CN110441413B - 千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法 - Google Patents

千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110441413B
CN110441413B CN201910640370.4A CN201910640370A CN110441413B CN 110441413 B CN110441413 B CN 110441413B CN 201910640370 A CN201910640370 A CN 201910640370A CN 110441413 B CN110441413 B CN 110441413B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mobile phase
volume fraction
qianbai
increased
decreased
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910640370.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110441413A (zh
Inventor
梁一彪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Baiyunshan Qixing Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Baiyunshan Qixing Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Baiyunshan Qixing Pharmaceutical Co ltd filed Critical Guangzhou Baiyunshan Qixing Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN201910640370.4A priority Critical patent/CN110441413B/zh
Publication of CN110441413A publication Critical patent/CN110441413A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110441413B publication Critical patent/CN110441413B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/047—Standards external

Abstract

本发明涉及一种千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：混合对照品溶液的制备：于溶剂中加入金丝桃苷、对羟基肉桂酸、羌活醇、大黄酚、异欧前胡素、绿原酸、欧前胡素、穗花杉双黄酮、大黄素甲醚、大黄素、蛇床子素、咖啡酸和山柰素对照品，得混合对照品溶液；供试品溶液的制备：于体积分数为25％‑100％的甲醇中加入千柏鼻炎片样品进行提取，将提取液滤过后取续滤液，即为供试品溶液；将所述混合对照品溶液和所述供试品溶液分别注入到高效液相色谱仪中，测定，即得所述指纹图谱。所构建的指纹图谱能够全面反应千柏鼻炎片的质量信息，具有快捷、稳定、精密度高、重现性强等优点，能够用于千柏鼻炎片的质量控制。

