CN104820049A - 淫羊藿破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及淫羊藿破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法。该方法以淫羊藿苷为对照，在柱温35℃，272nm波长，乙腈为相A，水为相B，洗脱梯度0min-20min-28min-60min，相A变化20％-27％-27％-50％的色谱条件下，对10批以上样品进行HPLC分析，建立共有模式标准图谱和判断指标。将同一色谱条件下的待测样品图谱与之比较，检测待测样品的质量。本发明是首次针对淫羊藿破壁饮片建立的HPLC共有模式标准图谱及质量检测方法。该图谱较全面涵盖了淫羊藿破壁饮片主要活性成分的图谱信息，专属性强，检测快速准确；并能有效评价药材、破壁粉体、破壁饮片的整体质量。

Description

淫羊藿破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药饮片的建立检测方法，尤其是淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法。

背景技术

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimediumbrevicornu Maxim、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum(Sie.et Zucc.)、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶。本发明中的淫羊藿针对小檗科植物淫羊藿Epimediumbrevicornu Maxim品种。

主要成分为黄酮、木脂素、生物碱和多糖。黄酮类成分主要有：淫羊藿苷，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ、Ⅱ，淫羊藿次苷Ⅰ、Ⅱ，大花淫羊藿苷A，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，箭藿苷A、B、C和金丝桃苷等。

中药破壁饮片是利用现代超微粉碎技术将传统饮片进行破细胞壁粉碎成粒度分布D90小于45μm的微细颗粒，再制成30～100目的颗粒。相对于传统饮片具有色泽一致，质量均一，稳定性好的特点为创新型中药饮片。由于中药破壁饮片不具传统中药饮片的形态特征，破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、质量检测方法不能完全适用。因此，必须针对中药破壁饮片建立专属性强，全面反映中药破壁饮片质量状况的检测方法。而建立一项新的质量检测方法并非易事，例如检测条件、对照品的选择和供试品的制备方法等均需要研究考量并进行验证。虽然现有技术中有涉及中药指纹图谱的检测方法，但并无针对形态特殊的中药破壁饮片的方法，且存在专属性、稳定性、重现性和精密度差缺陷，不能全面反应饮片质量的缺陷。

发明内容

本发明提供了一种淫羊藿破壁饮片HPLC标准指纹图谱的构建及其质量检测方法。

淫羊藿破壁饮片HPLC标准指纹图谱的构建方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿破壁饮片0.200g，加入50％稀乙醇20mL，超声提取30min，冷却至室温，1200r/min离心5min,上清液倾入20ml量瓶中，加50％稀乙醇稀释并定容至20ml，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用；

(2)对照品配制：精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解配制成浓度分别为0.116mg/ml的混合对照品溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，水溶液为流动相B，梯度洗脱：0min-20min-28min-60min，流动相A:20％-27％-27％-50％；柱温为35℃；检测波长为272nm；流速：0.8mL/min；

(4)测定法：精密吸取供试品溶液20μl，对照品10ul注入色谱仪，测定，记录图谱，即得；

(5)按上述供试品溶液及对照品的制备方法及和色谱条件对10批以上的淫羊霍破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以淫羊藿苷峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立淫羊藿破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱如图3所示，包括16个特征峰。

淫羊藿破壁饮片的质量检测方法包括以下步骤：

(1)按上述标准图谱构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品溶液20μl，淫羊藿苷对照品10ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得；

(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，应呈现16个与图3-淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。以淫羊藿苷峰为对照峰，其余15个共有指纹峰的相对保留时间分别为0.248、0.507、0.691、0.772、0.829、0.875、0.931、0.966、1.128、、1.262、1.458、1.652、1.667、1.781、1.832，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格品。

本发明是首次针对淫羊藿破壁饮片质量控制所构建的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱及质量检测方法。该方法克服了现有技术不能完全适用淫羊藿破壁饮片质量控制的缺陷。该图谱较全面涵盖了淫羊藿饮片主要活性成分的图谱信息，专属性明显优于现有的同类指纹图谱方法。经试验验证该方法的稳定性、重现性和精密度均达到法定要求，且操作简单，检测快速准确；并能有效控制淫羊藿药材、破壁粉体、破壁饮片整体质量。

