CN107576743B - 鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，目的为：建立鼻宁喷雾剂的HPLC指纹图谱，为鼻宁喷雾剂的质量控制提供依据。方法为：采用Neptune C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈－0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长326 nm，柱温25℃，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》进行相似度分析。结果：建立的指纹图谱和含量测定分析方法专属性、精密度、重复性和稳定性良好，20批鼻宁喷雾剂指纹图谱分析得到40个共有峰，各批次样品相似度在0.955以上。结论：本实验所建立的鼻宁喷雾剂指纹图谱分析方法快速、简便、准确，能有效评价该制剂的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，以及利用上述方法建立的鼻宁喷雾剂指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱能更全面的反映药品中化学成分的信息，广泛用于中药材或中成药的质量控制。中药及其制剂均属于多组分复杂体系，评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材、半成品以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
鼻宁喷雾剂是鼻科苗药品种，由鹅不食草和一枝黄花经水提醇沉而制得，具有疏风解表、清热通窍之功效，临床用于治疗急性、慢性单纯性和过敏性鼻炎等疾病。鹅不食草和一枝黄花均为菊科植物，所含化学成分复杂，均含挥发油、黄酮类、萜类、甾醇类等成分。但该品种现行标准（WS-10548(ZD-0548)-2002-2012Z）中仅采用薄层色谱鉴别二味药材和检测芦丁的含量，难以全面综合评价该复方制剂的内在质量。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法。
本发明的第二目的是提供一种鼻宁喷雾剂指纹图谱。
为了实现上述第一目的，本发明提供一种鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：
步骤1，将鼻宁喷雾剂供试品用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取绿原酸、芦丁和异绿原酸A对照品适量，精密称定，加溶剂制成混合对照品溶液；
步骤2，对样品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录60min图谱；
高效液相色谱条件如下：
流动相A和B分别为，甲醇－水、甲醇－0.2v/v％冰醋酸水溶液、甲醇－0.2%磷酸水溶液、乙腈－水、乙腈－0 .1v/v％磷酸水溶液、乙腈－0 .2v/v％磷酸水溶液、乙腈－0.1v/v％冰醋酸水溶液、乙腈－0 .1v/v％甲酸水溶液；优选的，以乙腈为流动相A，以0 .2v/v％磷酸水溶液为流动相B。
流动相进行梯度洗脱，洗脱程序以如下体积浓度配制进行：
0～65min，10%～35% 流动相A，65%～90% 流动相B；优选的，0～15 min，10%～15%流动相A，90%～85% 流动相B；15～25 min，15%～20%流动相 A,85%～80% 流动相B；25～55min，20%～35%流动相 A，80%～65%流动相 B；55～65 min，35%～10% 流动相A，65%～90% 流动相B。
流速为0 .8 ml/min～1 .2 ml/min；优选的，流速为1 .0 ml/min。
柱温为20 ℃～35 ℃；优选的，柱温为25 ℃。
检测波长为230 nm～400 nm；优选的，检测波长为326 nm。
本发明如上所述的鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，优选的，在步骤1中，所述微孔滤膜为0.22 μm，或者为0.45 μm。更优选的为0.22 μm。所述溶剂为20～100 v/v％的甲醇水溶液。更优选的，所述溶剂为50 v/v％的甲醇水溶液。
本发明如上所述的鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，优选的，步骤1的具体过程为：取将鼻宁喷雾剂供试品用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取绿原酸、芦丁和异绿原酸A对照品适量，精密称定，加50 v/v%甲醇水溶液制成每1 mL含绿原酸、芦丁和异绿原酸A分别为20～500 μg的混合对照品溶液。
本发明如上所述的鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，优选的高效液相色谱条件如下：以乙腈为流动相A，以0.2 v/v％磷酸溶液为流动相B；流速为1.0 ml/min；柱温为25 ℃；检测波长为326 nm。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种鼻宁喷雾剂指纹图谱，其特征峰为
