CN104849362A - 灯盏细辛破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及灯盏细辛破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法。该方法以灯盏乙素为对照，在柱温35℃，检测波长335nm，以甲醇为流动相A，0.3％甲酸溶液为流动相B；洗脱梯度0min-20min-50min，流动相A变化：35％-45％-75％的色谱条件下对10批以上的样品进行HPLC分析，建立共有模式标准图谱和判断指标。将同一色谱条件下的待测样品图谱与之比较，检测待测样品的质量。本发明是首次针对灯盏细辛破壁饮片建立的HPLC指纹图谱及质量检测方法。该图谱较全面涵盖了灯盏细辛破壁饮片主要活性成分的图谱信息，专属性强，检测快速准确；并能有效控制药材、破壁粉体、破壁饮片的整体质量。
Description
技术领域
本发明涉及中药饮片的质量检测方法，尤其是灯盏细辛破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法。
背景技术
本品为菊科植物短葶飞蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.的干燥全草。灯盏细辛的主要活性成分为黄酮类和咖啡酰类，主要包括野黄芩素、芹菜素、芹菜素-O-7-β-D-葡萄糖醛酸、野黄芩苷、1,5-二咖啡酰奎宁酸和3,4-二咖啡酰奎宁酸等。2010版药典以野黄芩苷为对照品，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.1％磷酸溶液(40：60)为流动相；检测波长335nm，理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于5000的色谱条件，照《高效液相色谱法检验标准操作程序》测定对其进行质量控制。
中药破壁饮片是利用现代超微粉碎技术将传统饮片进行破细胞壁粉碎成粒度分布D90小于45μm的微细颗粒，再制成30～100目的颗粒。相对于传统饮片具有色泽一致，质量均一，稳定性好的特点,为创新型中药饮片。由于中药破壁饮片不具传统中药饮片的形态特征，破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、质量检测方法不能完全适用。因此，必须针对中药破壁饮片建立专属性强，全面反映中药破壁饮片质量状况的检测方法。而建立一项新的质量检测方法并非易事，例如检测条件、对照品的选择和供试品的制备方法等均需要研究考量并进行验证。虽然现有技术中有涉及中药指纹图谱的检测方法，但并无针对形态特殊的中药破壁饮片的方法，且存在专属性、稳定性、重现性和精密度差缺陷，不能完全反应饮片的质量情况的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种灯盏细辛破壁饮片的指纹图谱共有模式构建方法及其质量检测方法。
其中，所述的指纹图谱共有模式构建方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备:取灯盏细辛破壁饮片约0.250g，加入70％甲醇50ml，浸润30min,水浴加热回流提取2h，用0.22um微孔滤膜过滤，滤液备用；
(2)对照品配制：取灯盏乙素对照品适量，加70％甲醇配制成0.1mg/ml的对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.3％甲酸溶液为流动相B；梯度洗脱：0min-20min-50min，流动相A变化：35％-45％-75％；柱温为35℃；检测波长为335nm；流速：0.6mL/min；注入量：供试品溶液10μl，对照品5ul；
(4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法及色谱条件对10批以上的灯盏细辛破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以灯盏乙素峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立灯盏细辛破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱，包括13个特征峰。
所述的质量检测方法包括以下步骤：
(1)按上述的构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品溶液10μl，对照品5ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。
(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，应呈现13个与灯盏细辛破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式标准图谱相对应的特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，以灯盏乙素峰为对照峰，其余12个共有特征峰相对保留时间分别为：0.363、0.450、0.512、0.838、0.942、1.113、1.163、1.267、1.543、1.658、1.757、1.983，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格。
