CN101904903A - 一种莲子心提取物及其质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲子心提取物，并提供了一种用于鉴别和控制莲子心提取物质量的毛细管电泳指纹图谱方法，参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，运用高效毛细管电泳法进行测定，最后运用中药指纹图谱相似度计算软件分析相似度。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握莲子心提取物的真伪和质量情况，可将其用于莲子心提取物质量控制及其真伪鉴别的指标之一。

Description

一种莲子心提取物及其质量控制方法

技术领域

本发明涉及中药提取物技术领域，具体地，涉及莲子心提取物及其质量控制方法。

背景技术

中药标准提取物，指采用现代技术手段，对传统中药材进行提取加工而得到的一种具有相对明确药效物质基础及严格质量标准的一种中药产品，可作为中药制剂的原料药。

中药及其复方是一个复杂体系，起疗效作用的物质基础为多种化学成分，包括无机物、小分子有机化合物(如生物碱、皂苷等)及生物大分子(如蛋白、多糖等)等。中药标准提取物的化学成分是多种药理活性物质按特定比例组成的集合，继承了中药多成分的特点，体现着原中药材特定的中医功效，且有效活性物质富集程度高(如银杏标准提取物中有效成分含量是原药材原料中的50倍)，因此无论作为单味药还是组成复方，均可替代原生药作为中药制剂的科学化原料药。

中药标准提取物在质量控制方面也有着无可比拟的优越性。目前中药制剂的原料药主要为中药材及饮片。但现阶段由于中药材品种繁多，基原相近，以及地域、生态环境、栽培、饮片加工炮制及储备养护等因素的影响，导致其品种混乱，质量难以有效控制，差异很大，影响了原料药内在质量的稳定，从而导致中药制剂产品的质量不稳定。因此要建立稳定的、真正反映中药制剂产品内在质量的质量标准，原料药质量的稳定和可控是关键所在，而标准可控、质量稳定、物质基础相对明确的中药标准提取物正是解决此类问题的一种重要途径。

莲子心系睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)成熟种子中的绿色干燥幼叶及胚根，其具有消心安神通交心肾、涩精止血之功效，历版《中国药典》均有收载，2005版药典采用莲子心HPLC含量测定法作为其质量检测标准方法。莲子心中主要有效成分为莲心碱，甲基莲心碱、异莲心碱和莲心季铵碱等生物碱，据文献报道甲基莲心碱具有扩血管、降压，抗心律失常，抗血小板聚集，抗血栓形成，抗氧化，抗有机磷农药中毒，抗瘢痕形成以及化疗增敏等药理作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合工业化制备的莲子心提取物，并提供了一种用于鉴别和评价莲子心提取物质量的毛细管电泳指纹图谱方法，可将其用于莲子心提取物质量控制及其真伪鉴别的指标之一。为实现上述发明，本发明提供如下技术方案：

一种莲子心提取物，是以中药莲子心为原料按如下方法制备：用10倍量的浓度为75％的乙醇回流3次，每次提取1h为最佳提取工艺。

一种用于鉴别和评价莲子心提取物质量的毛细管电泳指纹图谱方法，按如下方法制备：

第一步，先建立莲子心提取物的标准指纹图谱，主要步骤包括：

(a)收集10批次以上具代表性的莲子心提取物。

(b)莲子心提取物标准品溶液的制备：取莲子心提取物粉末，干燥至恒重。精密称取莲子心提取物粉末适量，用醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)超声提取2～3次，合并提取液。滤过，滤液浓缩后，加醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)或者缓冲液稀释至一定浓度，摇匀，即得。进样前用微孔滤膜滤过。

采用高效毛细管电泳色谱法测定的指纹图谱，其莲子心提取物标准品溶液的具体制备优选的步骤为：取莲子心提取物粉末约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用10ml甲醇超声30min溶解后，定容至刻度，摇匀，进样前用0.45μm微孔滤膜滤过，取中段滤液。

(c)参照物溶液的制备：参照物为莲子心提取物中的有效成分，优选为莲心碱。其供试液具体制备方法为：精密称取莲心碱对照品10mg置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得。

