KR20110004994A

KR20110004994A - 토종 엉겅퀴로부터 약리활성물질을 추출하는 방법 및 이를 이용한 기능성 제품

Info

Publication number: KR20110004994A
Application number: KR1020090062458A
Authority: KR
Inventors: 박화식; 강기운; 임정아; 박세은; 박가은
Original assignee: 전라남도
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2011-01-17

Abstract

본 발명에서는 토종 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense K_ITAMURA)로부터 간 보호 물질인 실리마린과 제니스틴, 다이드제닌, 퀘르스틴 등과 같은 여성호르몬을 추출하는 방법 및 상기 유용한 약리활성물질을 함유한 기능성 제품을 제조하는 방법이 제시된다.

본 발명을 이용하면 우리나라 전역에 대량으로 번식하는 토종 엉겅퀴로부터 손쉽게 고부가 가치의 약리활성물질을 추출할 수 있다. 또한 이를 건강식품으로 제조하여 국민건강 증진과 농가소득 향상의 효과가 기대된다.

토종 엉겅퀴, 약리활성, 실리마린, 여성호르몬, 플로보노이드, 기능성 식품

Description

토종 엉겅퀴로부터 약리활성물질을 추출하는 방법 및 이를 이용한 기능성 제품{The method of extracting medical active material from Cirsium japonicum var. ussuriense Kitamura and the functional foods using it}

본 발명은 토종 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense K_ITAMURA)로부터 간 보호 물질인 실리마린과 제니스틴, 다이드제닌, 퀘르스틴 등과 같은 여성호르몬을 추출하는 방법 및 상기 유용한 약리활성물질을 함유한 기능성 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.

토종 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense K_ITAMURA)는 초롱꽃목 국화화 엉겅퀴속 식물로서 우리나라와 일본에 넓게 분포하며 크기가 1M 전후의 다년초식물로서 향토명은 대계, 소계, 조방가세 등으로 불리며 예로부터 해독, 지혈, 강장 및 여성 질환의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

또한 엉겅퀴속 식물은 플라노보이드(flavonoids)계 페놀화합물이 다량으로 함유되어 있어 항산화, 항노화 효과를 나타내며 여성호르몬인 에스트로겐과 유사한 구조, 기능을 갖는 식물성 호르몬인 파이토에스트로겐(phytoestrogen)을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

상기 파이토에스트로겐(phytoestrogen)의 수요는 미국에서는 전체 호르몬 대체 요법시장 규모인 170억 달러 (한화 약 200조) 중 약 30%에 해당되는 어마어마한 규모라 할 수 있다. 대표적인 천연 대체요법(식물에서 파이토에스트로겐을 추출하는 방법)과 관련된 의약품은 달맞이 꽃에서 추출한 "감마리놀렌산"과 콩에서 추출한 "이소 플라본"등을 들 수 있다.

그러나 아직까지 국내에 지천으로 번식하고 있는 토종 엉겅퀴로부터 유용한 약리활성물질을 확인하고 추출하는 방법에 대한 연구는 미진한 실정이다.

이에 본 발명에서는 토종 엉겅퀴를 사용하여 유용한 약리활성물질을 확인하고 추출하는 신규한 방법을 제시하는 것을 해결하고자 하는 최우선 과제로 삼고,

또한 토종 엉겅퀴를 사용한 식혜, 차 등의 기능성 식품의 제조방법을 제시하여 농가 소득향상과 국민 건강 증진에 기여하고자 함을 해결하고자 하는 두번째 과제로 삼는다.

