CN105842373A - 一种建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法。该方法，以金银花配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰1号峰新绿原酸、2号峰绿原酸、3号峰隐绿原酸、4号峰芦丁、5号峰木犀草苷、6号峰、7号峰异绿原酸A和8号峰异绿原酸C，选择2号峰绿原酸作为内参考峰，确定了金银花配方颗粒的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测其质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法。
背景技术
金银花配方颗粒是通过对中药金银花进行提取、浓缩、制粒所得。金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，主要含有挥发油、黄酮类、三菇类、有机酸类、环烯醚菇类、醇类和微量元素等多种成分，具有清热解毒，疏散风热，凉血止痢，降血降火，消咽利膈之功效。
《中国药典》2015年版对金银花的质量控制包括原植物品种、药材性状、理化鉴别、含量测定等项目，文献也对金银花中化学成分进行阐述，包括含有挥发油、黄酮类、三菇类、有机酸类、环烯醚菇类、醇类和微量元素等成分。然而，一方面，通过上述单一成分的含量测定或鉴别金银花配方颗粒，不能从整体上检测和控制其质量；另一方面，通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别金银花配方颗粒，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。
因此，建立一种能够全面地、快速地检测金银花配方颗粒的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。
发明内容
为此，本发明提出一种建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，该方法包括如下步骤：
(1)取待测金银花的药物制剂0.3-0.5重量份，精密称定，精密加入40～60％甲醇水溶液20-30体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取20-40分钟，放冷，再称定重量，取40～60％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取绿原酸对照品，加40～60％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002-0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取木犀草苷对照品，加40～60％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002-0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取芦丁对照品，加40～60％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002-0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.4％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-15min，A：B为10％：90％；15-20min，A：B为10％：90％→15％：85％；20min，A：B为15％：85％；20-50min，A：B为15％：85％→20％：80％；50min，A：B为20％：80％；50-55min，A：B为20％：80％→30％：70％；55min，A：B为30％：70％；55-60min，A：B为30％：70％→10％：90％；检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.010-0.020体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱；
所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，该方法包括如下步骤：
(1)取待测金银花的药物制剂0.4重量份，精密称定，精密加入50％甲醇水溶液25体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取绿原酸对照品，加50％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00004重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取木犀草苷对照品，加50％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00004重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取芦丁对照品，加50％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00004重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.4％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-15min，A：B为10％：90％；15-20min，A：B为10％：90％→15％：85％；20min，A：B为15％：85％；20-50min，A：B为15％：85％→20％：80％；50min，A：B为20％：80％；50-55min，A：B为20％：80％→30％：70％；55min，A：B为30％：70％；55-60min，A：B为30％：70％→10％：90％；检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.015体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
进一步优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，以4.6mm×250mm、5μm的Dikma C18、4.6mm×250mm、5μm的Kromasil 100-5C18、4.6mm×250mm、5μm的Welch Ultimate XB-C18或4.6mm×250mm、5μm的Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱。
进一步优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
进一步优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，所述金银花的药物制剂通过以下方法制备而成：
取金银花，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