(d)测定方法的选择：测定方法为色谱法，优选为高效毛细管电泳法(HPCE)。

(f)测定：精密吸取莲子心提取物标准品溶液及参照物溶液，分别注入检测仪器，测定莲子心提取物标准指纹图谱。

采用毛细管区带电泳(CZE)电泳模式，压力进样：0.5psi*10sec，分离电压30kV，柱温25℃，DAD检测波长为282nm。运行缓冲液由0.1mol/L硼酸∶0.1mol/LNaOH(4∶2)构成，pH无需再调。每次进样前依次用水及缓冲液冲洗2min，分析时间7min。

第二步，以上述相同的方法测定待测莲子心提取物样品指纹图谱；

第三步，将待测莲子心提取物样品指纹图谱与莲子心提取物标准指纹图谱对比，筛选符合莲子心提取物标准指纹图谱的莲子心提取物。

莲子心提取物HPCE指纹图谱可分为4个区：保留时间2.00～3.80min(I区)，1号和2号两个特征峰，最强峰为2号，其单峰面积占总峰面积7.36％(RSD＝7.57％)，其中的负峰为溶剂峰；保留时间3.80～4.30min(II区)，出现3～6号四个特征峰，最强峰为5号，其单峰面积占总峰面积8.95％(RSD＝6.09％)，保留时间4.30～4.80min(III区)，出现7～11号五个特征峰，最强峰位7号峰，其次为8号峰，单峰面积占总峰面积分别为30.23％(RSD＝5.96％)和22.66％(RSD＝2.10％)；保留时间4.80～6.00min(IV区)，出现12～15号四个特征峰，最强峰为12号，单峰面积占总峰面积6.80％(RSD＝6.92％)。指纹图谱中2、5、7、8、12五个强峰的峰面积约占总峰面积的76.00％(RSD＝1.22％)，总体看来，四个区段中表观丰度最强的是第III区，莲心碱峰就出现在该区，其次是第II区、第I区、第IV区。

本发明的优点如下：

(1)所建立的莲子心提取物指纹图谱，能有效地表征莲子心提取物的质量，对莲子心提取物中的全部化学成分进行检测，既不现实也没必要。大量的药理和临床研究结果表明莲子心提取物中的生物碱类成分为其重要的有效成分之一，故选用其中的莲心碱作为参考品就很有代表性。

(2)以莲子心提取物整个指纹图谱作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一两个化学成分而判定莲子心提取物整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，本发明为完整、准确评价莲子心提取物的质量提供了新的对照标准，将为提高莲子心提取物及其中成药制剂的质量及疗效做出贡献。

(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。本发明采用超声法提取制备供试液，样品处理大为简便、节约了检验的成本和时间。同时本发明提出同时采用毛细管电泳指纹图谱方法对同一批次药材综合评价莲子心提取物的质量。

附图说明

图1莲子心提取物毛细管电泳色谱图共有峰；

图2莲子心提取物高效毛细管电泳色谱叠加图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1正交实验法优选莲子心提取物制备工艺

1仪器、试剂与试药

1.1仪器：安捷伦HP1100高效液相色谱仪(美国AgiLent公司，DAD检测器)，AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，数显恒温水浴锅(上海申滕生物技术有限公司)，艾科浦超纯水系统(颐洋企业发展有限公司)，HX-100型高速中药粉碎机(浙江永康市溪岸五金药具厂)，DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)。

1.2试剂：莲心碱、甲基莲心碱对照品(购自DELTA天然有机化合物信息中心，纯度≥98％，乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3药材：莲子心2008年2月购于福州回春堂药店(产地：福建)，经药物室林文津药师鉴定为正品莲子心。

2高效液相色谱法检测甲基莲心碱含量方法的建立

2.1色谱条件  色谱柱：Lanbo，kromasiL-C₁₈柱；填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶键合相；流动相：乙腈-0.015mol/L十二烷基磺酸钠溶液(取十二烷基磺酸钠0.4g加三蒸水100mL使溶解)-冰醋酸(68∶31∶1)；检测波长：282nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：25℃；检测器：DAD(二极管阵列检测器)。