附图说明

图1是淫羊藿破壁饮片指纹图谱柱子适用性考察谱图。

图2是淫羊藿破壁饮片专属性考察。

图3是本发明淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式标准图谱。

具体实施方式

一、淫羊藿破壁饮片HPLC标准指纹图谱的构建。

本发明以淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷B、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、绿原酸8个主要活性成分为目标，建立能较全面反映淫羊藿破壁饮片成分信息，同时能测定淫羊藿苷含量的标准指纹图谱。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1200RRLC快速液相色谱仪(配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD蒸发光检测器、G1312B二元泵、G1329B自动进样器、G1322A脱气机、G1316B柱温箱，AgilentChemstation色谱工作站)、万分之一电子分析天平、十万分之一电子分析天平、高功率数控超声清洗仪等

1.2 试药

试剂：甲醇(瑞典进口Oceanpak色谱溶剂)，乙腈(安徽时联特种溶剂公司色谱纯)，双蒸水、磷酸、甲醇(分析纯)。淫羊藿苷对照品(110737-201312)。

供试品：淫羊藿破壁饮片、淫羊藿破壁粉体、淫羊藿原料药材(均由中山中智药业集团提供)

2 实验方法

2.1 预试验

中智淫羊藿破壁饮片主要采用小檗科淫羊藿属淫羊藿药材经过超微粉碎加工而制成。本研究在参考公司内部非公开文献的基础上，专门针对淫羊藿破壁饮片，拟定以下几个方案进行预实验。

2.1.1预实验1

样品制备：精确称取0.2001g淫羊藿破壁饮片(14040101批次)，于50ml具塞锥形瓶中，加入20ml 70％的乙醇溶液，浸润30min,称定重量，超声30min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件1：agilentzorbax SB C18(4.6mmX250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-水，预梯度1洗脱：0min-30min-60min,乙腈变化为：5％-100％-5％，进样量为10ul。

色谱条件2：agilentzorbax SB C18(4.6mmX250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-水，预梯度2洗脱：0min-60min,乙腈变化为：5％-100％，进样量为10ul。

色谱条件3：agilentzorbax SB C18(4.6mmX250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-0.5％冰醋酸溶液，预梯度3洗脱：0min--60min,乙腈变化为：5％-90％，进样量为10ul。

色谱条件4：agilentzorbax SB C18(4.6mmX250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-0.5％冰醋酸溶液，预梯度1洗脱：0min-35min-40min-55min-60min,乙腈变化为：25％-25％-30-47％-70％，进样量为10ul。

结果与分析：

(1)按照色谱条件1分析样品，基本能将淫羊藿破壁饮片供试品中的成分洗脱下来。

(2)色谱条件2是在色谱条件1的基础上，延长一倍分析时间，降低变化速率，分离效果稍有提高但不明显。

(3))色谱条件3是在色谱条件2的基础上，，流动相中添加冰醋酸为洗脱剂，结果显示：分离度及峰形改善得不明显。

(4)色谱条件4分析结果显示：大极性成分分离效果不理想，且出现基线漂移，影响整体效果。

2.1.2预实验2

样品制备：精确称取0.2019g淫羊藿破壁饮片(批号为14040101)，于50ml具塞锥形瓶中，加入20ml 70％的乙醇溶液，浸润30min,称定重量，超声提取30min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件1：Waters Symmetry 18(4.6mmX250mm，5um)色谱柱，柱温30℃,流速1ml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-0.5％冰醋酸溶液，梯度洗脱：0min-35min-40min-55min-60min,乙腈变化为：25％-25％-30％-47％-70％，进样量为20ul。