Description

千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法和检测方法
技术领域
本发明涉及中药分析检测技术领域，特别是涉及千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法和检测方法。
背景技术
中药因其组分复杂，化学成分具有多样性和复杂性，一直是质量评价的重点与难点。目前，指纹图谱是国际公认的最适合用于控制中药或天然药物质量的手段之一，中药指纹图谱从中药物质基础角度出发，运用现代分析检测技术，能够系统地、整体地、专属地表征中药中所共有及内在的特征。《国家药品标准技术规范》中规定，中药指纹图谱指中药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱，目的在于反应中药多成分特点，整体控制中药质量，确保其内在质量的均一、稳定。近年来，由于色谱技术的迅速发展和检测能力的大大提高，为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证，中药指纹图谱对促进中药材的现代化发展和提高中药材质量具有重要意义。
千柏鼻炎片由千里光、卷柏、决明子、麻黄、羌活、白芷、川芎七味药按中成药片剂的常规工艺制成，具有清热解毒、活血祛风、宣肺通窍之功，用于风热犯肺、内郁化火、凝滞气血所致的鼻塞、鼻痒气热、流体黄稠，或持续鼻塞、嗅觉迟钝；急慢性鼻炎、急慢性鼻窦炎见上述证候者。本品的质量标准收载于中国药典第一部(2015版)。该标准中仅有千里光、决明子、麻黄、羌活的薄层色谱法的定性鉴别，高效液相色谱法对千里光主要成分金丝桃苷进行含量测定，而千柏鼻炎片为中药复方，所含的化学成分十分复杂，该标准难以全面反映产品的整体质量特征，无法从整体上控制产品的质量。
发明内容
基于此，本发明提供一种千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，所构建的指纹图谱能够全面反应千柏鼻炎片的质量信息，具有快捷、稳定、精密度高、重现性强等优点，能够用于千柏鼻炎片的质量控制。
具体技术方案为：
一种千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
混合对照品溶液的制备：于溶剂中加入金丝桃苷、对羟基肉桂酸、羌活醇、大黄酚、异欧前胡素、绿原酸、欧前胡素、穗花杉双黄酮、大黄素甲醚、大黄素、蛇床子素、咖啡酸和山柰素对照品，得混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：于体积分数为25％-100％的甲醇中加入千柏鼻炎片样品进行提取，将提取液滤过后取续滤液，即为供试品溶液；
将所述混合对照品溶液和所述供试品溶液分别注入到高效液相色谱仪中，测定，即得所述指纹图谱。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱的色谱条件包括：
以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％-0.2％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱具体为：
0-20min，所述流动相A的体积分数由5％升高到6％，所述流动相B的体积分数由95％降低到94％；
20min-38min，所述流动相A的体积分数由6％升高到12％，所述流动相B的体积分数由94％降低到88％；
38min-44min，所述流动相A的体积分数由12％升高到13％，所述流动相B的体积分数由88％降低到87％；
44min-60min，所述流动相A的体积分数由13％升高到20％，所述流动相B的体积分数由87％降低到80％；
60min-64min，所述流动相A的体积分数由20％升高到22％，所述流动相B的体积分数由80％降低到78％；
64min-80min，所述流动相A的体积分数由22％升高到30％，所述流动相B的体积分数由78％降低到70％；
80min-90min，所述流动相A的体积分数由30％升高到40％，所述流动相B的体积分数由70％降低到60％；
90min-102min，所述流动相A的体积分数由40％升高到42％，所述流动相B的体积分数由60％降低到58％；
102min-112min，所述流动相A的体积分数由42％升高到60％，所述流动相B的体积分数由58％降低到40％；
112min-122min，所述流动相A的体积分数由60％升高到90％，所述流动相B的体积分数由40％降低到10％。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱的色谱条件还包括：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.5ml/min-1.2ml/min，柱温25℃-35℃，检测波长190nm-400nm。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Agilent EC-C18(4μm，4.6×250mm)，柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：267nm；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述提取的方法为超声提取，所述提取的时间30min-2h。
在其中一个实施例中，每1ml所述混合对照品溶液含有：200±10μg金丝桃苷、100±10μg对羟基肉桂酸、60±10μg羌活醇、100±10μg大黄酚、60±10μg异欧前胡素、200±10μg绿原酸、40±10μg欧前胡素、100±10μg穗花杉双黄酮、80±10μg大黄素甲醚、80±10μg大黄素、150±10μg蛇床子素、100±10μg咖啡酸和80±10μg山柰素。
本发明还提供一种千柏鼻炎片的检测方法。
具体技术方案为：
一种千柏鼻炎片的检测方法，包括以下步骤：