进一步优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，所述金银花的药物制剂通过以下方法制备而成：
取金银花，加热回流提取1～5次，每次加入8～25重量倍量的水提取10min～1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05～1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
进一步优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，所述金银花的药物制剂通过以下方法制备而成：
取金银花，加热回流提取2次，第1次加入15重量倍量的水提取0.5h，第2次加入13重量倍量的水提取0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05～1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
进一步优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，所述金银花的药物制剂的指纹图谱中，共有特征峰为：1号峰新绿原酸、2号峰绿原酸、3号峰隐绿原酸、4号峰芦丁、5号峰木犀草苷、6号峰、7号峰异绿原酸A和8号峰异绿原酸C，以2号峰为内参考峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.54～0.60、2号峰1.00、3号峰1.08～1.19、4号峰2.79～3.09、5号峰3.04～3.36、6号峰3.51～3.88、7号峰3.72～4.11、8号峰4.30～4.75。
进一步优选地，本发明上述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述金银花的药物制剂的指纹图谱中，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.57、2号峰1.00、3号峰1.14、4号峰2.94、5号峰3.20、6号峰3.70、7号峰3.91、8号峰4.52。
本发明还提供上述方法在金银花的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，以金银花配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰1号峰新绿原酸、2号峰绿原酸、3号峰隐绿原酸、4号峰芦丁、5号峰木犀草苷、6号峰、7号峰异绿原酸A和8号峰异绿原酸C，选择2号峰绿原酸作为指纹图谱中的内参考峰，确定了金银花配方颗粒的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测金银花配方颗粒的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1～图5分别是本发明实验例1中梯度1、2、3、4、5的色谱图；
图6～图9分别是本发明实验例1中不同流动相的色谱图；
图10～图13是本发明实验例1中不同色谱柱的色谱图；
图14～图16是本发明实验例1中不同流速的色谱图；
图17～图20是本发明实验例1中不同柱温的色谱图；
图21～图24是本发明实验例1中不同进样量的色谱图；
图25～图31是本发明实验例2中不同提取溶剂的色谱图；
图32～35是本发明实验例2中不同提取时间的色谱图；
图36～38是本发明实验例2中不同溶剂加入量的色谱图；
图39是本发明实验例3中18批金银花配方颗粒的特征指纹图谱；；
图40是本发明实验例3中金银花配方颗粒的对照特征指纹图谱；
图41是本发明实验例3中不同特征峰的对照品定位图；
图42是本发明实验例4中精密度实验结果；
图43是本发明实验例4中重复性实验结果；
图44是本发明实验例4中专属性实验结果；
图45是本发明实验例4中稳定性实验结果。
具体实施方式
实施例1
以下实施例和实验例中，金银花配方颗粒的制备方法为：取金银花，加热回流提取2次，第1次加入15重量倍量的水提取0.5h，第2次加入13重量倍量的水提取0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05～1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
实施例2
本实施例建立金银花配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测金银花的药物制剂0.4g，精密称定，精密加入50％甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取绿原酸对照品，加50％甲醇水溶液制成每1mL含0.00004g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取木犀草苷对照品，加50％甲醇水溶液制成每1mL含0.00004g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取芦丁对照品，加50％甲醇水溶液制成每1mL含0.00004g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.4％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-15min，A：B为10％：90％；15-20min，A：B为10％：90％→15％：85％；20min，A：B为15％：85％；20-50min，A：B为15％：85％→20％：80％；50min，A：B为20％：80％；50-55min，A：B为20％：80％→30％：70％；55min，A：B为30％：70％；55-60min，A：B为30％：70％→10％：90％；检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.015mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例3
本实施例建立金银花配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测金银花的药物制剂0.3g，精密称定，精密加入60％甲醇水溶液20mL，称定重量，加热回流提取或超声提取40分钟，放冷，再称定重量，取60％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取绿原酸对照品，加60％甲醇水溶液制成每1mL含0.00002g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取木犀草苷对照品，加60％甲醇水溶液制成每1mL含0.00002g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取芦丁对照品，加60％甲醇水溶液制成每1mL含0.00002g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.4％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-15min，A：B为10％：90％；15-20min，A：B为10％：90％→15％：85％；20min，A：B为15％：85％；20-50min，A：B为15％：85％→20％：80％；50min，A：B为20％：80％；50-55min，A：B为20％：80％→30％：70％；55min，A：B为30％：70％；55-60min，A：B为30％：70％→10％：90％；检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.010mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例4
