CN104849363A - 鱼腥草破壁饮片的指纹图谱构建及其质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鱼腥草破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法。该方法以槲皮苷为对照，在柱温30℃，326nm波长，乙腈为流动相A，0.1％的磷酸溶液为流动相B，洗脱梯度0min-45min，流动相A变化10％-27％的色谱条件下，对10批以上样品进行HPLC分析，建立共有模式标准图谱和判断指标。将同一色谱条件下的待测样品图谱与之比较，检测待测样品的质量。本发明是首次针对鱼腥草破壁饮片建立的HPLC共有模式标准图谱及质量检测方法。该图谱较全面涵盖了鱼腥草破壁饮片主要活性成分的图谱信息，专属性强，检测快速准确；并能有效控制药材、破壁粉体、破壁饮片的整体质量。

Description

鱼腥草破壁饮片的指纹图谱构建及其质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药饮片的质量检测方法，尤其是鱼腥草破壁饮片的HPLC指纹标准图谱构建及其质量检测方法。

背景技术

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜HouttuyniacordataThunb.的新鲜全草或干燥地上部分。有效成分主要是挥发油、黄酮类和苯丙素类物质。挥发油中功能性成分为醛酮化合物,主要是癸酰乙醛及月桂醛，两者均有鱼腥草特异气味。黄酮类物质主要是槲皮素、槲皮苷、异槲皮素、金丝桃苷、阿夫苷、瑞诺苷和芸香苷。目前鱼腥草的质量控制研究也比较多，主要的研究方法有：1、以挥发油或总黄酮为指标控制质量标准。2、以GC—MS指纹图谱来控制鱼腥草挥发油成分的质量，以HPLC—DAD—MS指纹图谱控制鱼腥草非挥发性成分质量，两者结合可较全面地控制鱼腥草及其制剂的质量。3、以指纹图谱结合一测多评模式控制鱼腥草质量。以何兵，刘艳等在《指纹图谱结合一测多评模式在中药鱼腥草质量评价中的应用研究》中记载的方法为代表。但在实际操作中，鱼腥草的挥发油类成份不稳定，易氧化聚合失效，在干制或不当提取过程中，其有效成分会发生较大的质和量的变化，直接影响到药物的疗效，而黄酮、绿原酸及总的浸出物不具有专属性，也未能系统，完整的反映该药的内在质量，因而不能有效的控制样品的临床疗效。故目前的技术方法均不完善。

中药破壁饮片是利用现代超微粉碎技术将传统饮片进行破细胞壁粉碎成粒度分布D90小于45μm的微细颗粒，再制成30～100目的颗粒。相对于传统饮片具有色泽一致，质量均一，稳定性好的特点，为创新型中药饮片。由于中药破壁饮片不具传统中药饮片的形态特征，破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、质量检测方法不能完全适用。发明人参照何兵，刘艳等《指纹图谱结合一测多评模式在中药鱼腥草质量评价中的应用研究》的方法对鱼腥草破壁饮片进行检测，但效果并不理想，此文献的方法并不适用特殊的破细胞壁饮片。此文献的方法难以将鱼腥草破壁饮片HPLC全谱中的主成分峰分离开，因此，必须针对中药破壁饮片建立专属性强，全面反映中药破壁饮片质量状况的检测方法。而建立一项新的质量检测方法并非易事，例如检测条件、对照品的选择和供试品的制备方法等均需要研究考量并进行验证。虽然现有技术中有涉及中药指纹图谱的检测方法，但并无针对形态特殊的中药破壁饮片的方法，且存在专属性、稳定性、重现性和精密度差缺陷，不能完全反应饮片的质量情况的缺陷。

发明内容

为克服以上缺陷，本发明提供了一种适用于鱼腥草破壁饮片的HPLC指纹标准图谱构建方法，并在此基础上进一步提供该饮片的质量检测方法。

所述的鱼腥草破壁饮片的标准图谱构建方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精确称取鱼腥草破壁饮片样品约0.500g，加入90％的甲醇25ml，浸润30min,超声提取30min，用0.22um微孔滤膜过滤备用；