상기한 과제는 토종 엉겅퀴로부터 간보호 물질인 실리마린(Silymarin) 및 여성 호르몬을 추출하고 분리 정제하는 방법을 통해 해결되는데, 구체적으로

토종 엉겅퀴를 채취하여 세척 후 70℃의 건조 오븐에서 3일간 건조시키는 단계와;

상기 건조된 토종 엉겅퀴를 모터로 분쇄하여 건조 시료를 제조하는 단계와;

상기 제조된 토종 엉겅퀴의 건조 시료를 항온 항습기에 보관하여 온도와 습도를 일정하게 유지시키는 단계와;

상기 토종 엉겅퀴의 건조 시료를 70~90%의 메탄올을 사용하여 50~70℃의 온도에서 100분~150분 동안 2~5회 환류추출하는 단계와;

상기 환류추출된 메탄올 용액을 상온으로 냉각한 후 회전진공 농축기를 사용하여 농축하는 단계와;

상기 농축된 메탄올 용액에 에틸 아세테이트 130~200 ml를 첨가하는 단계;를 거치게 된다.

또한 본 발명은 토종 엉겅퀴로부터 식혜, 차 등과 같은 기능성 식품의 제조방법을 통해 상기한 두번째 과제를 해결하고자 한다.

이를 위하여 강구된 구체적인 수단은 토종 엉겅퀴의 잎과 뿌리를 분리하여 세척한 후, 가마솥에서 1~2시간 동안 끓인 후 가는 체를 이용하여 토종 엉겅퀴 시료를 거르는 단계와; 시료를 밥솥에 넣어 보리가루와 흰쌀밥을 함께 넣고 8~12시간 동안 40~50℃에서 가열하는 단계로 구성된다.

토종 엉겅퀴를 이용한 차를 제조하는 방법은 토종 엉겅퀴의 잎, 꽃, 뿌리를 각각 분리하여 세척하여 뿌리는 2주간 그늘진 곳에서 자연 건조시키고, 꽃은 -60 ~ -80℃의 온도에서 동결 건조시키며, 잎은 70~80℃의 온도에서 20분 동안 볶은 후 음지에서 자연 건조시킨 후 상기 잎, 뿌리, 꽃을 혼합하는 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 토종 엉겅퀴를 이용한 약리활성물질의 추출방법 및 기능성 식품의 제조방법을 이용하면 우리나라 전역에 대량으로 번식하는 토종 엉겅퀴로부터 손쉽게 고부가가치의 약리활성물질을 추출할 수는 효과가 기대될 뿐만 아니라 이를 건강식품으로 제조하여 국민 건강 증진과 농가소득 향상의 효과가 기대된다.

이하 도면과 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

도 1은 토종 엉겅퀴로부터 유용한 약리활성물질인 실리마린을 추출하는 단계를 나타내는 순서도이다. 도 1에 도시된 바와 같이 토종 엉겅퀴로부터 실리마린을 추출하는 방법은 우선 토종 엉겅퀴를 채취하여 세척 후 70℃의 건조 오븐에서 3일간 건조시킨 후 모터로 분쇄하여 건조 시료를 제조하고 이를 항온 항습기에 보관하여 온도와 습도를 일정하게 유지시킨다. 그런 다음70~90%의 메탄올을 사용하여 50~70℃의 온도에서 100분~150분 동안 2~5회 환류 추출하고 상온으로 냉각한 후 농축하고 에틸 아세테이트 130~200 ml를 첨가하는 단계를 거치게 된다. 구체적인 실시예는 다음과 같다.

[실시예 1: 토종 엉겅퀴의 함유 성분 정제 및 실리마린의 분석]

토종 엉겅퀴의 종자 200g을 채취하여 80%의 메틸알콜 500ml에 넣고 60℃에서 120분간 3회에 걸쳐 환류 추출한 후 NO2 여과지로 불순물을 여과하는 과정을 거쳤다. 그런 다음 상기 메탄올 용액을 상온으로 냉각시켜 진공 회전농축기로 농축시켰다.

상기 농축된 메틸알콜에 에틸 아세테이트 150ml를 첨가하여 수층과 용매를 분획시킨 후 감압 로터리 증발장치를 사용하여 알콜성분을 전량 증발시켰다. 잔존하는 수층을 동결 건조기에 넣고 동결 건조시켰다.