2.2对照品溶液的制备  精密称取甲基莲心碱对照品2.5mg，至10mL量瓶中，甲醇溶解定容。精密移取1mL至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得25μg/mL的溶液。

2.3供试品溶液的制备  取莲子心药材粗粉约0.5g，精密称定，精密加入2％盐酸甲醇溶液25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4标准曲线的绘制  精密称取甲基莲心碱对照品4mg，置10mL容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得400μg/mL对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液5.0mL置10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，得到200μg/mL对照品溶液，再分别稀释得到100、50、25、12.5、6.25μg/mL浓度的对照品溶液。精密移取各浓度的对照品液20μL，分别进样，测定，以甲基莲心碱的峰面积(A)为纵坐标，溶液浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程：A＝17.25C+4.0746，R＝0.9999。表明甲基莲心碱在6.25μg/mL～400μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.5精密度考察  精密吸取精密吸取浓度为100μg/mL对照品溶液20μL，重复进样6次，测定供试品中甲基莲心碱峰面积值。结果平均峰面积为1736.04，RSD＝0.79％。结果表明，该方法精密度良好。

2.6稳定性考察  精密移取同一供试品液20μL，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，测定供试品中甲基莲心碱峰面积值，平均峰面积1760.47，RSD＝2.15％，结果表明，样品溶液在24h内稳定性良好。

2.7加样回收率考察  准确称取已知含量的莲子心粗粉0.25g，共6份，精密加入对照品溶液适量，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为99.27％，RSD＝2.12％，表明本法具有良好的加样回收率。

2.8莲子心药材测定  取莲子心药材粗粉约0.5g，精密称定，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，在上述色谱条件下依法测定，结果显示，药材中甲基莲心碱的含量为0.301％。

3莲子心标准提取物提取工艺研究

3.1正交实验设计  根据生物碱类化合物的理化性质，采用正交设计法，设定乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取时间(C)与提取次数(D)4个实验因素，每个因素设计3个水平，实验因素水平设计见表1，选用L₉(3¹)止交试验表进行实验。

表1正交实验因素水平表

3.2样品测定  准确称取10g干燥至恒重的莲子心药材9份，粉碎成粗粉，按表2设计的方案进行回流提取，所得提取液合并，过滤，定容至250mL。精密移取1mL至10mL容量瓶中，挥干溶剂，流动相定容，45μm微孔滤膜滤过，精密移取各供试样品液20μL进样，测定滤液中甲基莲心碱峰面积并计算其含量。

3.3止交实验结果及方差分析结果见表2、表3。

表2  L₉(3⁴)止交实验方案及结果

表3方差分析表

综合直观分析和方差分析结果，所考察的4个因素中，A、D对甲基莲心碱提取工艺的影响有显著性，四个因素对提取含量影响顺序为A＞D＞B＞C，即乙醇浓度＞回流次数＞乙醇用量＞回流时间。从节约成本和时间考虑，最佳工艺为A₂B₂C₁D₁，即用10倍量的浓度为75％的乙醇回流3次，每次提取1h为最佳提取工艺。

3.4验证试验：称取药材按A₂B₂C₁D₁进行验证试验，结果与正交试验结果吻合，说明工艺可行。

实施例2莲子心毛细管电泳指纹图谱研究

1.1仪器

P/ACE MDQ高效毛细管电泳仪(美国贝克曼库尔特有限公司)、未涂层熔融石英毛细管57cm×50μm，有效长度为47.5cm(河北省永年锐沣色谱器件有限公司)，AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，SK3310HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，艾科浦超纯水系统(重庆颐洋企业发展有限公司)。

1.2材料

10批莲子心提取物由本实验室提供，批号为：20080414(S1)，20080415(S2)，20080416(S3)，20080417(S4)，20080418(S5)，20080421(S6)，20080422(S7)，20080423(S8)，20080424(S9)，20080425(S10)，莲心碱对照品购于DELTA天然有机化合物信息中心，色谱纯甲醇(上海星可生化有限公司)、硼酸、NaOH(上海联试化工试剂有限公司)。

