CN103245739A - 一种银翘解毒软胶囊指纹图谱的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，本发明公开了一种银翘解毒软胶囊的指纹图谱测定方法。该方法包括：(a)供试品溶液的制备，(b)对照品溶液的制备，(c)色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，流动相：A为乙腈，B为磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长：327nm，(d)测定，得到银翘解毒软胶囊的指纹图谱。该方法专属性强、操作简便，可以有效地控制银翘解毒软胶囊的质量。

Description

一种银翘解毒软胶囊指纹图谱的测定方法

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种银翘解毒软胶囊指纹图谱的测定方法。

背景技术

银翘解毒软胶囊原方来源于清代吴鞠通《温病条辨》中的银翘散。该方具有辛凉解表、清热解毒的功效，现代用于治疗流行性感冒、急性扁桃体炎、咽喉炎、肺炎、疱疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性疾病。

《中国药典》2010年版一部第1089-1090页收录了银翘解毒软胶囊，其配方为金银花400g，连翘400g，薄荷240g，荆芥160g，淡豆豉200g，牛蒡子(炒)240g，桔梗240g，淡竹叶160g，甘草200g。然而药典收载的银翘解毒软胶囊【鉴别】项下采用薄层色谱法对处方中的荆芥、连翘、牛蒡子、甘草、薄荷5味药材进行鉴别，【含量测定】项下采用高效液相色谱法以绿原酸为指标进行含量测定。

CN101991785A(中国专利申请号：200910168454.9，公告日：2012.07.18，发明名称：一种银翘解毒软胶囊药物及其制备方法与质量检测方法)公开了银翘解毒软胶囊的制备方法与质量检测方法，其质量检测方法包括薄层鉴别及含量测定方法，其含量测定方法为(1)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.1％磷酸溶液比例为9∶91为流动相，检测波长为327nm，理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000；(2)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，置棕色瓶中，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液；(3)供试品溶液的制备：取本品内容物，混匀，精密称取1g，置圆底烧瓶中，加入二氯甲烷40ml，水浴回流1小时，滤过，弃去二氯甲烷液，残渣加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，甲醇洗涤药渣数次，合并滤液和洗液于100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，本品每粒含绿原酸不得少于1.40mg。

银翘解毒软胶囊成分较复杂，而临床用药强调整体性，现行的单一测定方法片面，无法全面、准确地评价中药制剂质量。

发明内容

本发明的目的是提供该药物的指纹图谱的测定方法，以便有效地控制本发明药物的质量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种银翘解毒软胶囊指纹图谱的测定方法，该方法采用高效液相色谱法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精密称取银翘解毒软胶囊1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，滤过；

(2)对照品溶液的制备：精密称取甘草苷、连翘酯苷A、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，加甲醇配成混合溶液，即得；

(3)测定方法：分别精密量取对照品和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，考察110min内供试品溶液的色谱分离情况，记录色谱图。

上述测定方法的优选方案为：

(1)供试品溶液的制备：精密称取银翘解毒软胶囊1g，置具塞锥形瓶中，加入50mL甲醇，超声30min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，0.45μm滤膜滤过；

(2)对照品溶液的制备：精密称取甘草苷、连翘酯苷A、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，加甲醇配成浓度分别为117.2、129.6、54.1、82.3、51.2、89.0、51.3、59.5、57.4μg/ml的混合溶液，即得；

(3)测定方法：分别精密量取对照品和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，考察110min内供试品溶液的色谱分离情况，记录80min色谱图。

其中所述流动相：乙腈：磷酸水溶液；乙腈5-25％：磷酸水溶液95-75％；梯度洗脱：T(min)0-150；柱温：30℃；检测波长327nm。

其中所述银翘解毒软胶囊指纹图谱用以下方法建立，取10批银翘解毒软胶囊，分别按上述供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，根据检测所得的10批检测数据，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行评价，在327nm检测波长下的相似度大于0.95的图谱为标准指纹图谱；