(2)对照品溶液配制：精密称取槲皮苷对照品适量，加90％甲醇配制成约0.16mg/ml对照品溶液；(3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温30℃，流速1.2ml/min，检测波长326nm，流动相A为乙腈，B为0.1％的磷酸溶液；梯度洗脱：0min-45min，乙腈变化为10％-27％，进样量10ul。

(4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法和色谱条件对10批以上的鱼腥草破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以槲皮苷峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立鱼腥草破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱如图3所示，包括7个特征峰。

鱼腥草破壁饮片的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)按上述标准图谱构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品及对照品溶液各10ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。

(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法

供试品色谱中，应呈现7个与图3-鱼腥草破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.95。以槲皮苷峰为对照峰，其余6个共有特征峰相对保留时间分别为：0.196、0.300、0.337、0.761、0.788、0.817，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格品。

本发明是首次针对鱼腥草破壁饮片质量控制所构建的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱及质量检测方法。该方法克服了现有技术不能完全适用鱼腥草破壁饮片质量控制的缺陷。该图谱较全面涵盖了鱼腥草饮片主要活性成分的图谱信息，专属性明显优于现有的同类指纹图谱方法。经试验验证该方法的稳定性、重现性和精密度均达到法定要求，且操作简单，检测快速准确；并能有效控制鱼腥草药材、破壁粉体、破壁饮片整体质量及鉴别伪品。

附图说明

图1是鱼腥草破壁饮片预实验比较图谱。

图2是鱼腥草破壁饮片指纹图谱专属性考察图谱。

图3是鱼腥草破壁饮片共有模式指纹图谱。

图4鱼腥草20140301批次原药材-中间体-成品相关性图谱。

图5是鱼腥草20140302批次原药材-中间体-成品相关性图谱。

图6是鱼腥草021408P081批次原药材-中间体-成品相关性图谱。

具体实施方式

1仪器与试样 

1.1仪器：电热重蒸馏水器(上海三申医疗器械有限公司)、电热恒温水浴锅HWS24(上海一恒科技有限公司、FEJ-200电子称(d＝0.1g)、万分之一电子天平AB204-S(METTLERTOLEOD)、十万分之一电子天平AUW220D(岛津公司)安捷伦1200RLC快速液相色谱仪(配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD蒸发光检测器、G1312B二元泵、G1329B自动进样器、G1322A脱气机G1316B柱温箱，Agilent Chemstation色谱工作站、Agilent ZORBAX-C18 5μm(250mm×4.6mm)、Agilent ZORBAX-C18 1.8μm(50mm×4.6mm)、菲罗门PhenomenexSynergi 4u Fusion-RP 80A(250mm×4.6mm)色谱柱、KQ-400KOE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂：乙腈(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、甲醇(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、磷酸(广州化学试剂厂)，甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)、重蒸水(自制)。

供试品：鱼腥草破壁饮片、破壁粉体及原药材(均由中山中智药业集团提供)

对照品：槲皮苷对照品(111538-200504)、异槲皮苷对照品(111809-201001)、金丝桃苷对照品(111521-201004)、芦丁对照品(100080-200707)、绿原酸(110753-201314)，均由中国食品药品检定研究院提供。

2实验方法

2.1鱼腥草破壁饮片预实验

样品制备：精确称取鱼腥草破壁饮片(批号20120702)0.5016g于50ml具塞锥形瓶中，加入90％甲醇25ml,称定重量，浸润30min,超声提取(功率320w，频率4200KHZ)30min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件1：Agilent ZORBAX-C18 5μm(250mm×4.6mm)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，流动相乙腈-0.1％磷酸，梯度洗脱：0min-10min-35min-37min-40min,乙腈百分比变化为：6％-8％-27％-6％-6％；检测波长254nm,326nm,进样量10ul。(命名为参考文献5)。

