CN107356691B

CN107356691B - 建曲指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN107356691B
Application number: CN201710566599.9A
Authority: CN
Inventors: 郑艳萍; 蔡宝昌; 秦昆明; 金俊杰; 胡静; 杨冰; 汤剑峰
Original assignee: Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co ltd
Current assignee: Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co ltd
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN107356691A

Abstract

本发明公开了建曲指纹图谱的检测方法，建曲指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1、建曲供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的建曲指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次建曲的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成建曲的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的建曲指纹图谱，能全面，客观地表征建曲的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

建曲指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及建曲指纹图谱的检测方法。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

建曲为中药材，具有健脾益气，燥湿利水、止汗、安胎功效，用于脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安等症。目前关于建曲的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立建曲的指纹图谱检测方法，为建曲的药材鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种建曲的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价建曲的质量，对控制建曲的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种建曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、建曲供试品溶液的制备：

取不同批次的建曲，打粉，过筛，分别精密称取建曲粉末样品，置锥形瓶中，加石油醚，超声处理，过滤，取滤渣加甲醇，回流提取，过滤，浓缩滤液，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2、混合对照品溶液的制备：

精密称定没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的建曲供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次建曲的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成建曲的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的建曲指纹图谱的检测方法，步骤1建曲供试品溶液制备方法为：取12批次的建曲，打粉，过65目筛，精密称取建曲粉末样品7.5g置100mL锥形瓶中，加石油醚30mL，超声处理30min，过滤，滤渣加甲醇40mL，回流提取1h，过滤，滤液浓缩至2～3mL，加甲醇定容成5mL，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的建曲指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成0.1094mg/mL的没食子酸、0.1092mg/mL隐绿原酸、0.1072mg/mL的异绿原酸A、0.1112mg/mL的异绿原酸B和0.1120mg/mL的异绿原酸C组成的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的建曲指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，二极管阵列检测器，检测波长：300nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

作为优选方案，以上所述的建曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有峰17个。

指纹图谱检测条件的优化：

1、在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法(超声、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(甲醇、水、70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇、无水乙醇)、进行实验比较，结果发现超声提取与回流提取所得的谱图差异较小，且超声提取效率高，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用甲醇进行提取。

2、在色谱条件进行优化方面

本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取254nm、280nm、284nm、300nm处的色谱图，发现检测波长为300nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选300nm为检测波长；

对流速(1ml/min、0.8ml/min、0.7ml/min、0.6ml/min、0.5ml/min)进行筛选，因建曲中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，故高流速下无法将其分开，故在低流速下分离效果较好，最终在流速为1ml/min多次等梯度条件下将极性相似的物质分开。

本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈和0.05％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.05％磷酸水，为流动相时，建曲中各成分能达到很好的分离效果，故最终选定以乙腈和0.05％磷酸水，为流动相。

有益效果：

1、本发明根据建曲中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的建曲指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价建曲的质量，为保证临床建曲疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的建曲指纹图谱，能有效地表征建曲的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定建曲质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的建曲指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明的建曲样品的对照指纹图谱。

图2为本发明建曲样品的12批次供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1 仪器

日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。

1.2 药品与试剂

建曲样品来源见表1；没食子酸(批号130711成都瑞芬思生物科技有限公司)；隐绿原酸(批号150728)；异绿原酸A(批号151028)；异绿原酸B(批号150726)；异绿原酸C(批号150624)均购自于南京森贝伽生物科技有限公司；甲醇(分析纯)；石油醚(分析纯)；乙醚(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(色谱纯)。

表1 建曲样品信息表

实施例1 一种建曲指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、建曲供试品溶液的制备：

取以上表1的12批建曲，打粉，过65目筛，精密称取建曲粉末样品7.5g置100mL锥形瓶中，加石油醚30mL，超声处理30min，过滤，滤渣加甲醇40mL，回流1h，过滤，滤液浓缩至2～3mL，加甲醇定容成5mL，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

步骤2、混合对照品溶液的制备：

取精密称定没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成0.1094mg/mL的没食子酸、0.1092mg/mL隐绿原酸、0.1072mg/mL的异绿原酸A、0.1112mg/mL的异绿原酸B和0.1120mg/mL的异绿原酸C组成的混合对照品溶液。

步骤3、分别精密吸取12批建曲供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，二极管阵列检测器，检测波长：300nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

步骤4，将步骤3中获得的12批建曲供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择12批次建曲的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次建曲的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品建曲中有17个共有峰，对照指纹图谱见图1，12批次供试品的指纹图谱如图2所示。隐绿原酸保留时间为37.57min，没食子酸保留时间为46.72min，异绿原酸B的保留时间为60.68min，异绿原酸A的保留时间为62.55min，异绿原酸C的保留时间为64.57min。

同时本发明使用自动生成的对照HPLC指纹图谱R来生成共有色谱峰模式，分析计算获得三个不同厂家的12批建曲中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的建曲中药建立的指纹图谱能够很好的检测不同厂家及批次建曲的质量，结果如表2。

表2 各批次样品与共有模式间的相似度

指纹图谱检测方法的法学研究：

1、精密度研究

按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，平行进样6次，进样量为10μL，以没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表3，采用“中药色谱相似度评价软件2004A”进行指纹图谱比对及数据分析，结果相似度为0.96，结果表明该设备的平行进样精密性良好。

表3 精密度研究峰面积和保留时间

2、稳定性研究

按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，采用0、2、6、12、18、24小时不同时间进样分析，进样量为10μL，以没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表4，相似度为0.97，表明建曲供试品溶液在24h之内的色谱峰几乎没有变化，稳定性非常好。

表4 稳定性研究峰面积和保留时间

3、重复性研究

平行精密称取编号为S1样品六份，每份建曲中药的重量为7.5g，按照2.3项的方法制成6份同样的供试品溶液，参照实施例1的色谱条件，进样量为10μL，以没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD值，结果见表5，相似度为0.95，结果表明样品色谱峰重现性好，该方法的重复性良好。

表5 重复性研究峰面积和保留时间

以上实验结果表明，本发明提供的建曲指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价建曲的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种建曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、建曲供试品溶液的制备：

步骤2、混合对照品溶液的制备：

液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05%磷酸水，二极管阵列检测器，检测波长：300nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

2.根据权利要求1所述的建曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1建曲供试品溶液制备方法为：取12批次的建曲，打粉，过65目筛，精密称取建曲粉末样品7.5g置100mL锥形瓶中，加石油醚30mL，超声处理30min，过滤，滤渣加甲醇40mL，回流提取1h，过滤，滤液浓缩至2~3mL，加甲醇定容成5mL，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的建曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成0.1094mg/mL的没食子酸、0.1092mg/mL隐绿原酸、0.1072mg/mL的异绿原酸A、0.1112mg/mL 的异绿原酸B和0.1120mg/mL 的异绿原酸C组成的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的建曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹谱图中共有峰17个。