其中所述银翘解毒软胶囊指纹图谱在327nm检测波长下的指纹图谱具有14个特征峰，其中2号峰为新绿原酸，4号峰为绿原酸，5号峰为隐绿原酸，6号峰为咖啡酸，8号峰为甘草苷，9号峰为连翘酯苷A，12号峰为异绿原酸B，13号峰为异绿原酸A，14号峰为异绿原酸C；归属于金银花的有6个峰分别为峰2、4、5、12、13、14；归属于连翘的有5个峰分别为峰7、8、9、10、11；归属于薄荷的有3个峰分别为峰1、5、6；归属于牛蒡子的有7个峰分别为峰2、4、5、6、12、13、14；归属于甘草的3个峰分别为峰1、7、8；归属于桔梗1个峰为峰1。

本发明的测定方法，采用高效液相色谱法，其色谱条件优选为：

色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，

柱温：30℃，

流动相：A为乙腈，B为磷酸水溶液，

洗脱方式：梯度洗脱，

流动相流速：1.0ml/min，

进样量10μL，

检测波长：327nm。

其中所述流动相A为乙腈，B为0.1％磷酸水溶液。

其中，梯度洗脱过程如下：

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种银翘解毒软胶囊指纹图谱的构建方法。本发明的测定方法专属性强、操作简便、且具有优异的稳定性、精密度、重现性，可较全面的、完整、准确的评价银翘解毒软胶囊的有效性、安全性、稳定性和质量均一性。

为证实本发明指纹图谱测定方法的效果，发明人进行了大量的实验进行优选，并对最终确定的测定方法进行了科学的验证，验证实验如下：

1仪器与试药

1.1仪器与试剂：Agilent1100高效液相色谱仪系统，Agilent1200高效液相色谱仪系统，AB204-S电子天平，KQ-250DB型数控超声波清洗仪，HH-4数显恒温水浴锅，甲醇、乙腈，超纯水。

1.2试药：银翘解毒软胶囊(江苏康缘药业股份有限公司提供，批号分别为Z120701、Z120301、Z120801、Z120401、Z120501、Z120901、Z120902、Z120201、Z120702、Z120302)、对照品绿原酸(批号110753-200413)购于中国食品药品鉴定研究院，咖啡酸(批号110885-200102)、甘草苷(批号111610-201005)、连翘酯苷A(批号111810-201103)均购于中国药品生物制品检定所，新绿原酸(批号MUST-11112202)、隐绿原酸(批号MUST-11112203)、异绿原酸A(批号MUST-11061601)、异绿原酸B(批号MUST-11083102)、异绿原酸C(批号MUST-11081803)均购于成都曼思特生物科技有限公司。

2色谱条件的确定

2.1流动相的选择

考察了乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.05％三氟乙酸系统进行梯度洗脱，结果见附图1，结果表明选择乙腈-0.1％磷酸溶液进行梯度洗脱时，得到的色谱峰形较好，且较稳定。记录该色谱条件下110min色谱图，80min后无色谱峰出现，故色谱记录时间为80min。

2.2测定波长的选择

采用DAD二级管阵列检测器进行全波长扫描，比较了200～400nm所得的HPLC图谱，结果在250nm，280nm，327nm波长检测时，其HPLC图谱中呈现较多的色谱峰(见附图2)，但是为了排除辅料类成分干扰，同时使各色谱峰分离度较好、出峰数目适中、峰形较好，故确定327nm处波长为检测波长。

2.3色谱柱及仪器型号的考察

考察了Phenomenex GeminiC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，WatersSymmetryC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)3种不同型号的色谱柱，结果见附图3。Kromasil C18柱的出峰较其他两种色谱柱早，而且各色谱峰分离度较佳，峰形较好，因此选择Kromasil C18柱。

2.4柱温的选择

实验中考察了30℃、35℃、40℃三个柱温条件下，各色谱峰的分离情况见附图4，结果表明，不同柱温下的色谱峰略有区别，当温度升高时，部分峰发生峰位相对位移与合并，使分离度降低，因此选择在柱温30℃时进行检测。