色谱条件2：Waters Symmetry C18(4.6mmX250mm,5um)色谱柱，柱温30℃,流速1ml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-水溶液，梯度洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈变化为：20％-27％-27％-50％，进样量为20ul(命名为淫羊藿预梯度24)。

2.2 样品制备方法考察

2.2.1 提取溶剂的考察

由于淫羊藿中的主要活性成分为黄酮化合物，黄酮在热水及醇性溶剂中溶解性较好，其指纹图谱研究文献中绝大部分都是采用70％乙醇作为提取溶剂，且乙醇价格便宜，毒性小，具有防腐作用，提取液不易发霉变质。因此本项考察乙醇、稀乙醇和甲醇3种溶剂对淫羊藿破壁饮片提取效率的影响。

样品处理：精密称取淫羊藿破壁饮片6份，各约0.200g，置具塞锥形瓶中，每两份分别量取乙醇和甲醇、50％乙醇各20mL，称定重量，浸润30min，超声(320W、4200KHz)提取45min，放冷，用相应的提取溶剂补足减失的重量，过滤，0.22um微孔滤膜过滤即得供试品。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um):流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈变化20％-27％-27％-50％；流速1ml/min。柱温30℃,检测波长268、270、272、280nm。

分析上述6份样品，比较不同种类溶剂提取差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且淫羊藿苷含量高为选择标准，筛选出最佳提取溶剂。

以272nm下谱图结合表1分析，结果显示：2种溶剂提取所得供试品的谱图相似度大于0.999，且淫羊藿苷含量差异RSD为4.6％，说明两种提取方法的提取效果没有显著区别。由表2可见，乙醇提取效果略胜甲醇提取，选泽乙醇作为提取溶剂。

表1 淫羊藿破壁饮片提取溶剂考察谱图相似度

2.2.2 提取溶剂浓度的考察

考察50％、70％、80％、95％乙醇等不同浓度乙醇的提取效率。

样品制备：精确称取8份淫羊藿破壁饮片各约0.20g，于8个具塞锥形瓶中，每两份分别加入50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇各20ml，浸润30min，超声提取45min(320W,4200Hz)，取出，冷却至室温，1200r/min离心5分钟，上清液倾入20ml的量瓶中，加相应的溶剂稀释并定容至刻度，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

对照品溶液配置：精密称取0.01163g淫羊藿苷对照品于100ml锥形瓶中，加入甲醇溶解并定溶至刻度，移取5ml至50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，得0.01163mg/ml的淫羊藿苷对照品溶液。

色谱条件：agilentzorbax SB C18(4.6X250mm，5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min,检测波长272nm,流动相：乙腈-水系统，预梯度24洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈变化为20％-27％-27％-50％，进样量20ul。

实验过程发现，淫羊藿破壁饮片50％乙醇提取物颜色为淡黄色微浑浊，而70％以上乙醇提取物颜色为黄绿色，且随提取溶剂浓度升高，提取液颜色加深，其中乙醇提取物样品指纹图谱峰形矮胖，其他三个浓度乙醇对淫羊藿苷的提取效率RSD为1.3％，没有显著性差异，三者指纹图谱相似度0.99以上。于是对三浓度指纹图谱主要色谱峰进行分析，。结果如下表2所示：前14分钟，淫羊藿破壁饮片50％乙醇提取物的色谱峰峰面积略低于70％乙醇提取物，后20min，50％乙醇提取物的色谱峰峰面积高于70％乙醇。鉴于两者没有显著差异，选择50％乙醇作为提取溶剂。

表2 淫羊藿破壁饮片考察乙醇提取浓度主要色谱峰表

2.2.3 提取时间的考察

淫羊藿指纹图谱文献研究显示：淫羊藿供试品多采用超声提取制备，《中国药典》淫羊藿含量测定也是采用稀乙醇超声提取，故本研究不进行提取方式考察，直接选择超声提取方式。但由于淫羊藿破壁饮片与淫羊藿药材具有性状差异，于是本项目需考察超声提取时间对淫羊藿破壁饮片提取效率的影响。