상기 동결 건조된 시료 1ml를 취하여 254nm의 파장과 1ml/min의 부피 유량 조건하에서 HPLC분석을 실시하였다.

뿌리에 대해서도 실시예 1과 동일하게 실시하였고 그 결과를 표 1 및 도2, 도3을 통해 나타내었다.

[표 1: 토종 엉겅퀴 종자와 뿌리에서의 실리마린 함유량 분석결과]

구분	성분	면적 (mAu*S)	함량/0.01g중 μg/ml	실리마린량 /450g	총량 (mg)	비고
종자	Silycristin	573	354	35mg	109.3	0.01g/ml EtOAc 분획용해 HPLC분석
	Silydianin	396	717	71mg
	Silybin	119.7	33.9	3.3mg
	Isosilybin	0	-	0
뿌리	Silycristin	0	-	0	13	0.01g/ml EtOAc 분획용해 HPLC분석
	Silydianin	130	339	13mg
	Silybin	0	-	0
	Isosilybin	0	-	0

도 2는 토종 엉겅퀴 종자의 실리마린 함량을 분석한 그래프이고 도 3은 토종 엉겅퀴 뿌리의 실리마린 함량을 분석한 그래프이다. 표1, 도2 및 도3을 통해 알 수 있듯이 토종 엉겅퀴의 뿌리 및 종자를 사용하여 간 해독성 물질인 실리마린 성분이 검출되었음을 알 수 있다.

[실시예 2: 토종 엉겅퀴로부터 여성호르몬의 활성 검정]

1. 시료의 조제

상기 농축된 메틸알콜에 에틸 아세테이트 150ml를 첨가하여 수층과 용매를 분획시킨 후 감압 로터리 증발장치를 사용하여 알콜성분을 전량 증발시켰다. 잔존 하는 수층을 동결 건조기에 넣고 동결 건조시켜 여성 호르몬 검정을 위한 시료를 조제하였다.

2. 형질전환 효모균주의 배양

ER 및 ER-lacZ 형질전환 효모균주 S.cerevisae srain BJ3505(DUKE 대학 McDonnell 박사로부터 분양받음)를 YNB 최소 배지(bacto yeast nitrogen base without amino acids 6.7g/L, Difco, USA)에 덱스트로제(dextrose) 20g/L, 리신(lysine) 50mg/L, 히스티딘(histidine) 20mg/L 를 가한 선택배지를 이용하여 30℃에서 3000rpm의 회전속도로 48시간 동안 배양하였다.

3. 배양된 형질전환 효모균주의 흡광도 측정

상기 배양된 효모균주를 β-Galactosidase assay를 이용하여 early mid-log phase (OD 600=2.3) 흡광도를 분석하였다. 그런 다음 상기 배양된 효모균주(OD 600=2.3) 20ml를 early mid-log phase (OD 600=0.3)까지 희석하여 소요량 80ml를 제조하였다.

2.3X=0.3*80ml

X= 10.43ml를 취하여 제거하고 잔여량 9.57ml에 70.03ml를 첨가하여 OD 600=0.3 에서 80ml로 조제하였다.

4. 여성호르몬 활성 검정

희석된 배양 효모균을 5ml씩 취하여 시험관에 넣어 처리별로 구분하고 실리마린, 퀘르세틴 표준용액과 토종 엉겅퀴 종자와 뿌리의 50% EtOH 추출물을 각각 5μl/ml씩 첨가하고 Z-buffer(Na2HPO4 60nM, NaH2PO4 40nM, KCl 10nM,MgSO4·7H2O 1nM, β-mecaptoethanol)를 100μl 씩 가해준 후, Lysozyme(200Unit/ml), 0.1% SDS를 가하여 free-thawing 3회로 lysis 하였다. 진탕 배양기 28℃에서 5분간 방치하여 ONPG(2-nitrophenyl-β-D-galactosidase, 2mg/ml)첨가·반응 시킨 후 충분히 발색되었을 때 stop buffer(2M Na2CO3) 50μl를 넣어 반응을 정지시켰다. 이 때 효모균주가 발현시킨 β-Galactosidase에 의해 기질로 사용한 ONPG의 분해산물인 orthonitrophenol의 정색반응을 microtiter plate reader (SPECTRAmax 340PC384, Sunnyvale, California, USA)를 이용하여 OD 420에서 측정하였다. β-Galactosidase의 활성은 음성 대조군으로 DMSO을 사용하여 Miller unit 로 나타내었다.