3供试品溶液提取方法试验

为了能够在指纹图谱中全面反映银翘解毒软胶囊的成分，本发明未采用现有技术CN101991785A中供试品制备方法(取银翘解毒软胶囊内容物加入二氯甲烷，水浴回流，滤过，弃去二氯甲烷液，残渣加甲醇，超声处理)，本发明创新了供试品的制备方法，采取直接对银翘解毒软胶囊内容物进行提取，分别对提取溶剂(甲醇、乙醇、80％甲醇、50％甲醇)、提取方式(超声、加热回流)及提取时间进行了考察，最终选择用甲醇超声30min，方法简便，得到的色谱峰信息丰富。

4方法与结果

4.1对照品溶液的制备：精密称取甘草苷、连翘酯苷A、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，加甲醇配成浓度分别为117.2、129.6、54.1、82.3、51.2、89.0、51.3、59.5、57.4μg/ml的混合溶液，即得。

4.2供试品溶液的制备：取装量差异项下的银翘解毒软胶囊内容物(批号120701)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇，超声30min(30℃，100W，40kHz)，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，0.45μm滤膜滤过。

4.3色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长327nm，柱温30℃，体积流量1.0ml/min，流动相为乙腈(A)-0.1％的磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序的体积浓度配置如下：

4.4测定：精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件操作，考察110min内供试品溶液的色谱分离情况，记录80min色谱图。

4.5方法学考察

4.5.1精密度试验

取银翘解毒软胶囊(批号Z120701)供试品溶液连续进样6次，记录色谱图，以绿原酸为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各峰相对保留时间RSD均＜0.21％；相对峰面积RSD均＜2.52％，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

4.5.2稳定性考察

取银翘解毒软胶囊(批号Z120701)供试品溶液，分别在0，1.5，3，4.5，6，7.5，9，10.5，12h，24h测定，以绿原酸为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各峰相对保留时间RSD均＜0.37％；相对峰面积RSD均＜3.5％，表明供试品溶液在24h内保持稳定。

4.5.3重复性试验

精密称定银翘解毒软胶囊(批号Z120701)1g，按“供试品溶液的制备”项下方法分别制备供试品6份，分别进样，检测指纹图谱，以绿原酸为参照峰，计算共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各峰相对保留时间RSD均＜0.36％；相对峰面积RSD均＜3％，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱要求。

附图说明

图1不同流动相条件下银翘解毒软胶囊HPLC指纹图谱

图2不同波长条件下银翘解毒软胶囊HPLC指纹图谱

图33种不同型号的色谱柱的HPLC色谱图

图4不同柱温条件下银翘解毒软胶囊HPLC指纹图谱

图5银翘解毒软胶囊的HPLC色谱图

图610批银翘解毒软胶囊指纹图谱

图7银翘解毒软胶囊指纹图谱14个共有峰

图8制剂与提取物相关性图谱(a)制剂、(b)浸膏粉、(c)稠浸膏

图9制剂与药材相关性图谱(一)

图10制剂与药材相关性图谱(二)

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。

实施例1银翘解毒软胶囊指纹图谱的测定方法

1仪器与试药

1.1仪器与试剂：Agilent1100高效液相色谱仪系统，Agilent1200高效液相色谱仪系统，AB204-S电子天平，KQ-250DB型数控超声波清洗仪，HH-4数显恒温水浴锅，甲醇、乙腈，超纯水。

1.2试药：银翘解毒软胶囊、绿原酸对照品、咖啡酸对照品、甘草苷对照品、连翘酯苷A对照品、新绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸C对照品。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备：精密称取甘草苷、连翘酯苷A、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，加甲醇配成浓度分别为117.2、129.6、54.1、82.3、51.2、89.0、51.3、59.5、57.4μg/ml的混合溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备：取装量差异项下的银翘解毒软胶囊内容物约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇，超声30min(30℃，100W，40kHz)，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，0.45μm滤膜滤过。

2.3色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长327nm，柱温30℃，体积流量1.0ml/min，流动相为乙腈(A)-0.1％的磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序的体积浓度配置如下：

2.4测定：精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件操作，考察110min内供试品溶液的色谱分离情况，记录80min色谱图。

结果见附图5。

实施例2银翘解毒软胶囊指纹图谱的建立

1方法与结果

采用实施例1所述方法测定共10个批次的银翘解毒软胶囊(批号分别为Z120701、Z120301、Z120801、Z120401、Z120501、Z120901、Z120902、Z120201、Z120702、Z120302)。