样品制备：精密称取8份淫羊藿破壁饮片各约0.20g，于具塞锥形瓶中，分别加入50％的稀乙醇溶液20ml，每两份分别超声20min、30min、60min、90min,取出，冷却至室温，1200r/min离心5min，上清液倾入20ml的量瓶中，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min,检测波长272nm,流动相：乙腈-水系统，预梯度24洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈变化为20％-27％-27％-50％，进样量20ul。

将实验所得的8张谱图导入中智指纹图谱分析软件，经过标准化处理得出超声提取20min-90min的8张谱图的相似度均大于0.998，且除提取20min外的其他3个提取时间所得样品谱图相似度达0.9995以上，说明样品提取时间达30min时，提取已较充分，于是选择超声提取30min。

表3 淫羊藿破壁饮片考察提取时间主要色谱峰积分表(n＝2)

2.2.4 淫羊藿破壁饮片样品制备方法的确定

精确称取淫羊藿破壁饮片约0.20g于具塞锥形瓶中，加入50％稀乙醇20ml,浸润30min,超声(320w，4200Hz)提取30min,取出，冷却至室温，1200r/min离心5min,上清液倾入20ml量瓶中，加50％乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

2.3 淫羊藿破壁饮片色谱条件考察

按照“预梯度24”洗脱条件分析淫羊藿破壁饮片供试品，结果已达到高效液相色谱技术分析要求，于是直接对其进行色谱柱温及流速的考察，微调以优化色谱条件。

2.3.1 色谱柱柱温考察

样品制备：精确称取淫羊藿破壁饮片0.2005g于具塞锥形瓶中，加入50％乙醇20ml,浸润30min,超声(320w，4200Hz)提取60min,取出，冷却至室温，1200r/min离心5min,上清液倾入20ml量瓶中，加50％乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：agilentzorbax sbC18(4.6X250mm,5um)色谱柱，流速1ml/min,检测波长272nm,流动相：乙腈-水系统，预梯度24洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈变化为20％-27％-27％-50％，进样量20ul，分别考察柱温20、25、30、35、40℃的分析效果。结果显示：随着柱温升高，色谱峰分离度增大，但35℃时，主要色谱峰基本能达到基线分离，于是选择35℃作为最佳柱温。

2.3.2 洗脱流速考察

样品制备：精确称取淫羊藿破壁饮片0.2009g于具塞锥形瓶中，加入50％乙醇20ml,浸润30min,超声(320W，4200Hz)提取60min,取出，冷却至室温，1200r/min离心5min,上清液倾入20ml量瓶中，加50％乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：agilentzorbaxsb C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温35℃。检测波长272nm,流动相：乙腈-水系统，预梯度24洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈变化为20％-27％-27％-50％，进样量：样品20ul，对照品10ul，分别考察流速为0.7ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的分析效果。

结果显示：以0.7ml/min流速洗脱，峰分离度远远大于其它四个流速，但其峰形较矮胖，且分析时间太长，而以其它3个流速洗脱，峰分离度差异不明显，且分离效果均较理想，于是选择分离度相对较好的0.8ml/min作为洗脱流速。

2.4 最终色谱条件确定

十八烷基健合硅胶柱(4.6X2520mm，5um)，柱温35℃，流速0.8ml/min,检测波长272nm，流动相：乙腈-水系统，梯度洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈的变化为20％-27％-27％-50％，进样量：样品20ul、对照品10ul。

3 方法学考察

3.1 柱子适用性考察

精确称取淫羊藿破壁饮片0.2009g(20140403批号)按照上述确定的样品制备方法制备供试品，按照最终确定的色谱条件，分别考察该方法对agilentzorbax SB C18(4.6X250mm，5um)、Thermo Hipersil C18(4.6X250mm，5um)、SHSEIDO CAPCELL PK C18(4.6X250mm，5um)、Waters Symmetry C18((4.6X250mm，5um)共4支不同厂家的C18色谱柱的适用性。

