CN107655989B - 茵栀黄颗粒hplc指纹图谱的建立方法及其标准图谱 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的确定及HPLC标准指纹图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有29个共有峰，其相对保留时间tR依次分别为0.079，0.087，0.113，0.341，0.436，0.563，0.648，0.8660.891，0.905，0.919，1.000，1.089，1.129，1.161，1.197，1.395，1.453，1.496，1.597，1.776，1.808，1.979，2.071，2.136，2.168，2.353，2.396，2.440。本发明方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得图谱特征峰多，通过标准指纹图谱共有峰的比较，可对茵栀黄颗粒的质量进行全面评价，有利于稳定产品质量，确保临床用药的安全性、有效性。

Description

茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱的建立方法及其标准图谱
技术领域
本发明涉及一种茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱的建立方法及其HPLC标准指纹图谱，属于中药制剂分析领域。
背景技术
茵栀黄颗粒收载于《中国药典》2015年版一部中，由茵陈(绵茵陈)提取物、栀子提取物、黄芩提取物、金银花提取物制备而成，具有清热解毒，利湿退黄的功能，用于肝胆湿热所致的黄疸，症见面目悉黄、胸胁胀痛、恶心呕吐、小便黄赤；急、慢性肝炎见上述证侯者，具有确切的临床疗效，已收载入《国家基本药物目录(2012年版)》。
现行《中国药典》中茵栀黄颗粒质量控制方法主要包括鉴别和含量测定，其中鉴别项采用薄层色谱法，分别鉴定处方中的茵陈提取物、栀子提取物、黄芩提取物，采用特征图谱鉴别茵陈提取物、金银花提取物中的6个有机酸成分，含量测定项使用高效液相色谱法测定茵陈提取物中对羟基苯乙酮的含量、栀子提取物中栀子苷的含量、黄芩提取物中黄芩苷的含量以及金银花提取物和茵陈提取物中绿原酸的含量。从处方组成可以发现，茵栀黄颗粒由四味提取物制成，但其质量标准仅用薄层色谱法鉴定提取物和高效液相色谱法检测提取物中一个指标性成分的含量，以此来控制茵栀黄颗粒的质量不够全面、准确。
中药指纹图谱作为一项质量控制技术，能够较为全面的控制药品的质量，具有系统性、整体性特点。目前，以指纹图谱控制茵栀黄颗粒的质量，国内外尚未见专利公开及文献报道。本发明公开了一种茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，以及用该方法制作的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱。在用相似度进行评价的情况下，可用其标准指纹图谱对茵栀黄颗粒的质量进行全面地评价和控制，从而保证了产品质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。
发明内容
本发明的目的是针对现有茵栀黄颗粒质量控制方法的不足，提供一种茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱的建立方法及用该方法所得的HPLC标准指纹图谱。其特点是将茵栀黄颗粒制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，获得茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱，从而为茵栀黄颗粒的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。
本发明一种茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
1)供试品溶液的制备：取茵栀黄颗粒，置具塞锥形瓶中，加入40％-70％甲醇，超声处理20min-50min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液；
2)HPLC色谱条件的确定：精密吸取供试品溶液，经HPLC分离检测，其中流动相的组成为乙腈：0.05％-0.2％磷酸溶液，采用梯度洗脱。
3)指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对茵栀黄颗粒样品进行分析，得HPLC色谱图，对色谱图进行比较，得到由样品共有特征峰构成的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱。
优选地，供试品溶液具体按如下步骤制备：精密称取茵栀黄颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，超声处理40min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
所述的HPLC色谱条件为：Kromasil C18柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；流动相：乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 5％ 95％
15 6％ 94％
23 10％ 90％
42 20％ 80％
60 25％ 75％
90 40％ 60％
检测波长：230-240nm，流速：0.8-1.2ml/min，柱温：25-45℃。优选的是，检测波长：238nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。
按上述色谱条件对20批茵栀黄颗粒样品进行分析，得到20批样品的HPLC色谱图，对20批样品的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱。
本发明还提供了由上述方法得到的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱，具体步骤是将20批茵栀黄颗粒样品按上述方法制备成供试品溶液，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱。
所述茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱有29个共有峰，其相对保留时间tR依次分别为：0.079，0.087，0.113，0.341，0.436，0.563，0.648，0.866，0.891，0.905，0.919，1.000，1.089，1.129，1.161，1.197，1.395，1.453，1.496，1.597，1.776，1.807，1.979，2.071，2.136，2.168，2.353，2.396，2.440。
与现有技术相比，本发明提供的茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱建立方法精密度高、重新性好，通过对比所得指纹图谱中共有峰的有无，可对茵栀黄颗粒的质量进行全过程评价，有效地保证了成品的质量，可克服现有技术检测指标单一，不能反映内在质量的缺点。此外，本发明色谱条件下的各特征色谱峰均实现了良好的基线分离，稳定性好、特征峰多，能全面、准确地评价茵栀黄颗粒的质量，适用于对茵栀黄颗粒真伪鉴别和产品质量的控制。
附图说明
图1为茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱(1-29为29个共有峰)；
图2为20批茵栀黄颗粒的HPLC指纹图谱叠加图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1 茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2 试药
茵栀黄颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，见表1；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表1 茵栀黄颗粒测试样品批号
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：238nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。
2.2 供试品溶液的制备：精密称取茵栀黄颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3 指纹图谱的建立
测定20个批号茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以12号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的29个共有峰的相对保留时间tR分别：0.079，0.087，0.113，0.341，0.436，0.563，0.648，0.866，0.891，0.905，0.919，1.000，1.089，1.129，1.161，1.197，1.395，1.453，1.496，1.597，1.776，1.807，1.979，2.071，2.136，2.168，2.353，2.396，2.440。其中，8号峰为绿原酸，13号峰为对羟基苯乙酮，22号峰为黄芩苷。
将20个批号茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱导入药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，进行色谱峰匹配，以12号栀子苷峰为参照确定29个共有峰为构成茵栀黄颗粒指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间分别列于表2，20批茵栀黄颗粒共有峰的相对峰面积见表3。20批茵栀黄颗粒与标准指纹图谱相似度计算结果依次为0.988，0.987，0.988，0.988，0.988，0.988，0.997，0.998，0.998，0.998，0.997，0.998，0.998，0.998，0.998，0.999，0.999，0.998，0.998，0.998。
