶液，梯度洗脱程序见下表2；检测波长为286nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min，进样量10μL。

表2  HPLC梯度洗脱程序

实施例2指纹图谱建立方法的方法学考察

1）精密度试验

采用和实施例1相同的操作和条件，精密量取同一供试品溶液，连续进样5次，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以原儿茶酸为参照峰，计算其中各个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。

结果表明，各个色谱峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于1.0%，各个色谱峰相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于3.0%，符合指纹图谱要求。

2）稳定性考察

采用和实施例1相同的操作和条件，制备供试品溶液，室温密闭放置，分别在0、3、6、9、12、24h进样分析，考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以原儿茶酸为参照峰，计算其中7个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积。

结果表明，相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于1.0%，相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于3.00%。表明供试品溶液在24h内基本稳定。

3）重复性试验

采用和实施例1相同的操作和条件，取同一产地样品，制备供试品溶液5份，考察色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。

结果表明，计算其中7个共有色谱峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于1.0%，相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于3.00%，符合指纹图谱要求。

实施例3河北产落花生茎叶药材指纹图谱的建立

按照实施例1所述方法对S1至S10批次落花生茎叶药材进行分析测定，获得指纹图谱。

用《中药色谱图的指纹谱评价系统》软件（2004A）进行色谱峰的匹配，计算了10批河北产落花生茎叶的相似度，评价结果见下表3。

表310批河北产落花生茎叶药材指纹图谱的相似度评价结果

这10批河北产落花生茎叶药材的HPLC色谱结果的叠加图见图1。

Claims (6)

1.一种落花生茎叶药材指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述方法采用HPLC法，其条件为： 

色谱柱：C18烷基硅烷键合硅胶为填充材料； 

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2%体积分数甲酸水溶液，进行梯度洗脱；检测波长：286nm。 

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比： 

0～15min，流动相A为0～5%，流动相B为100%～5%； 

15～60min，流动相A为5%～30%，流动相B为95%～70%； 

60～80min，流动相A为30%～50%，流动相B为70%～50%； 

80～100min，流动相A为50%～100%，流动相B为50%～0%。 

3.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于： 

所述HPLC法检测包括以下步骤： 

1）制备对照品溶液； 

2）制备供试品溶液； 

3）测定：根据以下色谱条件进行测定，得到指纹图谱： 

色谱柱： C18烷基硅烷键合硅胶为填充材料，5μm，2.5×460mm； 

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2%体积分数甲酸水溶液，进行梯度洗脱； 

流速：1.0mL/min； 

检测波长：286nm； 

理论塔板数按原儿茶酸峰计算，应不低于6000。 

4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的制备对照品溶液按如下步骤：取原儿茶酸对照品适量，加入甲醇溶解制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。 

5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的制备供试品溶液按如下步骤：取落花生茎叶药材1.0g，置于烧瓶锥形瓶中，加入70 %体积分数甲醇水溶液100ml，超声提取1h，提取液浓缩至干，用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中，用0.45μm滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得。 

6.根据权利要求1至5中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述建立方法得到的指纹图谱中包括7个共有吸收峰，其中峰1为对照品原儿茶酸，各峰以峰1为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下： 

相对保留时间： 

峰1：1.000；峰2：1.182；峰3：1.547；峰4：2.221；峰5：2.244；峰6：2.307；峰7：4.333； 

相对峰面积： 

峰1：1.000；峰2：7.204；峰3：2.594；峰4：1.452；峰5：2.026；峰6：1.023；峰7：0.421。 

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