结果见下图1，表3，4款柱子均能对淫羊藿破壁饮片进行指纹图谱分析，且4款柱子分离所获谱图的相似度大于0.97。其中Thermo Hipersil分析的色谱峰拖尾比较严重，可能是由于柱效下降所致，其余三款柱子分离效果都比较理想，由此判断该方法的柱子适用性好。

表3 柱子适用性考察结果

3.2 专属性考察

考察此方法建立的淫羊藿破壁饮片指纹图谱是否能够表达该品种的特征，不受其他的影响，即唯一性。考察空白溶剂图谱(阴性样品图谱)在相应保留时间处有无色谱峰，有无干扰，是否符合要求。

结果如图2所示：空白溶剂图谱在相应保留时间处无色谱峰，无干扰，符合指纹图谱质量控制技术的要求。

3.3 仪器精密度考察

取淫羊藿破壁饮片(20140403)样品，按上述确定的供试品制备方法进行制备，连续进样6次，按上述确定的色谱条件进行分析，记录指纹图谱，计算6次进样所得指纹图谱的各主要色谱峰的峰面积、相对峰面积RSD及所得指纹图谱的相似度。结果如表4，表5所示。

表4 淫羊藿破壁饮片指纹图谱仪器精密度相似度

表5 淫羊藿破壁饮片仪器精密度考察主要色谱峰相对峰面积

6谱图的相似度达0.998以上，精密度考察的相似度达0.998以上，淫羊藿破壁饮片主要色谱峰峰面积及相对峰面积RSD均小于3％，符合中药注射剂指纹图谱控制技术要求。

3.4 稳定性实验

取淫羊藿破壁饮片(20140403)样品按上述确定的供试品制备方法和色谱条件，，分别于0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，16h，20h，24h内测定，所得指纹图谱的相似度见表6。结果显示：10张谱图的相似度达0.996以上，计算24h内各主要色谱峰的峰面积RSD小于5％，相对峰面积RSD也基本符合要求，说明该样品在24小时内的性质是稳定的。

表6 淫羊藿破壁饮片稳定性考察指纹图谱相似度

表7 淫羊藿破壁饮片指纹图谱稳定性考察主要色谱峰相对峰面积表

3.5 重复性实验

取同一批次淫羊藿破壁饮片(20140403)样品，按供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品，按上述确定的色谱条件进行分析，记录指纹图谱，计算6份样品各主要色谱峰的峰面积和相对峰面积及所得指纹图谱的相似度，结果如表8，表9所示：

表8 淫羊藿破壁饮片重复性实验相似度

表9 淫羊藿破壁饮片重复性考察主要色谱峰相对峰面积

由上表得出重复性考察所得6张指纹图谱相似度大于0.998，且各主要色谱峰峰面积RSD值小于3％，相对峰面积RSD小于5％，整体符合中药指纹图谱控制技术的要求，说明该方法的重复性良好。

4 淫羊藿破壁饮片指纹图谱的共有模式的建立

按照上述确定的样品制备方法及色谱条件对已经收集到的14批淫羊藿破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱。以图谱中峰面积较大，峰形较好，其保留时间适中的淫羊藿苷峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。利用中智药业集团中药指纹图谱数据库的指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较(以平均谱图为共有模式)，计算相似度，并建立淫羊藿破壁饮片指纹图谱共有模式(见图3)。

样品制备：精确称取淫羊藿破壁饮片20120201、20120701、20121001、20130501、20130701、20131001、20131101、20140101、20140301、20140403、20140501、20140502、14040101、14040102各约0.20g于具塞锥形瓶中，加入50％稀乙醇20ml，浸润30min,超声提取30min(320W、4200Hz)，取出，冷却至室温，1200R/min离心5min,上清液倾入20ml量瓶中，加50％乙醇稀释并定容至20ml，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18(4.6mmX250mm,5um)色谱柱，柱温35℃，流速0.8ml/min,检测波长272nm，流动相：乙腈-水系统，梯度洗脱：0min-20min-28min-60min,乙腈的变化为20％-27％-27％-50％，进样量样品20ul、对照品10ul。