本发明是首次针对灯盏细辛破壁饮片质量控制所构建的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱及质量检测方法。该方法克服了现有技术不能完全适用灯盏细辛破壁饮片质量控制的缺陷。该图谱较全面涵盖了灯盏细辛破壁饮片主要活性成分的图谱信息，专属性明显优于现有的同类指纹图谱方法。经试验验证该方法的稳定性、重现性和精密度均达到法定要求，且操作简单，检测快速准确；并能有效控制灯盏细辛药材、破壁粉体、破壁饮片整体质量及鉴别伪品。
附图说明
图1是对照品峰的指认中灯盏细辛破壁饮片与灯盏乙素对照品的比较图谱。
图2是灯盏细辛破壁饮片指纹图谱专属性考察比较图谱。
图3是灯盏细辛破壁饮片的指纹图谱共有模式建立中样品指纹图谱。
图4是灯盏细辛破壁饮片的指纹图谱共有模式图谱。
具体实施方式
一、灯盏细辛破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱的建立。
1仪器与试样
1.1仪器：安捷伦1200RRLC快速液相色谱仪(配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD蒸发光检测器、G1312B二元泵、G1329B自动进样器、G1322A脱气机、G1316B柱温箱，AgilentChemstation色谱工作站
1.2试药：试剂，甲醇(瑞典进口Oceanpak色谱溶剂)，乙腈(安徽时联特种溶剂有限公司，色谱纯)，双蒸水(实验室自制)、磷酸(天津市福晨化学试剂)、冰醋酸(天津市福晨化学试剂厂)、甲酸(天津市福晨化学试剂)、甲醇(分析纯，天津市大茂化学试剂有限公司)、乙酸乙酯、乙醇等(均为分析纯)。灯盏乙素对照品(110842-201106)购于中国食品药品检定研究院。
供试品：灯盏细辛破壁饮片、灯盏细辛破壁粉体、灯盏细辛原药材(均由中山中智药业集团提供)。
2.实验方法
2.1样品制备方法研究
2.1.1灯盏细辛破壁饮片提取溶剂的考察
根据文献资料记载，灯盏细辛药材指纹图谱研究主要是采用甲醇和乙醇作为提取溶剂，于是本研究只比较甲醇和乙醇提取效率。
样品制备：精确称取4份灯盏细辛破壁饮片(20121104)样品各约0.250g，样品1和2号加入甲醇50ml，样品3和4号加入乙醇50m，称定重量，浸润30min,超声提取60min,取出，冷却至室温，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤，备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速0.6ml/min，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液，0-60min,甲醇浓度变化为25％-65％梯度洗脱。
结果见表1及记录的图谱，由表可得知两溶剂色谱峰出峰情况相近，但是主要色谱峰甲醇提取物均高于乙醇提取物，说明甲醇对灯盏细辛破壁饮片提取效率高于乙醇提取效率。于是接下选择甲醇作为提取溶剂进行提取方式的考察。
表1 灯盏细辛破壁饮片考察提取溶剂
2.1.2灯盏细辛破壁饮片提取方式的考察
样品制备：精确称取4份灯盏细辛破壁饮片(过3号筛)各约0.250g，均加入甲醇50ml，称定重量，浸润30min,样品1和2号(80℃)加热回流提取60min,样品3和4号超声(功率320w，频率420KHz)提取60min,取出，冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤，备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速0.6ml/min，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液，0-60min,甲醇浓度变化为25％-65％梯度洗脱。
结果见记录图谱及表2，由表2得水浴加热回流提取和超声提取两者色谱图出峰个数几近相等，但是主要色谱峰峰面积回流提取明显大于超声提取，于是选择水浴加热回流作为提取方式。
表2 灯盏细辛破壁饮片甲醇提取方式的考察
2.1.3考察提取溶剂浓度的影响
样品制备：精确称取8份灯盏细辛药材粉末(过3号筛)各约0.5000g，样品1和2号加入50％甲醇50ml，样品3和4号加入70％甲醇50ml，样品5和6号加入80％甲醇50ml，样品7和8号加入100％甲醇50ml，称定重量，浸润30min,超声(功率320w，频率4200Hz)提取2h,取出，冷却至室温，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤，备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速0.6ml/min，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液，0-60min,甲醇浓度变化为25％-65％梯度洗脱，以谱图中主要色谱峰的个数及峰面积大小来判断不同浓度甲醇的提取效率，结果如表3所示：通过对比表中数据，以峰面积大于5％的主要色谱峰为评价指标，提取效率为70％甲醇>50％甲醇>80％甲醇>100％甲醇，于是选择70％甲醇为最佳提取溶剂。
表3 灯盏细辛破壁饮片考察甲醇提取浓度
2.1.4灯盏细辛破壁饮片提取时间考察