β-Galactosidase activity =

t: time(mim)

v: volume of culture

그 결과를 표 2를 통해 나타내었다.

[표 2: 토종 엉겅퀴의 뿔리와 종자의 여성 호르몬 수용체 활성도]

구 분	여성호르몬 수용체 활성
구 분	뿌 리 EtOAc분획	종 자 EtOAc분획	Silymarin	Quercetin
활성도(100μg/ml)	236^A	368^A	142^A	277^Q
A/Q	0.8	1.32	0.5	1

상기 표 2에서 식물성 여성 호르몬으로 일반적으로 사용되는 Quercetin의 여 성 호르몬 활성 정도를 1로 보았을 때, 순수한 Silymarin은 여성 호르몬으로서의 활성 효과가 적었으며 토종 엉겅퀴 종자는 Quercetin에 비해 1.3배, 뿌리는 0.8배의 여성 호르몬 활성 효과가 있는 것으로 확인되었다.

[실시예 3: 토종 엉겅퀴로부터 여성호르몬의 종류 검정]

토종 엉겅퀴의 뿌리 357g을 채취하여 물로 세척한 후 70℃ 건조 오븐에서 3일간 건조시킨 후 모터로 분쇄하여 80%의 메틸알콜 500ml에 넣고 60℃에서 120분간 3회에 걸쳐 환류 추출한 후 NO2 여과지로 불순물을 여과하는 과정을 거쳤다. 그런 다음 로타리 evaporation 으로 메틸알콜을 증발시키고 잔여물을 에틸아세테이트와물로 용매분획한후 녹여내어 에틸아세테이트 추출 분획을 가온 증발시킨 후 토종 엉겅퀴 추출 분획물을 모아 냉장 보관시켜 시료를 제조한다.

상기 제조된 여성 호르몬 종류 검정을 위한 시료를 5ml 씩 채취하여 대표적인 식물성 여성 호르몬이라고 알려져 있는 퀘르세틴, 다이드제닌, 제니스테인, 메테이레시놀의 4가지 성분을 분석용 표준액으로 사용하여 시료에 첨가해서 흡광도 분석을 통해(?) 성분 존재유무를 확인하였다. 그 결과를 표 3을 통해 나타내었다.

[표 3: 토종 엉겅퀴 뿌리에서 확인된 여성 호르몬 함유량 분석]

성분	면적 (mAu*S)	Height	Silymarin량 /건물중 357g	RT
Genistain	1686527	24498	0.0093M	46.101
Daidzein	623232	14937	0.0034M	35.723
Quercetin	3385517	138381	0.02M	6.251
Matairesinol	-	-	0	-

토종 엉겅퀴 뿌리 357g 에서 식물성 여성호르몬인 Genistain이 0.0093M, Daidzein은 0.0034M, Quercetin이 0.02M의 농도로 각각 검출되었음을 알 수 있다.

[실시예 4: 토종 엉겅퀴의 독성 시험]

전남 구례에 있는 섬진강 토산 어류 생태관에서 길이 3~5mm, 무게 0.30~0.50g 인 송사리를 분양받아 2L의 물이 들어 있는 수조 5곳에 10마리씩 넣었다. 기포발생기를 통해 탈염소제와 미생물 방지제를 투여하여 실제 송사리의 생육환경과 유사하게 조성하였다. 2L의 수조에 각각 0. 40, 80, 120, 160cc의 엉겅퀴 추출물(160cc의 경우 실리마린 함량 0.42mg)투여하여 시간의 경과에 따른 송사리의 활동을 관찰하였다.