待测样品溶液的制备：于体积分数为25％-100％的甲醇中加入待测千柏鼻炎片样品进行提取，将提取液滤过后取续滤液，即为供试品溶液；
将所述待测样品溶液注入高效液相色谱仪中，测定，即可。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱的色谱条件包括：
以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1％-0.2％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱具体为：
0-20min，所述流动相A的体积分数由5％升高到6％，所述流动相B的体积分数由95％降低到94％；
20min-38min，所述流动相A的体积分数由6％升高到12％，所述流动相B的体积分数由94％降低到88％；
38min-44min，所述流动相A的体积分数由12％升高到13％，所述流动相B的体积分数由88％降低到87％；
44min-60min，所述流动相A的体积分数由13％升高到20％，所述流动相B的体积分数由87％降低到80％；
60min-64min，所述流动相A的体积分数由20％升高到22％，所述流动相B的体积分数由80％降低到78％；
64min-80min，所述流动相A的体积分数由22％升高到30％，所述流动相B的体积分数由78％降低到70％；
80min-90min，所述流动相A的体积分数由30％升高到40％，所述流动相B的体积分数由70％降低到60％；
90min-102min，所述流动相A的体积分数由40％升高到42％，所述流动相B的体积分数由60％降低到58％；
102min-112min，所述流动相A的体积分数由42％升高到60％，所述流动相B的体积分数由58％降低到40％；
112min-122min，所述流动相A的体积分数由60％升高到90％，所述流动相B的体积分数由40％降低到10％。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱的色谱条件还包括：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.5ml/min-1.2ml/min，柱温25℃-35℃，检测波长190nm-400nm。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Agilent EC-C18(4μm，4.6×250mm)，柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：267nm；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述提取的方法为超声提取，所述提取的时间30min-2h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用高效液相色谱(HPLC)法，通过对比15批千柏鼻炎片指纹图谱，确定了17个共有峰，构建千柏鼻炎片标准指纹图谱，并利用对照品混合溶液对金丝桃苷、对羟基肉桂酸、羌活醇、大黄酚、异欧前胡素、绿原酸、欧前胡素、穗花杉双黄酮、大黄素甲醚、大黄素、蛇床子素、咖啡酸、山柰素这些共有峰进行了指认。所构建的标准指纹图谱能够全面反应千柏鼻炎片的质量信息，具有快捷、稳定、精密度高、重现性强等优点，避免了现有质量控制标准单一、片面的缺点，能够用于千柏鼻炎片的质量控制。
通过对供试品溶液制备方法的优化和对色谱条件的优化，使千柏鼻炎片的指纹图谱基线更加平稳，色谱峰分离度更好，色谱峰数目更多，杂峰更少，出峰时间更快，对上述测定条件进行方法学考察，该方法操作简单，精密度高，稳定性和重复性好，且信息量大。
采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对指纹图谱进行辨认，操作简便、快捷，以此得出的相似度结果对千柏鼻炎片指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
附图说明
图1为不同检测波长下的指纹图谱；
图2为不同进样温度下的指纹图谱；
图3为不同流动相系统下的指纹图谱；
图4为不同色谱柱下的指纹图谱；
图5为不同流速下的指纹图谱；
图6为不同提取溶剂下的指纹图谱；
图7为不同提取方法下的指纹图谱；
图8为不同提取时间下的指纹图谱；
图9为15批千柏鼻炎片的指纹图谱及对照HPLC指纹图谱；
图10为千柏鼻炎片标准指纹图谱；
图11为各原药材指纹图谱及千柏鼻炎片标准指纹图谱；
图12为混合对照品的指纹图谱，色谱峰从左到右分别为：绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、金丝桃苷、山柰素、穗花杉双黄酮、欧前胡素、羌活醇、大黄素、蛇床子素、异欧前胡素、大黄酚、大黄素甲醚；
图13为精密度考察的叠加指纹图谱；
图14为重复性考察的叠加指纹图谱；
图15为稳定性考察的叠加指纹图谱；
图16为待测样品的指纹图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法和检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建
1、仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪，ML204/02型分析天平。
2、试药：液相色谱分析试剂为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水，千柏鼻炎片由广州白云山奇星药业有限公司提供。
3、方法与结果
3.1混合对照品溶液：精密称取金丝桃苷、对羟基肉桂酸、羌活醇、大黄酚、异欧前胡素、绿原酸、欧前胡素、穗花杉双黄酮、大黄素甲醚、大黄素、蛇床子素、咖啡酸、山柰素对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液含有200μg金丝桃苷、100μg对羟基肉桂酸、60μg羌活醇、100μg大黄酚、60μg异欧前胡素、200μg绿原酸、40μg欧前胡素、100μg穗花杉双黄酮、80μg大黄素甲醚、80μg大黄素、150μg蛇床子素、100μg咖啡酸、80μg山柰素的混合对照品溶液，即得。