样品制备：精确称取8份灯盏细辛破壁饮片(过3号筛)各约0.250g，加入70％甲醇50ml，称定重量，浸润30min,样品1和2号水浴加热回流提取1h,样品3和4号水浴加热回流提取2h,取出，样品5和6号水浴加热回流提取3h，样品7和8号水浴加热回流提取4h，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤，备用。结果见下表4：
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速0.6ml/min，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液，0-60min,甲醇浓度变化为25％-65％梯度洗脱。
表4 灯盏细辛破壁饮片考察提取时间
由图谱分析得表4，得出峰面积大于10％的峰RSD均小于5％，差异性较大的是38.901min分钟出的色谱峰，其中效果明显较高的是回流提取2h，于是综合考察，提取时间确定为2h。
2.1.5灯盏细辛破壁饮片去脂纯化的考察
本试验分别考察低毒性的石油醚和大毒的氯仿去脂纯化及不去脂纯化对结果的影响。样品制备：精确称取灯盏细辛破壁饮片6份，各约0.250g，样品1和2号加入约80ml三氯甲烷，索氏提取至提取液无色，取出样品挥干三氯甲烷，残渣加入70％的甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流提取2h；样品3和4号加约80ml的石油醚(沸程60～90℃)索氏提取至提取液无色，取出，挥干石油醚液，残渣加入50ml70％的甲醇，称定重量，水浴加热回流提取2h；样品5和6号直接加入50ml70％的甲醇，称定重量，水浴加热回流提取2h，做为对照组；取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速0.6ml/min，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.4％磷酸溶液，梯度洗脱：0-60min,甲醇浓度变化为25％-65％。
通过结果记录图谱分析得表5，可以得出氯仿去杂后，23和25号色谱峰明显比石油醚组和对照组低，而石油醚和对照组没有明显的区别，于是确定去脂能力氯仿>石油醚，但从指纹图谱的模糊性、整体性，实验费用及污染角度考虑，，最终确定不需要对样品进行去脂化处理。
表5 灯盏细辛破壁饮片考察纯化的影响
2.1.6灯盏细辛破壁饮片提取料液比的考察
样品制备：精确称取灯盏细辛破壁饮片样品四份，样品1号0.2510g，样品2号0.2509g，样品3号0.5003g，样品4号0.5008g，于具塞锥形瓶中，加入50ml70％的甲醇，浸润30min,称定重量，水浴(80摄氏度)回流提取2h，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，流速0.6ml/min，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液，0-55min,甲醇浓度变化为45％-75％梯度洗脱。
结果经记录图谱分析见表6，由结果得出两个谱图相似度0.99以上，且谱图分离度相似，说明两料液比出峰情况相近，而两谱图主要色谱峰峰面积成倍数关系，于是从原料节约及预防提取不充分角度考虑，选择0.25g：50ml作为提取料液比。
表6 灯盏细辛破壁饮片考察料液比的影响
2.1.7灯盏细辛破壁饮片提取条件的确定
精确称取灯盏细辛破壁饮片样品约0.250g于具塞锥形瓶中，加入70％的甲醇50ml，浸润30min,称定重量，水浴(80摄氏度)加热回流提取2h，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。
2.2灯盏细辛破壁饮片色谱条件的考察
2.2.1灯盏细辛破壁饮片波长的选择
参考灯盏细辛指纹图谱研究相关文献，均采用335nm作为检测波长，本实验小组对灯盏细辛破壁饮片样品进行3D全波长的扫描，同时在315-345nm处每隔5nm储存共8处波长谱图。经3D光谱图，结合记录的8张谱图分析得出灯盏细辛破壁饮片在325-345nm处有最大的吸收，和文献相吻合，而且325-345nm之间没有明显的区别，于是检测波长定为335nm。
2.2.2灯盏细辛破壁饮片洗脱梯度优化
在基础梯度0-60min，甲醇变化为5％-100％的基础上，通过调整起始浓度和终点浓度，以及调整分析时间改变峰保留值，以达到分离效果，对记录的系列图谱分析，结果确定灯盏细辛破壁饮片最终洗脱梯度为0min-20min-50min,甲醇变化为35％-45％-75％组的效果明显优于其他组别。
灯盏细辛破壁饮片洗脱梯度
2.2.3灯盏细辛破壁饮片特征图谱流速考察
样品制备：精确称灯盏细辛破壁饮片约0.250g，加入70％甲醇50ml，称定重量，浸润30min,水浴加热回流提取2h，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤，备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，柱温30℃，，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液，0min-20min-50min,甲醇变化为35％-45％-75％梯度洗脱，进样量10ul，流速分别考察0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min。