色谱条件2：Agilent ZORBAX-C18 5μm(250mm×4.6mm)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，流动相乙腈-水，梯度洗脱：0min-60min,乙腈百分比变化为：5％-100％；检测波长210nm、254nm、280nm、325nm,进样量10ul。(命名为基础梯度)。

色谱条件3：Agilent ZORBAX-C18 5μm(250mm×4.6mm)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，流动相乙腈-0.1％磷酸，梯度洗脱：0min-60min,乙腈百分比变化为：5％-100％；检测波长210nm、254nm、280nm、325nm,进样量10ul。(命名为基础梯度+01磷酸)。

色谱条件4：Agilent ZORBAX-C18 5μm(250mm×4.6mm)色谱柱，柱温20℃，流速1ml/min，流动相甲醇--0.1％磷酸，梯度洗脱0min-40min-50min-60min-70min,甲醇百分比变化为：10％-20％-30％-10％-10％；检测波长320nm、325nm,进样量20ul。(命名为参考文献2)。

色谱条件5：Agilent ZORBAX-C18 5μm(250mm×4.6mm)色谱柱，柱温20℃，流速1ml/min，流动相甲醇--0.1％磷酸，梯度洗脱0min-5min-10min-20min-30min-35min-50min,甲醇百分比变化为：30％-30％-55％-55％-95％-100％；检测波长280nm、320nm,进样量20ul。(命名为参考文献4)。

以上参考文献为内部非公开文献，结果如图1所示。

由图谱可见：色谱条件5及色谱条件4的方法重现性差，色谱条件1的方法在实验室重现性相对较好，且由基础梯度分析结果可见，色谱条件1谱图中样品出峰数目基本完全，于是将采用色谱条件1对鱼腥草破壁饮片特征指纹图谱进行研究。

2.2鱼腥草破壁饮片指纹图谱研究用色谱柱的初步选择

样品制备：精确称取鱼腥草破壁饮片(批号20120702)0.5016g于50ml具塞锥形瓶中，加入90％甲醇25ml,称定重量，浸润30min,超声提取(功率320w，频率4200KHZ)30min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：采用预实验选择的色谱条件1分析样品，发现：不同柱子分析供试品所得谱图效果差异不大，认为：鱼腥草破壁饮片样品对柱子适用性比较高。

2.3供试品制备方法考察

由于直接采用预实验的供试品制备方法所得供试品的分析效果理想，在此，仅在预实验“供试品制备方法”的基础上进行简化、优化，考察鱼腥草破壁饮片提取液浓缩与否对分析结果的影响。

样品制备：精确称取同一批次鱼腥草破壁饮片样品，6份，①0.5082g②0.5031g③0.5082g④0.50831⑤0.5068g⑥0.5067g，分别加入90％甲醇25ml，称定重量，浸润30min,超声(320w、4200KHz)提取30min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，①、③、⑤号，粗滤后，80℃水浴蒸干，再用90％甲醇溶解并定容至10ml,②、④、⑥号样品则粗滤后，用0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Thermo Acclaim^TMC18(4.6X250mm，5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min，流动相，乙腈-0.1％磷酸溶液系统，梯度洗脱：0min-10min-35min-37min-40min,乙腈变化为6％-8％-27％-6％-6％，检测波长254nm，进样量10ul。

记录图谱，分析结果显示：提取液浓缩与否，对鱼腥草破壁饮片化学成分的种类影响不明显，从操作简便考虑，选择提取液不进行浓缩，直接用于分析。

2.4色谱条件优化 

2.4.1洗脱梯度优化 

样品制备：精确称取同一批次鱼腥草破壁饮片0.5014g于50ml具塞锥形瓶中，加入90％甲醇25ml，称定重量，浸润30min,超声提取30min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，再用0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件(鱼腥草梯度1)：Thermo Acclaim^TM C18(4.6X250mm.5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min流动相，乙腈-0.1％磷酸溶液系统，梯度洗脱，0min-40min,乙腈变化为8％-27％，检测波长254、326.325、280nm，进样量10ul。