8시간이 경과하자 160cc의 농도의 수조에서 수면위로 떠 오르는 송사리가 간혹 관찰되었고 14시간이 경과하자 160cc의 농도의 수조에서 2마리가 수면위로 떠 올라 배를 위로 호흡하는 현상이 관찰되었다.

22시간~24시간이 경과하자 160cc의 농도의 수조에서 송사리 6마리가 죽고 3마리가 수면위로 떠 올라 배로 호흡하는 것이 보고되었다. 이 때까지 0. 40, 80, 120cc의 농도의 수조에서는 송사리의 활동에 전혀 이상 유무가 확인되지 아니하였다.

물 2000cc를 질량으로 환산하면 2kg에 해당되므로 60kg의 체중을 가진 성인의 경우 토종 엉겅퀴 추출액 160cc*30=4800cc 이상을 섭취해야(실리마린 함량 0.42*30=12.6mg)인체에 유해한 결과를 초래함을 알 수 있었다. 엉겅퀴 추출물을 200cc 크기의 파우치로 제조할 경우 하루에 25개 이상을 섭취해야 건강에 이상이 발생된다는 의미로 해석할 수 있다. 이는 토종 엉겅퀴 추출물을 사용해서 기능성 건강식품을 조제해도 아무런 문제가 없음을 의미한다고 하겠다.

[실시예5: 토종 엉겅퀴를 이용한 식혜 제조]

토종 엉겅퀴 잎과 뿌리를 분리하고 세척한 후 1kg을 가마솥에 넣고 4.5l의 물을 부어 1시간 동안 끓였다. 그런 다음 엉겅퀴 시료를 가는 체를 이용해서 걸러주었다.

시료를 거르고 난 엉겅퀴 추출물을 밥솥에 넣고 보리가루 400g을 넣은 보자기를 넣은 후 흰쌀로 지은 흰쌀밥을 같이 넣고 10시간 동안 45℃를 유지하면서 가열하여 식혜를 제조하였다.

상기한 방법으로 제조된 식혜를 성인 남녀, 어린이 각 10명을 대상으로 관능검사를 3회 실시하여 그 결과를 표4를 통해 제시하였다.

[표 4: 엉겅퀴 뿌리를 이용해 만든 식혜를 이용한 관능검사표]

구분		엉겅퀴 뿌리와 잎을 이용해 만든 식혜
구분		맛	색깔	탁도	향	질감	안정감	소화
여성	I	7	7	5	6	7	6	7
	II	6	7	7	6	5	8	6
	III	7	6	7	8	7	6	6
	계	20	20	19	20	19	20	9
	평균	6.7	6.7	6.3	6.7	6.3	6.7	6.3
남성	I	6	6	6	8	6	7	7
	II	6	4	5	8	7	8	7
	III	7	7	5	6	5	6	7
	계	19	17	16	22	18	21	21
	평균	6.3	5.7	5.3	7.3	6.0	7.0	7.0
어린이	I	5	5	5	5	3	6	5
	II	4	4	6	6	6	4	7
	III	6	3	7	3	5	6	7
	계	15	12	18	14	14	16	19
	평균	5.0	4.0	6.0	4.7	4.7	5.3	6.3
총계		54	49	53	56	51	57	60
평균		6.0	5.4	5.9	6.2	5.7	6.3	6.7

(평가기준 0: 아주싫다, 5: 보통 10: 매우 좋다)

토종 엉겅퀴를 이요하여 제조한 식혜는 약한 쑥향에 둥글레차 향이 섞인 것과 비슷한 향을 나타내며 아주 구수했고 색깔은 다소 탁하고 맛은 씁씁할 것으로 파악되었다. 조사군별로는 어린이보다는 성인 남녀가 남성보다는 여성의 선호도가 높은 것으로 조사되었다.