将上述实验得的色谱图导入中智指纹图谱分析软件，经记录的图谱分析，0.6-0.7ml/min分离度比较理想但在设定的洗脱时间未能将样品完全洗脱，0.8-1.2ml/min能将样品洗脱完全，但是分离度不好，综合考虑，流速选择0.6ml/min，但是甲醇浓度需提高。
2.2.4灯盏细辛破壁饮片特征图谱柱温度的考察
样品制备：精确称取灯盏细辛破壁饮片约0.250g，加入70％甲醇50ml，称定重量，浸润30min,水浴加热回流提取2h，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤，备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液，0min-20min-50min,甲醇变化为35％-45％-75％。梯度洗脱，进样量10ul，柱温分别考察柱温25℃，30℃，35℃、40℃。
将测得的谱图导入中智指纹图谱分析软件进行分析，通过图谱比较，结果35℃的柱温明显优于其他组别。
2.2.5灯盏细辛破壁饮片对照品峰的指认
采用最终确定的色谱条件对灯盏乙素(野黄芩苷)对照品进行色谱峰指认，灯盏乙素峰和灯盏细辛破壁饮片相对应色谱峰具有相同的紫外吸收。
3灯盏细辛破壁饮片指纹图谱方法学考察
3.1专属性
考察此方法建立的灯盏细辛破壁饮片指纹图谱是否能够表达该品种的特征，不受其他的影响，即唯一性。考察空白溶剂图谱(阴性样品图谱)在相应保留时间处有无色谱峰，有无干扰，是否符合要求。结果：通过谱图我们得出在相应保留时间无色谱峰，无干扰，符合指纹图谱质量控制技术的要求。
3.2精密度考察
精密称取灯盏细辛破壁饮片(20121104)样品，按供试品制备方法进行制备，连续进样6次，记录指纹图谱，计算6次进样所得指纹图谱的各主要色谱峰的峰面积RSD及所得指纹图谱的相似度。结果经记录图谱分析见表7系列：6谱图的相似度0.999以上，主要色谱峰含量RSD均小于3％，符合指纹图谱技术要求。
表7-1 灯盏细辛破壁饮片精密度考察相似度
表7-2 灯盏细辛破壁饮片精密度考察主要色谱峰积分表
3.3稳定性实验
取灯盏细辛破壁饮片(20121104)样品按供试品制备方法制备样品溶液，分别于0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h内测定，所得指纹图谱分析，其相似度见表8，稳定性测得的8张谱图的相似度0.999以上，计算24h内各主要色谱峰的峰面积RSD小于5％，相对峰面积RSD也基本符合要求，说明该样品在14小时候内是稳定的。
表8-1 灯盏细辛破壁饮片稳定性考察相似度
表8-2 灯盏细辛破壁饮片稳定性考察主要色谱峰积分表
3.4重复性实验
取同一批次灯盏细辛破壁饮片(20121104)样品，按供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品，记录指纹图谱，计算6次样品各主要色谱峰的峰面积和含量及所得指纹图谱的相似度，结果见表9。
表9-1 灯盏细辛破壁饮片重复性谱图相似度表
表9-2 灯盏细辛破壁饮重复性考察主要色谱峰积分表
由上两表得灯盏细辛破壁饮片主要色谱峰峰面积及含量RSD均小于3.1％，且6谱图的相似度高达0.9998以上，由此可以判断该方法重复性符合中国药典中药注射剂指纹图谱控制技术的要求。4灯盏细辛破壁饮片适用性考察
4.1灯盏细辛破壁饮片指纹图谱柱子适用性考察
根据指纹图谱稳定性要求，需要选择稳定性好的色谱柱，灯盏细辛药材相关文献中大多数学者均使用迪马柱分析灯盏细辛指纹图谱，本实验室开始采用迪马Diamonsil C-18(250mm×4.6mm，5um)进行分析，分离效果比较乐观，但是柱子的稳定性不好，方法学考察出现仪器精密度不符合要求，于是考察了资生堂C-18(250mm×4.6mm，5um)、Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5um)。结果经记录谱图结合数据分析，得出资生堂c18柱分析效果最理想，安捷伦zorbaxsb c18基本符合要求，两者均可用于灯盏细辛特征指纹图谱分析。
5.1灯盏细辛破壁饮片指纹图谱的共有模式的建立
按照上述确定的样品制备方法及色谱条件对已经收集到的10批以上具有代表性灯盏细辛破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱。以图谱中峰面积较大，峰形较好，其保留时间适中的灯盏乙素峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。利用中智药业集团中药指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较(以平均谱图为共有模式)，计算相似度，并建立灯盏细辛破壁饮片指纹图谱共有模式，6号峰为灯盏乙素。
样品制备：精确称取10批次灯盏细辛破壁饮片各约0.250g，加入70％甲醇50ml，称定重量，浸润30min,水浴加热回流提取2h，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤，备用。
色谱条件：资生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm,5um)色谱柱，检测波长335nm,流动相为甲醇-0.3％甲酸溶液，0min-20min-50min,甲醇变化为35％-45％-75％梯度洗脱，进样量10ul，柱温35℃。
表10-1 灯盏细辛破壁饮片指纹图谱相似度
表10-2 灯盏细辛破壁饮片共有指纹峰相对峰面积
表10-3 灯盏细辛破壁饮片相对保留时间
由上述实验结果得知灯盏细辛破壁饮片由于产地、药用部位、采收季节不同其化学组成差异小，但是含量差异性大，本次灯盏细辛破壁饮片均为中试样品，大生产质量稳定均一的灯盏细辛破壁饮片需要采用指纹图谱技术，从原料药材开始进行整体控制。
5.2灯盏细辛破壁饮片原料药材-中间成品-成品相关性分析
收集灯盏细辛原料药材20121104、20130901、20130902、201230903、20130904、20130905、20131001、20131002、20131003、20140424共十批次的灯盏细辛原料药材，分别制备成相对应的中试样品破壁粉体、破壁饮片，使用上述最终提取条件和色谱条件对20130901、20130902、20130905三批次药材粗粉、破壁粉体、破壁饮片9个样品进行分析测定，结果显示：灯盏细辛破壁饮片在制备过程中只是性状发生了改变，化学成分组成基本不变，破壁后各主要化学成分含量略有提高，但是不明显(见表10)。
表11-1 灯盏细辛破壁饮片原-中-成相关性分析
表11-2 灯盏细辛破壁饮片20140901原-中-成相关性分析共有峰面积
表11-3 灯盏细辛破壁饮片20140902原-中-成相关性分析共有峰面积
表11-4 灯盏细辛破壁饮片20140905原-中-成相关性分析共有峰面积
二、质量检测方法应用。
供试品：抽取中智药业淫羊藿破壁粉体和破壁饮片共10批次进行质量检测。市场外购5批次其他厂家灯盏细辛破壁饮片进行质量检测。检测方法如下：
供试品溶液的制备：精确称取灯盏细辛破壁饮片约0.250g，加入70％甲醇50ml，称定重量，浸润30min,水浴加热回流提取2h，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤，备用。
对照品配制：精确称量灯盏乙素对照品适量，加70％甲醇配制成0.1mg/ml的对照品溶液。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以甲醇-0.3％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为335nm；流速：0.6mL/min。
测定法:精密吸取供试品溶液10μl，对照品5ul注入液相色谱仪，测定，即得。
合格指标的建立及指定图谱、判断方法:供试品色谱中，应呈现13个与图4-灯盏细辛破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。以灯盏乙素峰为对照峰，其余12个共有特征峰相对保留时间分别为：0.363、0.450、0.512、0.838、0.942、1.113、1.163、1.267、1.543、1.658、1.757、1.983，各峰相对保留时间RSD≤±5％,为合格。
结果：中智药业10批次样品均符合质量要求，外购样品其中4批次符合质量要求，1批次为不合格品。
Claims (2)
1.灯盏细辛破壁饮片的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备:取灯盏细辛破壁饮片约0.250g，加入70％甲醇50ml，浸润30min,水浴加热回流提取2h，用0.22um微孔滤膜过滤，滤液备用；
(2)对照品配制：取灯盏乙素对照品适量，加70％甲醇配制成0.1mg/ml的对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.3％甲酸溶液为流动相B；梯度洗脱：0min-20min-50min，流动相A变化：35％-45％-75％；柱温为35℃；检测波长为335nm；流速：0.6mL/min；注入量：供试品溶液10μl，对照品5ul；
(4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法及色谱条件对10批以上的灯盏细辛破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以灯盏乙素峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立灯盏细辛破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱，包括13个特征峰。
2.一种菊花破壁饮片的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按权利要求1所述的构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品溶液10μl，对照品5ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。
(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，应呈现13个与灯盏细辛破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式标准图谱相对应的特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，以灯盏乙素峰为对照峰，其余12个共有特征峰相对保留时间分别为：0.363、0.450、0.512、0.838、0.942、1.113、1.163、1.267、1.543、1.658、1.757、1.983，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150819 |