将所得的14批次样品指纹图谱导入中智指纹图谱分析软件进行数据处理，结果如表10所示：各谱图相似度RSD值小于2％，14批次样品共有指图谱主要化学成分组成相似相对比例差异比较大，但共有指纹峰相对峰面积差异在指纹图谱控制技术要求的范围内。以淫羊藿苷峰为对照峰，选择峰面积较大，相对稳定的16个峰作为淫羊藿破壁饮片的共有特征峰，其余15个共有指纹峰与淫羊藿苷峰的相对保留时间分别为：0.248、0.507、0.691、0.772、0.829、0.875、0.931、0.966、1.128、1.262、1.458、1.652、1.667、1.781、1.832。

表10 14批次淫羊藿破壁饮片相似度数据

表11 14批次样品共有指纹峰的相对保留时间

表12 14批次淫羊藿破壁饮片共有指纹峰相对峰面积

5 结论及讨论

5.1 采用50％乙醇提取淫羊藿破壁饮片，成分提取相对完全。但50％乙醇提取液过滤困难。为了减少误差及过滤时间，在药典基础上将提取后补重，改为提取后离心定容。

5.2 分析14批次淫羊藿破壁饮片样品数据得出：即使是同一科，同一种属，同一产地，不同批次的淫羊藿破壁饮片，其主要化学成分组成相似，但是含量及相对比例差异比较大。

二、淫羊藿破壁饮片的质量检测

供试品：抽取中智药业淫羊藿破壁粉体和破壁饮片共10批次进行质量检测。市场外购5批次其他厂家淫羊藿破壁饮片进行质量检测。

检测方法如下：

供试品溶液的制备：

取淫羊藿破壁饮片约0.200g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20mL，浸润30min,超声提取30min(320W、4200Hz)，取出，冷却至室温，1200r/min离心5min,上清液倾入20ml量瓶中，加稀乙醇稀释并定容至20ml，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

对照品配制：

精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解配制成浓度分别为0.116mg/ml的混合对照品溶液。

色谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为272nm；流速：0.8mL/min。

测定：精密吸取供试品溶液20μl，对照品10ul注入色谱仪，测定，记录图谱，即得。

合格指标的建立及指定图谱、判断方法：

供试品色谱中，应呈现16个与图3-淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。以9号淫羊藿苷峰为对照峰，其余15个共有指纹峰的相对保留时间分别为0.248、0.507、0.691、0.772、0.829、0.875、0.931、0.966、1.128、、1.262、1.458、1.652、1.667、1.781、1.832，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格。

结果：中智药业10批次样品均符合质量要求，外购样品其中4批次符合质量要求，1批次为不合格品。

Claims (2)

1.淫羊藿破壁饮片的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿破壁饮片0.200g，加入50％稀乙醇20mL，超声提取30min，冷却至室温，1200r/min离心5min,上清液倾入20ml量瓶中，加50％稀乙醇稀释并定容至20ml，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用；

(2)对照品配制：精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解配制成浓度为0.116mg/ml的对照品溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，水溶液为流动相B，梯度洗脱：0min-20min-28min-60min，流动相A:20％-27％-27％-50％；柱温为35℃；检测波长为272nm；流速：0.8mL/min；供试品溶液进液量20μl，对照品10ul；

(4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法和色谱条件对10批以上的淫羊霍破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以淫羊藿苷峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立淫羊藿破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱，包括16个特征峰。

2.一种淫羊藿破壁饮片的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按权利要求1所述的构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品溶液20μl，淫羊藿苷对照品10ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。

(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，应呈现16个与图3-淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90；淫羊藿苷峰为对照峰，其余15个共有指纹峰的相对保留时间分别为0.248、0.507、0.691、0.772、0.829、0.875、0.931、0.966、1.128、、1.262、1.458、1.652、1.667、1.781、1.832，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格品。