[실시예6: 토종 엉겅퀴를 이용한 티백 제조]

토종 엉겅퀴의 잎, 꽃, 뿌리를 각각 분리하여 세척하여 뿌리는 2주간 그늘진 곳에서 자연 건조시키고, 꽃은 -70℃의 온도에서 동결 건조시키며, 잎은 70~80℃의 온도에서 20분 동안 볶은 후 음지에서 자연 건조시킨 후 상기 잎, 뿌리, 꽃을 혼합하여 가로 세로 2*3cm의 크기로 부직포에 1.2g 씩 넣어 티백을 완성한다.

상기 티백을 100℃로 끓인 물에 2분간 우려내어 성인 남녀 10명을 대상으로 3회에 걸쳐 관능 검사를 실시하였으며 그 결과를 표 5를 통해 나타내었다.

[표 5: 토종 엉겅퀴 추출물을 이용한 태백의 관능 검사표]

구분	I	II	III	계	평균
꽃잎차	8	7	9	24	8.0
뿌리차	4	6	5	15	5.0
잎차	6	5	6	17	5.7

(평가기준 0: 아주싫다, 5: 보통 10: 매우 좋다)

토종 엉겅퀴의 각 부위별 음용차 관능시험의 결과 꽃잎차, 잎차, 뿌리차의 순서대로 선호도가 조사되었으며 특히 꽃잎차의 경우 부드러운 향과 맛이 살아 있다는 반응이 주류를 이루었다. 잎차의 경우 볶는 과정에 미지근한 열로 인한여 적당한 수분조절과 발효가 이루어져 들풀의 향과 구수한 맛이 깃들어 있다는 평이 대부분이었다.

상기 실시예들을 종합해 보면 토종 엉겅퀴로부터 유용한 약리활성물질을 추출할 수 있고 기능성 건강식품을 제조할 수 있음을 알 수 있다.

도 1은 토종 엉겅퀴로부터 유용한 약리활성물질인 실리마린을 추출하는 단계를 나타내는 순서도이다.

도 2는 도 2는 토종 엉겅퀴 종자의 실리마린 함량을 분석한 그래프이다.

도 3은 토종 엉겅퀴 뿌리의 실리마린 함량을 분석한 그래프이다.

Claims

토종 엉겅퀴를 채취하여 세척 후 70℃의 건조 오븐에서 3일간 건조시키는 단계와;

상기 건조된 토종 엉겅퀴를 모터로 분쇄하여 건조 시료를 제조하는 단계와;

상기 제조된 토종 엉겅퀴의 건조 시료를 항온 항습기에 보관하여 온도와 습도를 일정하게 유지시키는 단계와;

상기 토종 엉겅퀴의 건조 시료를 70~90%의 메탄올을 사용하여 50~70℃의 온도에서 100분~150분 동안 2~5회 환류추출하는 단계와;

상기 환류추출된 메탄올 용액을 상온으로 냉각한 후 회전진공 농축기를 사용하여 농축하는 단계와;

상기 농축된 메탄올 용액에 에틸 아세테이트 130~200 ml를 첨가하는 단계;

로 구성되는 것을 특징으로 한 토종 엉겅퀴로부터 실리마린을 추출하는 방법
토종 엉겅퀴를 채취하여 세척 후 70℃의 건조 오븐에서 3일간 건조시키는 단계와;

상기 건조된 토종 엉겅퀴를 모터로 분쇄하여 건조 시료를 제조하는 단계와;

상기 제조된 토종 엉겅퀴의 건조 시료를 항온 항습기에 보관하여 온도와 습도를 일정하게 유지시키는 단계와;

상기 토종 엉겅퀴의 건조 시료를 70~90%의 메탄올을 사용하여 50~70℃의 온도에서 100분~150분 동안 2~5회 환류추출하는 단계와;