色谱条件(鱼腥草梯度2)：Thermo Acclaim^TM C18(4.6X250mm.5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min流动相，乙腈-0.1％磷酸溶液系统，梯度洗脱，0min-40min,乙腈变化为10％-27％，检测波长254、326.325、280nm，进样量10ul。

色谱条件(鱼腥草梯度3)：Thermo Acclaim^TM C18(4.6X250mm.5um)色谱柱，柱温30℃，流速1ml/min流动相，乙腈-0.1％磷酸溶液系统，梯度洗脱，0min-45min,乙腈变化为8％-27％，检测波长254、326.325、280nm，进样量10ul。

结果：通过分析鱼腥草破壁饮片梯度1至梯度3的实验数据得出，将洗脱系统中乙腈的起始浓度提高，降低变化速率，能提高分离度，出峰时间提前，谱图的整体效果改善。选择鱼腥草梯度3作为洗脱条件。

2.4.2洗脱流速考察 

样品制备：精确称取同一批次鱼腥草破壁饮片0.5014g于50ml具塞锥形瓶中，加入90％甲醇25ml，称定重量，浸润30min,超声提取30min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，再用0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Thermo Acclaim^TM C18(4.6X250mm.5um)色谱柱，柱温30℃，流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液系统，梯度洗脱，0min-45min,乙腈变化为8％-27％，检测波长254、326、325、280nm，进样量10ul。分别考察流速为0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的分析效果。

将上述测得的4张谱图导入中智指纹图谱分析软件分析图显示，流速减慢，分离度增加但是峰形变差；流速提高，峰形瘦高且样品洗脱较完全，1.2ml/min谱图的分离度已经达到要求，因此选择1.2ml/min作为最佳流速。

2.5鱼腥草破壁饮片特征指纹图谱分析方法确定

样品制备：精确称取鱼腥草破壁饮片约0.50g，于50ml具塞锥形瓶中，加入90％甲醇25ml，称定重量，浸润30min,超声提取30min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，再用0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶柱，流速1.2ml/min，柱温30℃，流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液系统，梯度洗脱，0min-45min,乙腈变化为8％-27％，检测波长326nm，进样量10ul，流速1.2ml/min。

2.6鱼腥草破壁饮片方法学考察

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，对鱼腥草破壁饮片指纹图谱分析方法进行方法学考察。

2.6.1专属性

考察此方法建立的鱼腥草破壁饮片指纹图谱是否能够表达该品种的特征，不受其他的影响，即唯一性。考察空白溶剂图谱(阴性样品图谱)在相应保留时间处有无色谱峰，有无干扰，是否符合要求。

结果如图2所示：通过谱图我们得出空白溶剂图谱在相应保留时间处无色谱峰，无干扰，符合指纹图谱质量控制技术的要求。

2.6.2仪器精密度考察

取同一供试品溶液，连续进样6次，记录指纹图谱，计算6次进样所得指纹图谱的各主 要色谱峰的峰面积及相对峰面积RSD及所得指纹图谱的相似度。结果如表1所示：6谱图的相似度0.9996以上，主要色谱峰的峰面积及相对峰面积RSD均小于5％，符合中药注射剂指纹图谱技术要求。

表1-1鱼腥草破壁饮片精密度相似度表

表1-2鱼腥草破壁饮片仪器精密度考察主要色谱峰相对峰面积表

2.6.3稳定性考察 

取鱼腥草破壁饮片1批，按供试品制备方法，制备样品溶液，分别于0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h内测定，计算24h内各主要色谱峰的峰面积、相对峰面积RSD及所得指纹图谱的相似度。结果见表2所示，稳定性测得的8张谱图的相似度0.9995以上，各主要色谱峰峰面积及相对峰面积RSD均小于3％，说明该样品在24小时内稳定。