3.2供试品溶液的制备：取千柏鼻炎片，糖衣片除去包衣，研细，精密称定1.6g，精密加入25ml甲醇，称定重量，超声(功率250W，频率80kHz)提取60min，放冷，再称定重量，用上述甲醇溶剂补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
3.3色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent EC-C18(4μm，4.6×250mm)为色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。
梯度洗脱过程中，流动相A与流动相B的比例变化见表1。
表1
Figure BDA0002131645820000081
3.4色谱条件优化
3.4.1波长选择
参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，设置波长分别为267nm、278nm、284nm、320nm、337nm，考察波长对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图1所示。
由图1可知，供试品大部分成分在267nm处有较大吸收，基线较平稳，色谱峰分离较好，且回应良好，因此选择267nm作为优选的吸收波长。
3.4.2进样温度的考察
参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，设置进样温度分别为25℃、30℃、35℃，考察进样温度对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图2所示。
由图2可知，30℃时基线较平稳，色谱峰分离较好，出峰时间较快，且回应良好，因此选择30℃作为优选的吸收波长。
3.4.3流动相系统的选择
参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，设置流动相分别为乙腈-体积分数为0.1％的磷酸水溶液、乙腈-体积分数为0.2％磷酸水溶液、乙腈-体积分数为0.1％的冰醋酸水溶液、甲醇-体积分数为0.1％的磷酸水溶液、甲醇-体积分数为0.2％的磷酸水溶液、甲醇-体积分数为0.1％的冰醋酸水溶液、(甲醇：乙腈(1:1))-体积分数为0.1％的磷酸水溶液，考察进流动相体系对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图3所示。
结果显示，流动相系统为乙腈-体积分数为0.1％的磷酸水溶液时，基线相对平稳，色谱峰分离度较好，色谱峰数目较多，杂峰少，出峰时间较快，因此选择乙腈-体积分数为0.1％的磷酸水溶液为最终流动相。
3.4.4色谱柱的选择
参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，设置色谱柱分别为Agilent EC-C18(4μm，4.6×250mm)、Dikma Diamonsil C18(5μm，4.6×200mm)、依利特Kromasil C18(5μm，4.6×20mm)、Hichrom Alltima C18(5μm，4.6×250mm)，考察色谱柱对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图4所示。
结果显示，使用Agilent EC-C18(4μm，4.6×250mm)为色谱柱时基线较平稳，色谱峰分离较好，且回应良好，因此选择Agilent EC-C18(4μm，4.6×250mm)作为优选的色谱柱。
3.4.5流速的选择
参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，设置流速分别为0.5ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，考察流速对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图5所示。
结果显示，流速为1.0ml/min时，基线较平稳，出峰时间相对较快，杂峰少，色谱峰分离较好，且回应良好，从节约成本及保护色谱柱等角度综合考虑，选择1.0ml/min作为优选流速。
3.5供试品溶液制备方法的优化
3.5.1提取溶剂考察
参照3.2项下“供试品溶液的制备”，设置提取溶剂分别为体积分数为25％的甲醇水溶液、体积分数为50％的甲醇水溶液、体积分数为75％的甲醇水溶液、甲醇、乙醇，制得5份供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，考察不同提取溶剂对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图6所示。
结果显示，提取溶剂为甲醇时，基线较平稳，色谱峰数量较多，峰分离较好，因此选择甲醇作为优选的提取溶剂。
3.5.2提取方法的考察
参照3.2项下“供试品溶液的制备”，设置提取方法分别为超声(功率250W，频率80kHz)提取60min及85℃回流提取60min，制得2份供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，考察不同提取方法对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图7所示。
结果显示，超声提取时色谱峰相对分离度较好，杂峰较少，色谱峰回应较好，且回流提取操作过程较为繁琐，故选择超声(功率250W，频率80kHz)提取为优选的提取方法。
3.5.3提取时间的考察