상기 환류추출된 메탄올 용액을 상온으로 냉각한 후 회전진공 농축기를 사용하여 농축하는 단계와;

상기 농축된 메탄올 용액에 에틸 아세테이트 130~200 ml를 첨가하는 단계;

상기 에틸 아세테이트가 첨가된 메탄올 용액을 감압 로타리 증발기를 사용하여 농축시키고 동결 건조한 후 상등액을 채취하는 단계와;

상기 채취된 상등액을 HPLC법을 사용하여 분석하는 단계;

로 구성된 것을 특징으로 한 토종 엉겅퀴로부터 실리마린 및 그 유도체를 분석하는 방법
YNB 최소 배지에 덱스트로제, 리신, 히스티딘을 가한 선택배지를 이용하여 20~35℃, 250~350rpm에서 40~50시간 동안 형질전환 효모군주를 배양하는 단계와;

상기 배양된 형질전환 효모균주를 OD=0.3 까지 희석시키는 단계와;

상기 희석된 효모균주를 토종 엉겅퀴로부터 추출된 여성호르몬 활성을 검정하기 위한 시료에 첨가하여 원심분리시키는 단계와;

상기 원심분리된 시료에 β-mecaptoethanol 를 첨가하고 lysozym을 가한 후 진탕배양기에서 25~30℃의 온도에서 3~10분간 방치시키는 단계와;

상기 방치된 시료에 2-nitrophenyl-D-galactosidase 를 2mg/ml 첨가하여 반응시키는 단계와;

상기 반응을 거친후 시료가 충분히 발색되었을 때 2M의 Na2CO3 를 넣어 반응을 정지시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 한 토종 엉겅퀴로부터 여성호르몬 활성을 검정하는 방법
제 3항에 있어서,

상기 토종 엉겅퀴로부터 추출된 여성호르몬 활성을 검정하기 위한 시료는 하기의 제조단계를 거치는 것을 특징으로 한 토종 엉겅퀴로부터 여성호르몬 활성을 검정하는 방법

(토종 엉겅퀴를 채취하여 세척 후 70℃의 건조 오븐에서 3일간 건조시키는 단계와;

상기 토종 엉겅퀴의 건조 시료를 70~90%의 메탄올을 사용하여 50~70℃의 온도에서 100분~150분 동안 2~5회 환류추출하고 회전진공 농축기를 사용하여 농축하는 단계와;

상기 농축된 메탄올 용액에 에틸 아세테이트 130~200 ml를 첨가하고 감압 로타리 증발기를 사용하여 농축 시킨후 동결 건조하는 단계)
제3항 또는 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 여성호르몬은 퀘르세틴, 다이드제닌, 제니스테인인 것을 특징으로 한 토종 엉겅퀴로부터 식물성 여성호르몬의 활성을 검정하는 방법
토종 엉겅퀴의 잎과 뿌리를 분리하여 세척하는 단계와;

상기 세척된 토종 엉겅퀴의 잎과 뿌리를 가마솥에서 1~2시간 동안 끓인 후 가는 체를 이용하여 토종 엉겅퀴 시료를 거르는 단계와;

상기 걸러진 토종 엉겅퀴 시료를 밥솥에 넣어 보리가루와 흰쌀밥을 함께 넣 고 8~12시간 동안 40~50℃에서 가열하는 단계로 구성된 것을 특징으로 한 토종 엉겅퀴를 이용한 식혜를 제조하는 방법
토종 엉겅퀴의 잎, 꽃, 뿌리를 각각 분리하여 세척하여 뿌리는 2주간 그늘진 곳에서 자연 건조시키고, 꽃은 -60 ~ -80℃의 온도에서 동결 건조시키며, 잎은 70~80℃의 온도에서 20분 동안 볶은 후 음지에서 자연 건조시킨 후 상기 잎, 뿌리, 꽃을 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 한 토종 엉겅퀴를 이용하여 차를 제조하는 방법