表2 20批茵栀黄颗粒共有峰的相对保留时间(tR)
续表
表3 20批茵栀黄颗粒共有峰的相对峰面积
续表
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验取样品(00917150)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以12号峰为参照峰，计算出1～29号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。
2.4.2 稳定性试验
取样品(00917150)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，24h进样，以16号峰为参照峰，计算出1～29号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定。
2.4.3 重现性试验
取同一批号样品(00917150)，分别精密称取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以12号峰为参照峰，计算出1～29号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
实施例2 茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2 试药
茵栀黄颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，见表1；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表1 茵栀黄颗粒测试样品批号
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.05％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：238nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。
2.2 供试品溶液的制备：精密称取茵栀黄颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入40％甲醇20ml，超声处理20min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3 指纹图谱的建立
测定20个批号茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以12号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的29个共有峰的相对保留时间tR分别：0.079，0.087，0.113，0.341，0.436，0.563，0.648，0.866，0.891，0.905，0.919，1.000，1.089，1.129，1.161，1.197，1.395，1.453，1.496，1.597，1.776，1.807，1.979，2.071，2.136，2.168，2.353，2.396，2.440。其中，8号峰为绿原酸，13号峰为对羟基苯乙酮，22号峰为黄芩苷。
实施例3 茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2 试药
茵栀黄颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，见表1；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表1 茵栀黄颗粒测试样品批号
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.2％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：238nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。
2.2 供试品溶液的制备：精密称取茵栀黄颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，超声处理50min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3 指纹图谱的建立
测定20个批号茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以12号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的29个共有峰的相对保留时间tR分别：0.079，0.087，0.113，0.341，0.436，0.563，0.648，0.866，0.891，0.905，0.919，1.000，1.089，1.129，1.161，1.197，1.395，1.453，1.496，1.597，1.776，1.807，1.979，2.071，2.136，2.168，2.353，2.396，2.440。其中，8号峰为绿原酸，13号峰为对羟基苯乙酮，22号峰为黄芩苷。
实施例4 茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱的建立
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，AgilentOpen Lab色谱工作站。
1.2 试药
茵栀黄颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，见表1；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表1 茵栀黄颗粒测试样品批号
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.15％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：238nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。
2.2 供试品溶液的制备：精密称取茵栀黄颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇20ml，超声处理40min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.3 指纹图谱的建立
测定20个批号茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以12号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的29个共有峰的相对保留时间tR分别：0.079，0.087，0.113，0.341，0.436，0.563，0.648，0.866，0.891，0.905，0.919，1.000，1.089，1.129，1.161，1.197，1.395，1.453，1.496，1.597，1.776，1.807，1.979，2.071，2.136，2.168，2.353，2.396，2.440。其中，8号峰为绿原酸，13号峰为对羟基苯乙酮，22号峰为黄芩苷。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种茵栀黄颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1）供试品溶液的制备：取茵栀黄颗粒，加入40%-70%甲醇，超声处理20min-50min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2）HPLC色谱条件的确定：Kromasil C18柱，乙腈为流动相A，0.05%-0.2%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：
时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 0-15 5％→6％ 95％→94％ 15-23 6％→10％ 94％→90％ 23-42 10％→20％ 90％→80％ 42-60 20％→25％ 80％→75％ 60-90 25％→40％ 75％→60％
检测波长：230-240nm，流速：0.8-1.2ml/min，柱温：25-45℃；
3）指纹图谱的制作：按步骤2）色谱条件对茵栀黄颗粒供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱；
4）标准指纹图谱的确定：确定了29个共有特征峰，所述特征峰的相对保留时间tR依次分别为：0.079,0.087,0.113,0.341,0.436,0.563,0.648,0.866,0.891,0.905,0.919,1.000,1.089,1.129,1.161,1.197,1.395,1.453,1.496,1.597,1.776,1.807,1.979,2.071,2.136,2.168,2.353,2.396,2.440。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的供试品溶液，按如下步骤制备：精密称取茵栀黄颗粒，精密加入50%甲醇，超声处理40min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述流动相B为0.1%磷酸溶液。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品的数量为20批次。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的检测波长：238nm，所述的流速：1.0ml/min，所述的柱温：30℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茵栀黄颗粒HPLC标准指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件进行相似度评价。
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