参照3.2项下“供试品溶液的制备”，设置超声提取的时间分别为30min、60min、120min，制得3份供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，考察不同提取时间对千柏鼻炎片指纹图谱的影响，结果如图8所示。
结果显示，提取60min时各色谱峰峰形较好，分离度好，基线平稳，因此选择60min作为优选的提取时间。
3.6千柏鼻炎片HPLC指纹图谱共有模式的建立与相似度评价
3.6.1共有峰的标定
取批号分别为：18002、18003、18005、18010、18011、18012、18013、18014、18015、18016、18017、18021、19004、19005、19006共15批次的千柏鼻炎片(由广州白云山奇星药业有限公司提供)，参照3.2项下“供试品溶液的制备”，制得15份供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，得到15批次千柏鼻炎片的指纹图谱(S1-S15)，如图9所示。将数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行分析，以金丝桃苷峰(5号峰)为参照峰，经多点校正自动匹配后生成千柏鼻炎片的对照HPLC指纹图谱(R)。选择图谱中含量较大且分离度较好的色谱峰作为共有特征峰，结果共标定出17个共有峰，即为千柏鼻炎片标准指纹图谱。(图10)。
3.6.2相对保留时间和相对峰面积
计算所得千柏鼻炎片标准指纹图谱中各峰与参照峰(S峰，5号峰)色谱峰相对保留时间RRT及相对峰面积RPA，分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.518、相对峰面积RPA为0.410；2号峰相对保留时间RRT为0.541、相对峰面积RPA为0.396；3号峰相对保留时间RRT为0.744、相对峰面积RPA为1.133；4号峰相对保留时间RRT为0.981、相对峰面积RPA为0.381；5号峰相对保留时间RRT为1.000、相对峰面积RPA为1.000；6号峰相对保留时间RRT为1.021、相对峰面积RPA为0.338；7号峰相对保留时间RRT为1.434、相对峰面积RPA为0.240；8号峰相对保留时间RRT为1.511、相对峰面积RPA为0.168；9号峰相对保留时间RRT为1.632、相对峰面积RPA为0.216；10号峰相对保留时间RRT为1.825、相对峰面积RPA为0.476；11号峰相对保留时间RRT为1.960、相对峰面积RPA为0.100；12号峰相对保留时间RRT为1.971、相对峰面积RPA为0.112；13号峰相对保留时间RRT为1.982、相对峰面积RPA为0.102；14号峰相对保留时间RRT为2.002、相对峰面积RPA为0.097；15号峰相对保留时间RRT为2.037、相对峰面积RPA为0.535；16号峰相对保留时间RRT为2.096、相对峰面积RPA为0.049；17号峰相对保留时间RRT为2.140、相对峰面积RPA为0.050。
3.6.3相似度计算
将15批次千柏鼻炎片的指纹图谱数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件中，以千柏鼻炎片标准指纹图谱(R)为参照，计算15批次千柏鼻炎片指纹图谱的相似度，如表2所示。
结果显示，15批次千柏鼻炎片的指纹图谱与千柏鼻炎片标准指纹图谱的相似度均大于或等于0.93。
表2相似度评价结果
Figure BDA0002131645820000131
3.6.4主要色谱峰的药材来源
参照3.2项下“供试品溶液的制备”分别制备处方中千里光、卷柏、决明子、麻黄、羌活、白芷、川芎7味原药材的待测溶液，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测试，得到如图11所示的指纹图谱。由图11可知，千柏鼻炎片标准指纹图谱中的17个共有峰，在千里光、卷柏、决明子、麻黄、羌活、白芷、川芎7味原药材的指纹图谱中，基本找到明确归属，其中：1、4、5、6号峰归属为千里光药材，9、12、14、15号峰归属为卷柏药材，7、11、13、16、17号峰归属为决明子药材，11、12、13、15、16号峰归属为羌活药材，11、14、15号峰归属为白芷药材，1、2、8、9、13号峰归属为川芎药材。
3.6.5主要色谱峰的指认
精密吸取混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测试，得到混合对照品的指纹图谱，如图12所示。通过与对照品保留时间，紫外吸收光谱进行比对，鉴定了千柏鼻炎片标准指纹图谱的17个共有峰。其中第1号峰为绿原酸峰、第2号峰为咖啡酸峰、第3号峰为对羟基肉桂酸峰、第5号峰为金丝桃苷峰、第8号峰为山柰素峰、第9号峰为穗花杉双黄酮峰、第11号峰为欧前胡素峰、第12号峰为羌活醇峰、第13号峰为大黄素峰、第14号峰为蛇床子素峰、第15号峰为异欧前胡素峰、第16号峰为大黄酚峰、第17号峰为大黄素甲醚峰。
3.7方法学考察
3.7.1精密度考察
取同一批供试品(批号：18012，由广州白云山奇星药业有限公司提供)，参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”连续精密进样6次，记录色谱图，如图13所示。以金丝桃苷峰(5号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积，计算结果如表3-4。利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”评价相似度，计算结果如表5。
结果表明：各共有峰的相对保留时间RSD小于1.0％，相对峰面积RSD小于5.0％，相似度均大于或等于0.99，说明仪器的精密度好。
表3精密度试验-主要色谱峰相对保留时间比值
Figure BDA0002131645820000141
Figure BDA0002131645820000151
表4精密度试验-主要色谱峰相对峰面积比值
Figure BDA0002131645820000152