表2-1鱼腥草破壁饮片24h稳定性相似度表

表2-2鱼腥草破壁饮片稳定性考察主要色谱峰相对峰面积表

2.6.4重复性考察 

取同一批次鱼腥草破壁饮片样品，按供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品，记录指纹图谱，计算6次样品各主要色谱峰的峰面积和含量及所得指纹图谱的相似度，结果如表3，6重复性样品相似度0.9997以上，主要色谱峰峰面积及相对峰面积RSD均小于3％，符合中药注射剂指纹图谱技术要求，说明该方法的重复性好。

表3-1鱼腥草破壁饮片重复性相似度表

表3-2鱼腥草破壁饮片重复性考察主要色谱峰相对峰面积表

2.6.5鱼腥草破壁饮片仪器适用性考察

取本品(20130901)，分别在戴安U3000UHPLC和Agilent1200RRLC液相色谱仪上采用Waters Symmetry(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱，按照拟定的方法测定。结果显示：两不同仪器测得的鱼腥草破壁饮片特征图谱相似，说明该方法仪器适用性比较广。

2.7鱼腥草破壁饮片主要色谱峰指认

通过参考文献资料，分别用槲皮苷、异槲皮苷、金丝桃苷、芦丁和绿原酸对照品对鱼腥草破壁饮片进行色谱峰的指认，结果：结合紫外吸收谱图，各对照峰在样品中均能找到与其保留时间及紫外吸收图一致的色谱峰。

2.8鱼腥草破壁饮片指纹图谱的共有模式的建立

按照上述确定的样品制备方法及色谱条件对已经收集到的8批以中试生产鱼腥草破壁饮片样品及5批大生产鱼腥草破壁饮片、1批次鱼腥代用茶共14批次样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱。以图谱中峰面积最大，峰形较好的槲皮苷峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。利用中智药业集团中药指纹图谱数据库的指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较(以平均谱图为共有模式)，计算相似度，并建立鱼腥草破壁饮片指纹图谱共有模式(见图3)。

样品制备：精确称上述14批次鱼腥草破壁饮片样品各约0.50g，于具塞锥形瓶中，加入90％的甲醇25ml，，称定重量，浸润30min,超声提取(320W，4200KHz)30min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um，微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18(4.6mmX250mm，5um)色谱柱，柱温30℃，流速1.2ml/min，检测波长326nm，流动相乙腈-0.1％的磷酸：梯度洗脱：0min-45min，乙腈变化为10％-27％，进样量10ul。

将所得14批鱼腥草破壁饮片指纹图谱图导入中智指纹图谱分析软件进行分析，结果如图3，表4所示：14批次鱼腥草破壁饮片指纹图谱通过中智指纹图谱分析软件进行数据统计分析，最终得出14批次样品谱图相似度均大于0.92，其中中试生产的样品相似度相对比较低，而大生产样品相似度0.99以上，说明鱼腥草破壁饮片大生产工艺相对稳定，于是选择大生产的5批次样品建立共有模式，根据注射剂指纹图谱控制技术要求，从共有模式中提取共有峰，选择峰面积较大，分离度较好的峰作为共有指纹峰，最终提取了7个共有指纹峰作为鱼腥草破壁饮片共有指纹峰。7个共有峰的相对保留时间RSD均小于3％，符合注射剂指纹图谱控制技术要求。图3是鱼腥草破壁饮片共有模式指纹图谱，其中，2号峰为绿原酸，4号为芦丁，5号为金丝桃苷、6号为异槲皮苷，7号为槲皮苷峰。

表4-1 5批次大生产鱼腥草破壁饮片相似度表

表4-2 5批次大生产鱼腥草破壁饮片相对保留时间(以7号槲皮苷为参照峰)

表4-3 5批次大生产鱼腥草破壁饮片共有指纹峰相对峰面积(以7号槲皮苷为参照峰)