10个批次的银翘解毒软胶囊的指纹图谱如附图6所示。

2共有峰的确定

将上述得到的多批次银翘解毒软胶囊的高效液相色谱指纹图谱经国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”进行比较，共有模式(参照指纹图谱)共出现14个。其中2号峰为新绿原酸，4号峰为绿原酸，5号峰为隐绿原酸，6号峰为咖啡酸，8号峰为甘草苷，9号峰为连翘酯苷A，12号峰为异绿原酸B，13号峰为异绿原酸A，14号峰为异绿原酸C，它们构成了银翘解毒软胶囊的指纹特征，具体见附图7。

3相似度的评价

通过10批次银翘解毒软胶囊HPLC图谱的比较，进行相似度评价：采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)”对10批次银翘解毒软胶囊进行相似度计算，10批次银翘解毒软胶囊与对照指纹图谱相似度均大于0.97(表1)。

表1银翘解毒软胶囊相似度比较结果

4药材、提取物与成品相关性研究

取银翘解毒软胶囊处方中药材各1g，精密加入甲醇50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取提取物0.5g(提取物为成品制备工艺中各药材提取液合并浓缩后的稠浸膏及稠浸膏干燥后得到的浸膏粉，不包括挥发油)，精密加入甲醇50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取上述供试品溶液照成品指纹图谱方法测定。药材、提取物和成品相关性见附图8、9、10。

由中药提取物指纹图谱与银翘解毒软胶囊指纹图谱的对比可以看出，在成品指纹图谱中的14个指纹峰在提取物指纹图谱中均有所体现。

根据以上成品与药材指纹图谱的对比，可以看出在成品指纹图谱中所显现的14个特征峰的归属。归属于金银花的有6个峰分别为峰2、4、5、12、13、14；归属于连翘的有5个峰分别为峰7、8、9、10、11；归属于薄荷的有3个峰分别为峰1、5、6；归属于牛蒡子的有7个峰分别为峰2、4、5、6、12、13、14；归属于甘草的3个峰分别为峰1、7、8；归属于桔梗1个峰为峰1；归属于淡竹叶0个峰；归属于淡豆豉0个峰。

Claims (8)

1.一种银翘解毒软胶囊指纹图谱的测定方法，其特征在于该方法采用高效液相色谱法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精密称取银翘解毒软胶囊1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，滤过；

(2)对照品溶液的制备：精密称取甘草苷、连翘酯苷A、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，加甲醇配成混合溶液，即得；

(3)测定方法：分别精密量取对照品和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，考察110min内供试品溶液的色谱分离情况，记录色谱图。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，

柱温：30℃，

流动相：A为乙腈，B为磷酸水溶液，

洗脱方式：梯度洗脱，

流动相流速：1.0ml/min，

检测波长：327nm。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，流动相B为0.1％的磷酸水溶液。

4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，洗脱时间为0-150分钟。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，洗脱时间为0-110分钟。

6.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱步骤为：0～20分钟，流动相乙腈：磷酸水溶液的体积比由5∶95渐变为15∶85；20～45分钟，流动相乙腈：磷酸水溶液的体积比由15∶85渐变为20∶80；45～80分钟，流动相乙腈：磷酸水溶液的体积比由20∶80渐变为25∶75。

7.根据权利要求1所述银翘解毒软胶囊的指纹图谱测定方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：精密称取银翘解毒软胶囊1g，置具塞锥形瓶中，加入50mL甲醇，超声30min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，0.45μm滤膜滤过；

(2)对照品溶液的制备：精密称取甘草苷、连翘酯苷A、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，加甲醇配成浓度分别为117.2、129.6、54.1、82.3、51.2、89.0、51.3、59.5、57.4ug/ml的混合溶液，即得；

(3)测定方法：分别精密量取对照品和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，考察110min内供试品溶液的色谱分离情况，记录80min色谱图。

8.根据权利要求1或7所述银翘解毒软胶囊的指纹图谱测定方法得到的HPLC指纹图谱，其特征在于，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度大于0.95。

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