Figure BDA0002131645820000161
表5精密度试验-相似度计算结果
Figure BDA0002131645820000162
3.7.2重复性考察
取同一批供试品(批号：18012，由广州白云山奇星药业有限公司提供)，参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备6份供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，记录色谱图，如图14所示。以金丝桃苷峰(5号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积，计算结果如表6-7。利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”评价相似度，计算结果如表8。
结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD小于1.0％，相对峰面积RSD小于5.0％，相似度均大于或等于0.99，说明该实验方法的重复性好。
表6重复性实验-主要色谱峰相对保留时间比值
Figure BDA0002131645820000163
表7重复性实验-主要色谱峰相对峰面积比值
Figure BDA0002131645820000171
表8重复性实验-相似度计算结果
Figure BDA0002131645820000172
3.7.3稳定性考察
取同一批供试品(批号：18012，由广州白云山奇星药业有限公司提供)，参照3.2项下“供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h注入液相色谱仪，参照3.3项下“色谱条件”进样测定，记录色谱图，如图15所示。以金丝桃苷峰(5号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积，计算结果如表9-10。利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”评价相似度，计算结果如表11。
结果表明：各共有峰的相对保留时间RSD小于1.0％，相对峰面积RSD小于5.0％，相似度均大于或等于0.99，说明供试品溶液的成分在24h内稳定。
表9稳定性试验-主要色谱峰相对保留时间比值
Figure BDA0002131645820000181
表10稳定性试验-主要色谱峰相对峰面积比值
Figure BDA0002131645820000182
表11稳定性试验-相似度计算结果
Figure BDA0002131645820000183
Figure BDA0002131645820000191
实施例2
本实施例提供一种千柏鼻炎片的检测方法，步骤如下：
待测样品的制备：取待测千柏鼻炎片(批号为：18001、18020、19007、19008、19009，由广州白云山奇星药业有限公司提供)，糖衣片除去包衣，研细，精密称定1.6g，精密加入25ml甲醇，称定重量，超声(功率250W，频率80kHz)提取60min，放冷，再称定重量，用上述甲醇溶剂补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：参照实施例1的3.3项下的“色谱条件”。
精密吸取待测样品溶液10μl，注入超高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进样测定，得到如图16所示色谱图。
将批号为：18001、18020、19007、19008、19009的千柏鼻炎片的指纹图谱数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件中，与千柏鼻炎片标准指纹图谱(R)进行对比，并计算这五个批次千柏鼻炎片指纹图谱的相似度，如表12所示。
结果显示，批号为：18001、18020、19007、19008、19009的千柏鼻炎片的指纹图谱与千柏鼻炎片标准指纹图谱的相似度均大于或等于0.92。可知，该五个批次的千柏鼻炎片质量稳定。
表12待测千柏鼻炎片相似度计算结果
Figure BDA0002131645820000192
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
混合对照品溶液的制备：于溶剂中加入金丝桃苷、对羟基肉桂酸、羌活醇、大黄酚、异欧前胡素、绿原酸、欧前胡素、穗花杉双黄酮、大黄素甲醚、大黄素、蛇床子素、咖啡酸和山柰素对照品，得混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：于体积分数为25%-100%的甲醇中加入千柏鼻炎片样品进行提取，将提取液滤过后取续滤液，即为供试品溶液；
将所述混合对照品溶液和所述供试品溶液分别注入到高效液相色谱仪中，测定，即得所述指纹图谱；
所述高效液相色谱仪的色谱条件包括：
以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1%-0.2%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱具体为：
0-20min，所述流动相A的体积分数由5%升高到6%，所述流动相B的体积分数由95%降低到94%；
20min-38min，所述流动相A的体积分数由6%升高到12%，所述流动相B的体积分数由94%降低到88%；
38min-44min，所述流动相A的体积分数由12%升高到13%，所述流动相B的体积分数由88%降低到87%；
44min-60min，所述流动相A的体积分数由13%升高到20%，所述流动相B的体积分数由87%降低到80%；
60min-64min，所述流动相A的体积分数由20%升高到22%，所述流动相B的体积分数由80%降低到78%；
64min-80min，所述流动相A的体积分数由22%升高到30%，所述流动相B的体积分数由78%降低到70%；