6鱼腥草破壁饮片原料药材-中间体-成品之间相关性分析

分别收集3批次鱼腥草原料药材20140301、021408P801、20140302及其对应的中间品-鱼腥草破壁粉体、成品-鱼腥草破壁饮片。

样品制备：分别精确称取上述9份样品各约0.20g，加入90％甲醇25ml，称定重量，浸润30min,超声提取(320W，4200HZ)提取30min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，再用0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Waters symmetry C18(4.6mm*250mm,5um)色谱柱，柱温30℃,流速1.2ml/min, 检测波长326nm,流动相乙腈-0.1％磷酸溶液，梯度洗脱：0min-45min,乙腈变化为10％-27％，进样量10ul。

将分析的色谱图导入中智指纹图谱分析软件进行分析，结果如下图4-图6及表10所示。

表10-1鱼腥草破壁饮片021408P081相关性分析

表10-2鱼腥草破壁饮片20140302相关性分析

表10-3鱼腥草破壁饮片20140301相关性分析

由上述的三谱图得知，每一批次鱼腥草破壁饮片、鱼腥草原药材、鱼腥草破壁粉体三者谱图相似度均大于0.99，说明原料药材-中间体-成品相关性较好，化学成分组成基本相同，但是破壁饮片成品比原料药材及中间体在4min处多一个小色谱峰，；从主要化学成分表中得出鱼腥草原料药材主要色谱峰峰面积明显小于与其相对应的中间品-破壁粉体及成品-破壁饮片，进一步说明了鱼腥草药材制成破壁饮片大大提高了其有效成分的溶出，制备过程中，鱼腥草化学性质相对稳定。

二、鱼腥草破壁饮片的质量检测。

供试品：抽取中智药业鱼腥草破壁粉体和破壁饮片共5批次进行质量检测。市场外购5批次其他厂家鱼腥草破壁饮片进行质量检测。

检测方法如下：

供试品溶液的制备：精确称取鱼腥草破壁饮片样品约0.500g，于具塞锥形瓶中，加入90％的甲醇25ml，称定重量，浸润30min,超声提取(320W，4200KHz)30min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤备用。

对照品配制：精密称取槲皮苷对照品适量，加90％甲醇配制成约0.16mg/ml对照品溶液。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mmX250mm，5um)，柱温30℃，流速1.2ml/min，检测波长326nm，流动相A为乙腈，B为0.1％的磷酸溶液：梯度洗脱：0min-45min，乙腈变化为10％-27％，进样量10ul。

测定方法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10ul注入液相色谱仪，测定，记录图谱，即得。

合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，应呈现7个与鱼腥草破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试 品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.95。以槲皮苷峰为对照峰，其余6个共有特征峰相对保留时间分别为：0.196、0.300、0.337、0.761、0.788、0.817，各峰相对保留时间RSD≤±5％为合格品。

结果：中智药业5批次样品均符合质量要求，外购样品其中5批次均符合质量要求，为合格品。

Claims (2)

1.鱼腥草破壁饮片的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精确称取鱼腥草破壁饮片样品约0.500g，加入90％的甲醇25ml，浸润30min,超声提取30min，用0.22um微孔滤膜过滤备用；

(2)对照品溶液配制：精密称取槲皮苷对照品适量，加90％甲醇配制成约0.16mg/ml对照品溶液；(3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温30℃，流速1.2ml/min，检测波长326nm，流动相A为乙腈，B为0.1％的磷酸溶液；梯度洗脱：0min-45min，乙腈变化为10％-27％，进样量10ul。

(4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法及和色谱条件对10批以上的鱼腥草破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以槲皮苷峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立鱼腥草破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱，包括7个特征峰。

2.一种鱼腥草破壁饮片的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按权利要求1所述的构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品及对照品溶液各10ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。

(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法

供试品色谱中，应呈现7个与图3-鱼腥草破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.95。以槲皮苷峰为对照峰，其余6个共有特征峰相对保留时间分别为：0.196、0.300、0.337、0.761、0.788、0.817，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格品。