11号峰绿原酸，22号峰芦丁和28号峰异绿原酸A，其保留时间分别为12.985±0.057 min、28.217±0.067 min、34.961±0.077 min。进一步，鼻宁喷雾剂指纹图谱还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、6号峰、7号峰、9号峰、10号峰、12号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、23号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、29号峰、30号峰、31号峰、32号峰、33号峰、34号峰、35号峰、36号峰、37号峰、38号峰、39号峰和40号峰，其保留时间分别为2.959±0.005 min、3.930±0.010 min、7.118±0.029 min、7.864±0.022 min、8.460±0.037 min、9.249±0.031 min、10.285±0.071 min、11.239±0.038 min、11.647±0.052 min、12.136±0.056 min、13.651±0.055 min、14.253±0.068min、16.502±0.073 min、17.394±0.090 min、19.282±0.075 min、20.595±0.052 min、21.526±0.085 min、23.484±0.079 min、25.363±0.044 min、27.188±0.044 min、29.071±0.084 min、30.130±0.071 min、31.561±0.086 min、32.302±0.054 min、33.321±0.069 min、37.431±0.064 min、41.223±0.100 min、43.668±0.088 min、44.677±0.059 min、46.375±0.066 min、48.314±0.068 min、49.947±0.067 min、51.109±0.049 min、53.819±0.073 min、55.165±0.059 min、57.886±0.070 min、58.223±0.052 min。
本发明的有益效果是：
1.用本发明所提供的方法所建立的鼻宁喷雾剂指纹图谱，能有效地表征鼻宁喷雾剂的质量，有利于全面监控制剂的质量。指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定鼻宁喷雾剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性。
2.本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
附图说明
图1为20批鼻宁喷雾剂HPLC 特征谱图（S1～S20）和对照图谱（R）。
图2为鼻宁喷雾剂（A）、一枝黄花（B）、鹅不食草（C）、混合对照品（D）、辅料空白样品（E）的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一种鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：
步骤一，将鼻宁喷雾剂供试品用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取绿原酸、芦丁和异绿原酸A对照品适量，精密称定，加溶剂制成混合对照品溶液；
步骤二，对样品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录60min图谱；
高效液相色谱条件如下：
流动相A和B分别为，甲醇－水、甲醇－0.2v/v％冰醋酸水溶液、甲醇－0.2%磷酸水溶液、乙腈－水、乙腈－0 .1v/v％磷酸溶液、乙腈－0 .2v/v％磷酸水溶液、乙腈－0 .1v/v％冰醋酸水溶液、乙腈－0 .1v/v％甲酸水溶液；优选的，以乙腈为流动相A，以0 .2v/v％磷酸水溶液为流动相B。
流动相进行梯度洗脱，洗脱程序以如下体积浓度配制进行：
0～65min，10%～35% 流动相A，65%～90% 流动相B；优选的，0～15 min，10%～15%流动相A，90%～85% 流动相B；15～25 min，15%～20%流动相 A,85%～80% 流动相B；25～55min，20%～35%流动相 A，80%～65%流动相 B；55～65 min，35%～10% 流动相A，65%～90% 流动相B。
流速为0 .8 ml/min～1 .2 ml/min；优选的，流速为1 .0 ml/min。
柱温为20 ℃～35 ℃；优选的，柱温为25 ℃。
检测波长为230 nm～400 nm；优选的，检测波长为326 nm。
本发明如上所述的鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，优选的，在步骤1中，所述微孔滤膜为0.22 μm，或者为0.45 μm。更优选的为0.22 μm。所述溶剂为20～100 v/v％的甲醇水溶液。更优选的，所述溶剂为50 v/v％的甲醇水溶液。
本发明如上所述的鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，优选的，步骤1的具体过程为：取将鼻宁喷雾剂供试品用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取绿原酸、芦丁和异绿原酸A对照品适量，精密称定，加50 v/v%甲醇水溶液制成每1 mL含绿原酸、芦丁和异绿原酸A分别为20～500 μg的混合对照品溶液。
本发明如上所述的鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，优选的高效液相色谱条件如下：以乙腈为流动相A，以0.2 v/v％磷酸溶液为流动相B；流速为1.0 ml/min；柱温为25 ℃；检测波长为326 nm。
一种鼻宁喷雾剂指纹图谱，其特征峰为
11号峰绿原酸，22号峰芦丁和28号峰异绿原酸A，其保留时间分别为12.985±0.057 min、28.217±0.067 min、34.961±0.077 min。进一步，鼻宁喷雾剂指纹图谱还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、6号峰、7号峰、9号峰、10号峰、12号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、23号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、29号峰、30号峰、31号峰、32号峰、33号峰、34号峰、35号峰、36号峰、37号峰、38号峰、39号峰和40号峰，其保留时间分别为2.959±0.005 min、3.930±0.010 min、7.118±0.029 min、7.864±0.022 min、8.460±0.037 min、9.249±0.031 min、10.285±0.071 min、11.239±0.038 min、11.647±0.052 min、12.136±0.056 min、13.651±0.055 min、14.253±0.068min、16.502±0.073 min、17.394±0.090 min、19.282±0.075 min、20.595±0.052 min、21.526±0.085 min、23.484±0.079 min、25.363±0.044 min、27.188±0.044 min、29.071±0.084 min、30.130±0.071 min、31.561±0.086 min、32.302±0.054 min、33.321±0.069 min、37.431±0.064 min、41.223±0.100 min、43.668±0.088 min、44.677±0.059 min、46.375±0.066 min、48.314±0.068 min、49.947±0.067 min、51.109±0.049 min、53.819±0.073 min、55.165±0.059 min、57.886±0.070 min、58.223±0.052 min。
1、材料
1.1、仪器
1260型液相色谱仪，包括DAD检测器（美国Agilent公司），BT125D电子天平（德国Sartorius公司），JA1002电子天平（上海浦春计量仪器有限公司），Exceed-Cd-20 型实验室超纯水机（成都艾科水处理设备有限公司）。
1.2、试剂
绿原酸、芦丁（中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-201415、100080-201409，纯度分别为96.2%、92.6%），异绿原酸A（成都普菲德生物技术有限公司，批号151028，纯度98.2%），乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。20批鼻宁喷雾剂（百花医药集团有限公司，10 mL/瓶，批号分别为20150807、20150815、20150827、20150904、20150912、20150920、20151009、20151017、20151030、20151104、20151114、20151128、20151203、20151214、20151224、20160106、20160112、20160120、20160209、20160217，依次标记S1～S20）。
1.3、药材
鹅不食草、一枝黄花，购买于贵州省毕节市玲源中药材行，经遵义医学院杨建文主任药师鉴定分别为鹅不食草Centipeda minima (L.) A.Br. et Aschers.和一枝黄花Solidago decurrens Lour.的干燥全草。
2、方法与结果
2.1、色谱条件
色谱柱：Neptune C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）－0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0～15 min，10%～15% A；15～25 min，15%～20% A；25～55 min，20%～35% A；55～65 min，35%～10% A；流速：1.0 mL/min，检测波长：326 nm，柱温：25 ℃，进样量：10 μL。
2.2、溶液的制备
2.2.1、混合对照品溶液的制备
取绿原酸、芦丁和异绿原酸A对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含绿原酸、芦丁和异绿原酸A分别为140、403.6、322.56 μg的混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
将鼻宁喷雾剂供试品用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3、阴性供试品溶液的制备
按鼻宁喷雾剂质量标准的处方和制备工艺制备缺鹅不食草阴性样品、缺一枝黄花阴性样品和双阴性样品，分别用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得阴性供试品溶液。
2.3、指纹图谱建立
2.3.1、精密度、稳定性、重复性试验
按2.1项下色谱条件，取同一供试品溶液（批号20150807），连续进样6次考察精密度，分别在0、2、4、6、8、12 h进样测定考察稳定性，均记录主要色谱峰的相对保留时间和峰面积，并计算RSD。重复性试验中，取同一批供试品（批号20150807），按2.2.2项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样检测，记录主要色谱峰的相对保留时间和峰面积，并计算RSD。结果，精密度、稳定性和重复性试验中，40个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别均小于0.5%、2.5%，0.3%、2.5%和0.5%、5%，结果表明建立的分析方法精密度、重复性良好，供试品溶液在 12 h 内稳定。