80min-90min，所述流动相A的体积分数由30%升高到40%，所述流动相B的体积分数由70%降低到60%；
90min-102min，所述流动相A的体积分数由40%升高到42%，所述流动相B的体积分数由60%降低到58%；
102min-112min，所述流动相A的体积分数由42%升高到60%，所述流动相B的体积分数由58%降低到40%；
112min-122min，所述流动相A的体积分数由60%升高到90%，所述流动相B的体积分数由40%降低到10%。
2.根据权利要求1所述的千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述流动相B为体积分数为0.1%的磷酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱条件还包括：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.5ml/min-1.2ml/min，柱温25℃-35℃，检测波长190nm -400nm。
4.根据权利要求3所述的千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，所述流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长267nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述提取的方法为超声提取，所述提取的时间30min-2h。
6.根据权利要求1所述的千柏鼻炎片HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，每1ml所述混合对照品溶液含有：200±10μg金丝桃苷、100±10μg对羟基肉桂酸、60±10μg羌活醇、100±10μg大黄酚、60±10μg异欧前胡素、200±10μg绿原酸、40±10μg欧前胡素、100±10μg穗花杉双黄酮、80±10μg大黄素甲醚、80±10μg大黄素、150±10μg蛇床子素、100±10μg咖啡酸和80±10μg山柰素。
7.一种千柏鼻炎片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
待测样品溶液的制备：于体积分数为25%-100%的甲醇中加入待测千柏鼻炎片样品进行提取，将提取液滤过后取续滤液，即为待测样品溶液；
将所述待测样品溶液注入高效液相色谱仪中，测定，即可；
所述高效液相色谱的色谱条件包括：
以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1%-0.2%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱具体为：
0-20min，所述流动相A的体积分数由5%升高到6%，所述流动相B的体积分数由95%降低到94%；
20min-38min，所述流动相A的体积分数由6%升高到12%，所述流动相B的体积分数由94%降低到88%；
38min-44min，所述流动相A的体积分数由12%升高到13%，所述流动相B的体积分数由88%降低到87%；
44min-60min，所述流动相A的体积分数由13%升高到20%，所述流动相B的体积分数由87%降低到80%；
60min-64min，所述流动相A的体积分数由20%升高到22%，所述流动相B的体积分数由80%降低到78%；
64min-80min，所述流动相A的体积分数由22%升高到30%，所述流动相B的体积分数由78%降低到70%；
80min-90min，所述流动相A的体积分数由30%升高到40%，所述流动相B的体积分数由70%降低到60%；
90min-102min，所述流动相A的体积分数由40%升高到42%，所述流动相B的体积分数由60%降低到58%；
102min-112min，所述流动相A的体积分数由42%升高到60%，所述流动相B的体积分数由58%降低到40%；
112min-122min，所述流动相A的体积分数由60%升高到90%，所述流动相B的体积分数由40%降低到10%。
8.根据权利要求7所述的千柏鼻炎片的检测方法，其特征在于，所述流动相B为体积分数为0.1%的磷酸水溶液。
9.根据权利要求7所述的千柏鼻炎片的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱条件还包括：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.5ml/min-1.2ml/min，柱温25℃-35℃，检测波长190nm -400nm。
10.根据权利要求9所述的千柏鼻炎片的检测方法，其特征在于，所述流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长267nm。
11.根据权利要求7-10任一项所述的千柏鼻炎片的检测方法，其特征在于，所述提取的方法为超声提取，所述提取的时间30min-2h。
CN201910640370.4A 2019-07-16 2019-07-16 千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法 Active CN110441413B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910640370.4A CN110441413B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910640370.4A CN110441413B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110441413A CN110441413A (zh) 2019-11-12
CN110441413B true CN110441413B (zh) 2022-03-29