2方法

2.1对照品溶液的制备

精密称取莲心碱对照品5.0mg，至5ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得1.0mg/mL莲心碱对照品液。

2.2供试品溶液的制备

取莲子心提取物粉末约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用10ml甲醇超声30min溶解后，定容至刻度，摇匀，进样前用0.45μm微孔滤膜滤过，取中段滤液。

2.3毛细管电泳色谱条件

采用毛细管区带电泳(CZE)电泳模式，压力进样：0.5psi*10sec，分离电压30kV，柱温25℃，DAD检测波长为282nm。运行缓冲液由0.1mol/L硼酸∶0.1mol/LNaOH(4∶2)构成，pH无需再调。每次进样前依次用水及缓冲液冲洗2min，分析时间7min。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验

取S1号样品连续进样5次，计算莲心碱对照品的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.25％和2.1％，结果表明，精密度良好。

2.4.2稳定性试验

取S1号样品分别在0，2，4，8，12h时进样测定，莲心碱对照品色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.65％和2.4％，说明供试品溶液在12小时内稳定。

2.4.3重现性试验

取S1号样品5份，依法测定，计算莲心碱对照品色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.36％和2.8％，表明该方法重现性良好。

3结果

3.1样品分离效果

采用优化后的HPCE工作条件，测定对照品溶液和供试品溶液，比较莲心碱及供试品溶液色谱图，确定了莲子心对照品峰，结果可以看出色谱峰峰形较好，可准确测定其保留时间、峰面积及峰高并能进行指纹图谱分析。

3.2指纹图谱的建立

按“供试品溶液的制备”项下的方法制备10批莲子心提取物供试品溶液，依法进样，测得10批莲子心提取物的HPCE色谱图。经比较分析10批样品所有的峰数、峰值和峰位等参数和色谱图后，从中选定15个共有峰作为构成莲子心提取物指纹图谱稳定的特征峰，见图1，其中8号峰为莲心碱，15个共有峰的峰面积总和占总峰面积的99％以上。10批莲子心提取物指纹图谱的叠加图见图2。

3.3指纹图谱分析与评价

将各指纹图谱保留时间与莲心碱对照品(8号峰)的保留时间比较，其比值为各指纹图谱的相对保留时间，10批莲子心提取物指纹图谱中各共有指纹峰的相对保留时间见表4；以莲心碱峰(8号峰)的峰面积作为1，其它各共有指纹峰的相对峰面积见表5。

表4  10批莲子心提取物HPCE指纹图谱共有峰的相对保留时间

表5  10批莲子心提取物HPCE指纹图谱共有峰的相对峰面积

将测试数据导入中国药典委员会推荐的“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件，经校正，将谱图自动匹配，然后生成对照图谱，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出莲子心提取物HPCE指纹谱共有图谱，与共有图谱比较，10批莲子心提取物的相似度分析结果见表6。

表6  10批莲子心提取物HPCE指纹图谱相似性分析结果

结果表明，10批莲子心提取物相似度均在0.9～1.0之间，说明本次试验莲子心提取物品质基本一致。

为易于辨认和分析，莲子心提取物HPCE指纹图谱可分为4个区：保留时间2.00～3.80min(I区)，1号和2号两个特征峰，最强峰为2号，其单峰面积占总峰面积7.36％(RSD＝7.57％)，其中的负峰为溶剂峰；保留时间3.80～4.30min(II区)，出现3～6号四个特征峰，最强峰为5号，其单峰面积占总峰面积8.95％(RSD＝6.09％)，保留时间4.30～4.80min(III区)，出现7～11号五个特征峰，最强峰位7号峰，其次为8号峰，单峰面积占总峰面积分别为30.23％(RSD＝5.96％)和22.66％(RSD＝2.10％)；保留时间4.80～6.00min(IV区)，出现12～15号四个特征峰，最强峰为12号，单峰面积占总峰面积6.80％(RSD＝6.92％)。指纹图谱中2、5、7、8、12五个强峰的峰面积约占总峰面积的76.00％(RSD＝1.22％)，总体看来，四个区段中表观丰度最强的是第III区，莲心碱峰就出现在该区，其次是第II区、第I区、第IV区。

Claims (8)

1.一种莲子心提取物，其特征是以中药莲子心为原料按如下方法制备：用6～16倍量的浓度为60％～90％的乙醇回流1～3次，每次提取1～2h。

2.根据权利要求1所述的莲子心提取物，其特征在于：所用的制备方法为用10倍量的浓度为75％的乙醇回流3次，每次提取1h。

3.一种如权利要求1所述的莲子心提取物的质量控制方法，包括如下步骤：

第一步，先建立莲子心提取物的标准指纹图谱，主要步骤包括：

(a)收集10批次以上的莲子心提取物，并鉴定质量；

(b)莲子心提取物标准品溶液的制备；

(c)参照物溶液的制备；

(d)测定方法的选择；

(f)测定：精密吸取莲子心提取物标准品溶液及参照物溶液，分别注入检测仪器，测定莲子心提取物标准指纹图谱。

第二步，以上述相同的方法测定待测莲子心提取物样品指纹图谱；

第三步，将待测莲子心提取物样品指纹图谱与莲子心提取物标准指纹图谱对比，筛选符合莲子心提取物标准指纹图谱的莲子心提取物。

4.根据权利要求3所述的莲子心提取物质量控制方法，其特征在于，所述莲子心提取物标准品溶液的制备过程为：将莲子心提取物干燥至恒重，精密称取莲子心提取物粉末适量，用醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)超声提取2～3次，合并提取液。滤过，滤液浓缩后，加醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)或者缓冲液稀释至一定浓度，摇匀，即得。进样前用微孔滤膜滤过。

5.根据权利要求4所述的莲子心提取物质量控制方法，其特征在于，莲子心提取物标准品溶液的具体制备方法为：取莲子心提取物粉末约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用10ml甲醇超声30min溶解后，定容至刻度，摇匀，进样前用0.45μm微孔滤膜滤过，取中段滤液。

6.根据权利要求3所述的莲子心提取物质量控制方法，其特征在于所述莲子心提取物的指纹图谱为福建省地道药材莲子心的提取物指纹图谱。

7.根据权利要求3所述的莲子心提取物质量控制方法，其特征在于：莲子心提取物HPCE指纹图谱可分为4个区：保留时间2.00～3.80min(I区)，1号和2号两个特征峰，最强峰为2号，其单峰面积占总峰面积7.36％(RSD＝7.57％)，其中的负峰为溶剂峰；保留时间3.80～4.30min(II区)，出现3～6号四个特征峰，最强峰为5号，其单峰面积占总峰面积8.95％(RSD＝6.09％)，保留时间4.30～4.80min(III区)，出现7～11号五个特征峰，最强峰位7号峰，其次为8号峰，单峰面积占总峰面积分别为30.23％(RSD＝5.96％)和22.66％(RSD＝2.10％)；保留时间4.80～6.00min(IV区)，出现12～15号四个特征峰，最强峰为12号，单峰面积占总峰面积6.80％(RSD＝6.92％)。指纹图谱中2、5、7、8、12五个强峰的峰面积约占总峰面积的76.00％(RSD＝1.22％)，总体看来，四个区段中表观丰度最强的是第III区，莲心碱峰(8号峰)就出现在该区，其次是第II区、第I区、第IV区。

8.根据权利要求3所述的莲子心提取物质量控制方法，其特征在于，采用毛细管区带电泳电泳模式，压力进样：0.5psi*10sec，分离电压30kV，柱温25℃，DAD检测波长为282nm。运行缓冲液由0.1mol/L硼酸∶0.1mol/LNaOH(4∶2)构成，pH无需再调。每次进样前依次用水及缓冲液冲洗2min，分析时间7min。

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