本实施例建立金银花配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测金银花的药物制剂0.5g，精密称定，精密加入40％甲醇水溶液30mL，称定重量，加热回流提取或超声提取20分钟，放冷，再称定重量，取40％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取绿原酸对照品，加40％甲醇水溶液制成每1mL含0.00006g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取木犀草苷对照品，加40％甲醇水溶液制成每1mL含0.00006g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取芦丁对照品，加40％甲醇水溶液制成每1mL含0.00006g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.4％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-15min，A：B为10％：90％；15-20min，A：B为10％：90％→15％：85％；20min，A：B为15％：85％；20-50min，A：B为15％：85％→20％：80％；50min，A：B为20％：80％；50-55min，A：B为20％：80％→30％：70％；55min，A：B为30％：70％；55-60min，A：B为30％：70％→10％：90％；检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.020mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实验例
1、仪器与试药
仪器包括：高效液相色谱仪；天平；超声波发生器；超纯水系统；
试药包括：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；金银花配方颗粒(序号1-15)由华润三九医药股份有限公司提供，按照实施例1的制备方法制备而成。
实施例1色谱分析条件的确定
(1)检测波长的选择
分析不同吸收波长(327nm、350nm、354nm、210nm)下的色谱图，以色谱峰数量和峰高作为指标，确定350nm作为检测波长。
(2)梯度的选择
不同的梯度洗脱程序如表1～5所示，不同梯度洗脱程序的色谱图如图1～5所示。由图1～5可知，梯度4和梯度5洗脱呈现的图谱，其色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度高，基线较平稳且分析时间较为合理，确定了流动相梯度为梯度5。
表1 梯度1的梯度洗脱程序
表2 梯度2的梯度洗脱程序
表3 梯度3的梯度洗脱程序
表4 梯度4的梯度洗脱程序
表5 梯度5的梯度洗脱程序
(3)流动相成分的选择
选择流动相分别为0.3％磷酸-乙腈、0.4％磷酸-乙腈、0.5％磷酸-乙腈、0.5％冰醋酸-乙腈的金银花配方颗粒分离效果，各流动相的色谱图如图6～9所示。由图6～9可知，与其他流动相比，0.4％磷酸-乙腈更适合于金银花配方颗粒所有成分的分离。
(4)不同色谱柱的考察
取同一份金银花配方颗粒样品的供试品溶液，考察了实验室中现有的色谱柱：(1)DikmaC18(2)5μm 4.6mm×250mm Ser#201042495；(2)Kromasil 100-5C18 5μm 4.6mm×250mm S/N:E75576；(3)welch Ultimate XB-C18 5μm4.6mm×250mm S/N:211203667；(4)Agilent Zorbax SB-C18 5μm4.6mm×250mm PN:880975-902。按1.0mL/min的流速进行梯度洗脱分析，不同色谱柱的色谱图如图10～13所示。由图10～13可知，Agilent Zorbax SB-C18对金银花配方颗粒的分离效果较好。
(5)不同流速的考察
分别以0.8mL/min、1.0mL/min，1.2mL/min流速测定，不同流速的色谱图如图14～16所示。由图14～16可知，流速为1.0mL/min流速的色谱效果较好。
(6)不同柱温的选择
取同一份金银花配方颗粒样品的供试品溶液，考察不同柱温25℃、30℃、35℃、40℃对本品的分离效果，不同柱温的色谱图如图17～20所示，系统适应性参数如表6所示。由图17～20和表6可知，柱温为35℃、40℃的色谱图，其各成分分离效果较好，结合绿原酸和木犀草苷的色谱峰系统适应性参数以及色谱峰的个数，故选择柱温为35℃。
表6 柱温为35℃、40℃的色谱峰系统适应性参数
(7)进样量考察
进样量为5μL、10μL、15μL、20μL的色谱图如图21～24所示，系统适应性参数如表7所示。由图21～24和表7可知，进样量为15μL的色谱图的效果较好。
表7 不同进样量的色谱峰的系统适应性参数
(8)最终色谱条件
色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250mm，4.6mm，5μm)；以乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱如表8所示；流速：1.0mL/min；柱温为35℃；检测波长为350nm，理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000，进样量：15μL。
表8 梯度洗脱程序
实验例2供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的选择
提取溶剂为水、乙醇、甲醇、70％乙醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇色谱图如图25～31所示，主要特征峰的系统适应性参数如表9所示。由图25～31和表9可知，提取溶剂为50％的甲醇时，所得色谱图的峰型较好，系统适应性参数相对较优。
表1 不同提取溶剂的色谱图的系统适应性参数
(2)提取时间的选择
提取时间为15min、30min、45min、60min的色谱图如图32～35所示，系统适应性参数如表10所示。由图32～35和表10所示，不同的超声时间的溶解效果及色谱图无明显差异，故选择提取时间为30min。
表2 不同提取时间下金银花配方颗粒色谱图参数
(3)提取溶剂加入量的选择
根据确定的提取溶剂，考察50％甲醇的不同加入量：15mL、25mL、50mL，以绿原酸和木犀草苷的分离效果和系统适应性参数作为考察指标，不同提取溶剂的加入量的色谱图36～38所示，系统适应性参数如表11所示。如图36～38和表11可知，加入不同体积的提取溶剂对金银花配方颗粒的提取效果相近，色谱分离效果无明显差异。因此选择25mL的50％甲醇的色谱图的效果较好。
表3 不同提取溶剂量的色谱峰的系统适应性参数
(3)最终提取方案
供试品溶液的制备方法为：取本品粉末约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验例3金银花配方颗粒特征指纹图谱的建立
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，通过对所得指纹图谱的进行相似度比较(以平均数建立参照特征指纹图谱)，并进行方法学考察。
根据实验例1和2，确定金银花配方颗粒HPLC特征指纹图谱按如下方法建立：(1)供试品溶液的制备：取金银花配方颗粒粉末约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；参照物溶液的制备：取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇分别制成每1mL含40μg的溶液，即得(10℃以下保存)。取木犀草苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得。取芦丁对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得。(2)高效液相HPLC色谱分析条件：色谱柱：AgilentZorbax SB-C18色谱柱(250mm，4.6mm，5μm)；以乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱如表8所示；流速：1.0mL/min；柱温为35℃；检测波长为350nm，理论板数按木犀草苷峰计算应不低于2000，进样量：15μL。按上述方法进行金银花配方颗粒特征指纹图谱的共有模式的建立。
取18个批次的金银花配方颗粒样品作为供试品溶液，通过高效液相色谱得到金银花配方颗粒特征指纹图谱，图39为18批金银花配方颗粒的特征指纹图谱(S1～S18依次为批号S1：130602 S2:130603 S3：130604 S4：A1300777 S5：A1300855 S6：A1300856 S7：1307001S S8：1307002S S9：1307003S S10：1305399 S11：1305400 S12：1305401 S13：1303093 S14：1303105 S15：1303117 S16：G1305004 S17：G1305005 S18：G1305006)，图40为金银花配方颗粒对照特征指纹图谱。
采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征指纹图谱，对配方颗粒特征图的检测结果进行分析、比较。由图39可知，金银花配方颗粒HPLC特征指纹图谱共有色谱峰8个，其中7个峰(峰1、2、3、4、5、7、8)为已知成分峰；选取2号峰绿原酸为内参考峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内，规定值分别为：0.57(1号峰，新绿原酸)、1.00(2号峰，绿原酸)、1.14(3号峰，隐绿原酸)、2.94(4号峰，芦丁)、3.20(5号峰，木犀草苷)、3.70(6号峰)、3.91(7号峰，异绿原酸A)、4.52(8号峰，异绿原酸C)。所得结果如表12～15所示，不同特征峰的对照品定位见图41所示。
表4 金银花配方颗粒共有模式相对保留时间
表5 金银花配方颗粒共有模式匹配数据
表6 18批金银花配方颗粒特征指纹图谱测定结果
表7 18批金银花配方颗粒特征指纹图谱相似度结果
实验例4金银花配方颗粒特征图谱的方法学验证
4.1精密度
4.1.1精密度实验
取同一份供试品溶液(批号1307002S)，按实验例3项下色谱条件，重复进样6次，测定8个共有峰的相对保留时间，结果如表16～17所示，精密度实验的色谱图如图42所示。由表16～17和图42可知，各特征峰与参照物S峰(2号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.33％、0％、0.05％、0.36％、0.35％、0.32％、0.32％、0.30％，与金银花配方颗粒对照特征图谱的相似度分别大于0.998，这表明精密度较好。
表8 精密度实验结果
表9 精密度实验相似度结果
4.1.2重复性实验
取同一批号供试品(批号为1307002S)6份，按实验例3的方法分别测定8个共有峰的相对保留时间，结果如表18～19所示，重复性实验的色谱图如图43所示。由表18～19和图43可知，结果各特征峰与内参考峰(2号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.19％、0％、0.05％、0.23％、0.23％、0.22％、0.23％、0.21％，与金银花配方颗粒对照特征图谱的相似度分别大于0.997，表明本方法重复性较好。
表10 重复性实验结果(n＝6)
表11 重复性实验的相似度结果(n＝6)
4.2专属性实验
供试品采用提取溶剂为50％甲醇，精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液(50％甲醇+麦芽糊精)各15μL，分别注入高效液相色谱仪，按实验例的方法，结果如图44所示。由图44可知，空白溶剂在相应保留时间处无色谱峰，无干扰，符合要求。
4.3稳定性实验
取同一批号供试品(批号1307002S)，按实验例3方法操作，分别在0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21小时进样，测定8个共有峰的相对保留时间，结果如表20～21所示，稳定性实验的色谱图如图45所示。由表20～21和图45所示，各特征峰与参照物S峰(2号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.29％、0％、0.09％、0.42％、0.41％、0.38％、0.37％、0.32％，与金银花配方颗粒对照特征图谱的相似度分别大于0.998；这表明供试品溶液在21小时内稳定，符合测定要求。
表20 稳定性实验结果
表21 稳定性实验的相似度结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，
该方法包括如下步骤：
(1)取待测金银花的药物制剂0.3-0.5重量份，精密称定，精密加入40～60％甲醇水溶液20-30体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取20-40分钟，放冷，再称定重量，取40～60％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取绿原酸对照品，加40～60％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002-0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取木犀草苷对照品，加40～60％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002-0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取芦丁对照品，加40～60％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00002-0.00006重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.4％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-15min，A：B为10％：90％；15-20min，A：B为10％：90％→15％：85％；20min，A：B为15％：85％；20-50min，A：B为15％：85％→20％：80％；50min，A：B为20％：80％；50-55min，A：B为20％：80％→30％：70％；55min，A：B为30％：70％；55-60min，A：B为30％：70％→10％：90％；检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.010-0.020体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱；
所述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
2.根据权利要求1所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)取待测金银花的药物制剂0.4重量份，精密称定，精密加入50％甲醇水溶液25体积份，称定重量，加热回流提取或超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取绿原酸对照品，加50％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00004重量份的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取木犀草苷对照品，加50％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00004重量份的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取芦丁对照品，加50％甲醇水溶液制成每1体积份含0.00004重量份的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.4％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-15min，A：B为10％：90％；15-20min，A：B为10％：90％→15％：85％；20min，A：B为15％：85％；20-50min，A：B为15％：85％→20％：80％；50min，A：B为20％：80％；50-55min，A：B为20％：80％→30％：70％；55min，A：B为30％：70％；55-60min，A：B为30％：70％→10％：90％；检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.015体积份，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
3.根据权利要求1或2所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，以4.6mm×250mm、5μm的Dikma C18、4.6mm×250mm、5μm的Kromasil 100-5 C18、4.6mm×250mm、5μm的Welch Ultimate XB-C18或4.6mm×250mm、5μm的Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱。
4.根据权利要求1-3任一项所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述金银花的药物制剂通过以下方法制备而成：
取金银花，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
6.根据权利要求5所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述金银花的药物制剂通过以下方法制备而成：
取金银花，加热回流提取1～5次，每次加入8～25重量倍量的水提取10min～1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05～1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
7.根据权利要求6所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述金银花的药物制剂通过以下方法制备而成：
取金银花，加热回流提取2次，第1次加入15重量倍量的水提取0.5h，第2次加入13重量倍量的水提取0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05～1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
8.根据权利要求1-7任一项所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述金银花的药物制剂的指纹图谱中，共有特征峰为：1号峰新绿原酸、2号峰绿原酸、3号峰隐绿原酸、4号峰芦丁、5号峰木犀草苷、6号峰、7号峰异绿原酸A和8号峰异绿原酸C，以2号峰为内参考峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.54～0.60、2号峰1.00、3号峰1.08～1.19、4号峰2.79～3.09、5号峰3.04～3.36、6号峰3.51～3.88、7号峰3.72～4.11、8号峰4.30～4.75。
9.根据权利要求8所述的建立金银花的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述金银花的药物制剂的指纹图谱中，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.57、2号峰1.00、3号峰1.14、4号峰2.94、5号峰3.20、6号峰3.70、7号峰3.91、8号峰4.52。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在金银花的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。
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