Family

ID=68430355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910640370.4A Active CN110441413B (zh) 2019-07-16 2019-07-16 千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110441413B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111337605B (zh) * 2020-05-19 2020-10-16 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种评价荷花蜂花粉真实性的方法
CN114544833B (zh) * 2022-02-28 2024-04-05 辽宁中医药大学 鼻渊通窍颗粒多息药效预测特征图谱构建方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101181343A (zh) * 2007-11-19 2008-05-21 广州奇星药业有限公司 一种千柏鼻炎片的质量控制方法
CN107688067A (zh) * 2017-09-28 2018-02-13 株洲千金药业股份有限公司 通窍鼻炎片的含量测定方法
CN107764903A (zh) * 2016-08-16 2018-03-06 江苏康缘药业股份有限公司 过敏性鼻炎颗粒有效成分的测定方法
CN107843657A (zh) * 2017-09-28 2018-03-27 株洲千金药业股份有限公司 通窍鼻炎片的质量检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101181343A (zh) * 2007-11-19 2008-05-21 广州奇星药业有限公司 一种千柏鼻炎片的质量控制方法
CN107764903A (zh) * 2016-08-16 2018-03-06 江苏康缘药业股份有限公司 过敏性鼻炎颗粒有效成分的测定方法
CN107688067A (zh) * 2017-09-28 2018-02-13 株洲千金药业股份有限公司 通窍鼻炎片的含量测定方法
CN107843657A (zh) * 2017-09-28 2018-03-27 株洲千金药业股份有限公司 通窍鼻炎片的质量检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110441413A (zh) 2019-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110907553B (zh) 一种温经汤指纹图谱检测方法
CN105738546B (zh) 毛郁金药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN107860832B (zh) 复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法
CN109633037A (zh) 安宫牛黄丸的uplc指纹图谱构建方法和检测方法
CN103245733B (zh) 一种藿香正气滴丸鉴定方法
CN107328872A (zh) 玄参药材hplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱
CN106442789A (zh) 复方血脂宁提取物指纹图谱的建立及其活性成分定量分析方法
CN110441413B (zh) 千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法
CN107402265B (zh) 康媛颗粒指纹图谱的检测方法
CN104062374B (zh) 益气补肾的中药组合物的检测方法
CN104316613A (zh) 一种疏风解毒胶囊指纹图谱的建立方法
CN107643343B (zh) 一种玉女煎标准汤的hplc指纹图谱测定方法
CN107782811B (zh) 一种芪苓健肾片指纹图谱的检测方法
CN109709222B (zh) 一种感冒灵和复方感冒灵的成分检测方法
CN109142563B (zh) 一种龟龄集uplc指纹图谱的构建方法及其应用
CN114994220B (zh) 一种七清败毒颗粒的指纹图谱的构建方法和其成分含量的测定方法及应用
CN103969355A (zh) 一种黄芪药材的指纹图谱的鉴别方法
CN103969356B (zh) 一种丹参药材的指纹图谱的鉴别方法
CN103175910A (zh) 一种甘草及其制剂的质量控制方法
CN110274970A (zh) 融差指纹图谱的建立方法及其在益血生胶囊质控中的应用
CN113189248B (zh) 银花泌炎灵片的hplc指纹图谱构建和检测方法
CN105004833A (zh) 一种治疗急性痛风性关节炎、痛风的中药制剂的检测方法
CN110632198B (zh) 一种消炎止咳片的hplc指纹图谱及其构建方法和应用
CN110455948B (zh) 一种头痛宁胶囊指纹图谱检测方法
CN107389827A (zh) 益母草或其复方制剂中盐酸水苏碱含量的测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Liang Yibiao

Inventor after: Zhang Chunbo

Inventor after: Su Biru

Inventor after: Ning Na

Inventor after: Fu Baoxiang

Inventor after: Peng Zhongfang

Inventor after: Peng Danting

Inventor before: Liang Yibiao

Inventor before: Zhang Chunbo

Inventor before: Su Biru

Inventor before: Ning Na

Inventor before: Peng Danting

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant