CN107328872A - 玄参药材hplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玄参药材HPLC指纹图谱的构建及其质量鉴定方法。该方法包括以下步骤：玄参药材粉末用50％～70％甲醇水溶液超声提取，微孔滤膜滤过作为供试品溶液。取批量供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到玄参HPLC标准指纹图谱，图谱中应呈现4个特征峰，以肉桂酸峰为S峰，相对保留时间的规定值分别为：0.40、0.81、0.92、1.00。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，在规定值的±7％范围之内。相对于现有技术，本发明可全面、准确快速监控玄参药材的质量。具有专属性强、稳定性高、重复性好等优点，尤其适合规模化生产的检测和监控。
Description
技术领域
本发明涉及玄参的HPLC指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
背景技术
现阶段的中药指纹图谱技术，具有成分明确、可量化的优点，用于鉴别中药材的真伪，评价中药材质量的优劣及监控中药材质量的稳定、均一，对全面、准确、有效地监控中药材质量具有重要意义。
玄参是玄参科植物玄参(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)的干燥根，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效。现有玄参HPLC鉴别方法多采用210nm 作为检测波长，检测哈巴苷和哈巴俄苷，本发明用HPLC法构建了玄参的指纹图谱，采用210和278nm切换检测哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷和肉桂酸四个主成分，可全面、快速地监控玄参的质量。
发明内容
本发明提供了一种玄参药材HPLC指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
该方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取玄参药材粉末0.5～5g，超声1次，每次加50％～70％甲醇水溶液10～100倍量，超声20～60min，补足重量，滤过，用 0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品、肉桂酸对照品适量，加30％甲醇溶解，制成每1ml含哈巴苷60μg、哈巴俄苷23μg、肉桂酸15μg的混合对照品溶液，即得。
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.03％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；0～10min，流动相A从3％到10％，流动相B从97％到90％；10～20min，流动相A从10％到33％，流动相B从90％到67％； 20～25min，流动相A从33％到50％，流动相B从67％到50％；25～30min，流动相A从50％到80％，流动相B从50％到20％；流速为1ml/min；检测波长为前15 分钟210nm，15分钟后切换波长为278nm。
(4)对照图谱的建立：按上述条件对10批以上玄参样品进行HPLC分析，得到相应图谱，将上述图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，匹配主要色谱峰，生成对照图谱，对照图谱包括哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷和肉桂酸四个特征峰。
(5)鉴别方法：将供试品图谱与对照图谱对比，以肉桂酸为参照峰，包括参照峰在内，所得供试品指纹图谱有4个共有特征峰，相对保留时间分别为0.40、 0.81、0.92、1.00，各特征峰与参照峰(S)的相对保留时间，应在规定值的± 7％范围之内。
相对于现有技术，本发明可较全面、准确快速监控玄参药材的质量。该方法具有专属性强、稳定性高、重复性好等优点，尤其适合规模化生产的检测和监控。
附图说明
图1是本发明的玄参标准指纹图谱，图中的数字表示各峰的保留时间(tR)；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本说明做进一步说明。
实施例
一、标准图谱构建
1.仪器：十万分之一电子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；数控超声波清洗器 (KQ250DE，昆山市超声仪器有限公司)；Ultimate 3000DGLC高效液相色谱仪 (美国Dionex公司，DGP—3600SD双三元泵、SRD—3600脱气机、WPS—3000SL 自动进样器、TCC3000—RS柱温箱、DAD检测器、Chromeleon6.8数据处理软件)； Agilent 1260高效液相色谱仪(G1311B四元泵、G1322A脱气机、G1316A柱温箱、 G1329B进样器、G1315D DAD检测器)；日本SHIMADZU公司超快速高效液相质谱仪(LC—20AD—XR二元泵，SIL—20AD—XR自动进样器，CTO—20A柱温箱，SPD —M20A PDA检测器，日本津岛公司)；四级杆—飞行时间质谱仪(Triple—TOF5600plus，美国AB SCIEX公司)；色谱柱：Elite Hypersil BDS C18(4.6 ×250mm，5μm，E2521673)、AgilentZorbax Eclipse Plus C18(4.6×250mm， 5μm，S.N.USUXA04769)、Welch Ultimate XB—C18(4.6×250mm，5μm， S.N.211503514)。
2.样品：哈巴苷对照品(中国食品药品检定研究所，111729—201506，规格：20mg/瓶)；哈巴俄苷对照品(中国食品药品检定研究所，111730—201307，规格：20mg/瓶)肉桂酸对照品(中国食品药品检定研究所，110786—200503，规格：100mg/瓶)。