2.3.2、指纹图谱的建立与相似度分析
按2.1项下色谱条件检测20批鼻宁喷雾剂供试品溶液（S1～S20）、混合对照品溶液和阴性供试品溶液，通过色谱峰的对比分析，对主要色谱峰进行药材来源和化学指认。将各批次供试品溶液的色谱图导入 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2012版》，选择S1作为参照图谱，进行多点校正、谱峰匹配，并生成对照图谱，进一步计算各批次供试品的相似度。
结果，20批鼻宁喷雾剂的HPLC指纹图谱（图1 S1～S20）经相似度软件匹配，共确认40个共有峰，并生成对照品图谱，（图1R）。将供试品溶液色谱图（图2 A）与一枝黄花、鹅不食草、辅料空白样品色谱图（图2 C、D、E）进行对比分析，7、23号峰来源于鹅不食草，1～4、6、8～10、12、14、16、18～21、24、31～40号峰来源于一枝黄花，5、11、13、15、18、22、25～30、号峰为鹅不食草和一枝黄花共有；通过与混合对照品色谱图（图2 B）对比分析，对供试品色谱图中3个色谱峰进行化学指认，分别为11号峰为绿原酸，22号峰为芦丁，28号峰为异绿原酸A。其中芦丁峰面积较大且稳定，选择22号峰（芦丁）作为参照峰，计算各批次样品共有峰的均值相对保留时间（Rt）和相对峰面积（RPA），结果分别见表1、2，相似度结果见表3。结果表明，20批鼻宁喷雾剂的相似度较高，达到0.955～0.996，说明样品质量较一致，符合指纹图谱相似度的要求。
Claims (1)
1.一种鼻宁喷雾剂指纹图谱的建立方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一，取将鼻宁喷雾剂供试品用0.22μm-0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；取绿原酸、芦丁和异绿原酸A对照品适量，精密称定，加50 v/v%甲醇制成每1 mL含绿原酸、芦丁和异绿原酸A分别为20～500μg的混合对照品溶液；
步骤二，对样品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录60min色图谱；
高效液相色谱条件如下：
色谱柱：Neptune C18柱250 mm×4.6 mm，5 μm；
检测器：二极管阵列检测器或紫外检测器；
流动相A和B分别为，乙腈和0 .2v/v％磷酸水溶液；
流动相进行梯度洗脱，洗脱程序以如下体积浓度配制进行：
0～15 min，10%～15% 流动相A，90%～85% 流动相B；
15～25 min，15%～20%流动相 A,85%～80% 流动相B；
25～55 min，20%～35%流动相 A，80%～65% 流动相 B；
55～65 min，35%～10% 流动相A，65%～90% 流动相B；
流速为1.0 ml/min；
柱温为25℃；
检测波长为326 nm；
步骤三，将步骤二得到的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，进行多点校正、谱峰匹配，并生成对照特征图谱，计算相似度，其指纹图谱特征峰为：11号峰绿原酸，22号峰芦丁和28号峰异绿原酸A，其保留时间分别为12.985±0.057 min、28.217±0.067 min、34.961±0.077 min；进一步，鼻宁喷雾剂指纹图谱还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、6号峰、7号峰、9号峰、10号峰、12号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、23号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、29号峰、30号峰、31号峰、32号峰、33号峰、34号峰、35号峰、36号峰、37号峰、38号峰、39号峰和40号峰，其保留时间分别为2.959±0.005 min、3.930±0.010 min、7.118±0.029 min、7.864±0.022 min、8.460±0.037 min、9.249±0.031 min、10.285±0.071 min、11.239±0.038 min、11.647±0.052 min、12.136±0.056 min、13.651±0.055 min、14.253±0.068 min、16.502±0.073 min、17.394±0.090 min、19.282±0.075 min、20.595±0.052 min、21.526±0.085min、23.484±0.079 min、25.363±0.044 min、27.188±0.044 min、29.071±0.084 min、30.130±0.071 min、31.561±0.086 min、32.302±0.054 min、33.321±0.069 min、37.431±0.064 min、41.223±0.100 min、43.668±0.088 min、44.677±0.059 min、46.375±0.066 min、48.314±0.068 min、49.947±0.067 min、51.109±0.049 min、53.819±0.073 min、55.165±0.059 min、57.886±0.070 min、58.223±0.052 min。
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