3.试药：玄参10批，采集于浙江省，经鉴定为玄参(Scrophularia ningpoensisHemsl.)的根。
4.玄参药材HPLC指纹图谱的构建
4.1供试品溶液的制备：精密称取粉末0.5g，，加50％甲醇水溶液50ml超声30min，补足重量，滤过，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
4.2对照品溶液的制备：取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品、肉桂酸对照品适量，加30％甲醇溶解，制成每1ml含哈巴苷60μg、哈巴俄苷23μg、肉桂酸 15μg的混合对照品溶液，即得。
4.3色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以 0.03％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；流速为1ml/min；检测波长为前15分钟 210nm，15分钟后切换波长为278nm。
梯度洗脱方式：
4.4方法学考察
(1)精密度试验：取同一玄参供试品溶液(批号：XS—01)，制成供试品溶液，连续进样6次，计算各图谱的特征峰的相对保留时间(见表1)。结果表明，方法精密度良好。
表1精密度试验评价
(2)重复性试验：取同一批玄参样品(批号：XS—01)，平行制备6份供试品溶液进样测定，计算各图谱的特征峰的相对保留时间(见表2)。结果表明，方法的重复性良好。
表2重复性试验评价
(3)稳定性试验：取同一批玄参样品(批号：XS—01)，制成供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24、48h进样，计算各图谱的特征峰的相对保留时间(见表3)。结果表明，供试品溶液在48h内稳定性良好。
表3稳定性试验评价
、玄参样品检测结果
表4 10批玄参指纹图谱共有峰相对保留时间
5.共有峰的归属及特征峰的确定
通过对10批玄参以及玄参对照药材进行分析。有4个色谱峰能稳定重现，具有良好的相关性，故确立了4个共有峰。其中1号峰、3号峰、S号峰的保留时间及紫外光谱分别与参照物溶液中哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸对照品吻合，故供试品指纹图谱中1、3、S号峰分别鉴定为哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸。此外，采用液质联用法指认了1个共有峰(2号峰)，结果见表6。结果表明，2号峰确定为安格洛苷C。
表6 2号峰液质分析结果
对10批以上玄参样品进行HPLC分析，得到相应图谱，将上述图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，匹配主要色谱峰，生成标准指纹图谱(见图1)，对照图谱包括哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷和肉桂酸四个特征峰。
Claims (2)
1.一种玄参药材HPLC指纹图谱构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取玄参药材粉末0.5～5g，按料液比10：100，用50％～70％甲醇水溶液超声提取，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品、肉桂酸对照品适量，加30％甲醇溶解，制成每1ml含哈巴苷60μg、哈巴俄苷23μg、肉桂酸15μg的混合对照品溶液，即得；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.03％磷酸溶液为流动相B；梯度洗脱：0min-10min-20min-25min-30min，流动相A:3％-10％-33％-50％-80％；流速1ml/min；检测波长为前15分钟210nm，15分钟后切换波长为278nm；
(4)标准指纹图谱的建立：按以上方法对10批以上玄参样品进行HPLC分析，得到相应图谱，将上述图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，匹配主要色谱峰，生成标准指纹图谱，标准指纹图谱包括哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷和肉桂酸四个特征峰。
2.一种玄参药材的指纹图谱鉴定方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取玄参药材粉末0.5～5g，按料液比10：100，用50％～70％甲醇水溶液超声提取，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取哈巴苷对照品、哈巴俄苷对照品、肉桂酸对照品适量，加30％甲醇溶解，制成每1ml含哈巴苷60μg、哈巴俄苷23μg、肉桂酸15μg的混合对照品溶液，即得；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.03％磷酸溶液为流动相B；梯度洗脱：0min-10min-20min-25min-30min，流动相A:3％-10％-33％-50％-80％；流速1ml/min；检测波长为前15分钟210nm，15分钟后切换波长为278nm；
(4)将供试品图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，匹配主要色谱峰，生成供试品指纹图谱；
(5)鉴别：将供试品指纹图谱与权利要求1所述的标准指纹图谱对比，以肉桂酸为参照峰，包括参照峰在内，所得供试品指纹图谱有4个共有特征峰，相对保留时间分别为0.40、0.81、0.92、1.00，各特征峰与参照峰的相对保留时间，为规定值的±7％范围之内。
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