CN110907553B - 一种温经汤指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种温经汤指纹图谱检测方法，所述方法，步骤如下：1)供试品溶液的配制：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1‑2g，人参、甘草、牛膝粉末各3‑4g，加水250‑350mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至150‑170mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至240‑260mL；精密吸取温经汤标准汤剂8‑12mL，加甲醇定容至40‑60mL，密闭，称质量，超声处理8‑12min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；2)检测：取上步得到的供试品溶液5‑15μL，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；3)结果判断：上步得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行对照，相似度大于90％即为样品合格。

Description

一种温经汤指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种药用制剂的检测方法，具体涉及一种传统中药温经汤指纹图谱检测方法。
背景技术
月经不调、痛经、崩漏等是妇科多发病，不仅给患者带来极大痛苦，也给家庭和社会造成负担。温经汤是中医调经止痛的经典名方，出自南宋名医陈自明的《妇人大全良方》，现收录于《古代经典名方目录》，由当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草、牛膝组成，具有温经散寒、活血调经的功效，主要用于月经后期或过少、闭经、痛经等。
温经汤作为一种中药复方制剂，处方药材较多(由9味药材组成)，成分非常复杂多样。现有文献中仅有记载通过HPLC法对温经汤进行若干种成分的含量测定，但单纯通过检测几种指标成分定量来控制其药品质量显然是不全面的，也不能体现中药复方制剂的整体性特征。因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映温经汤所含多成分的指纹图谱检测方法对于其质量控制和评价非常必要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种温经汤指纹图谱检测方法。本发明通过对温经汤指纹图谱的研究，提供了一种操作简便、稳定、精密度高和重现性好，可用于温经汤的质量检测和评价的方法，弥补了现有质量控制方法的不足，使温经汤的质量控制技术更为完善、科学。
本发明的检测方法，步骤如下：
1)供试品溶液的配制：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1-2g，人参、甘草、牛膝粉末各3-4g，加水250-350mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至150-170mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至240-260mL；精密吸取温经汤标准汤剂8-12mL，加甲醇定容至40-60mL，密闭，称质量，超声(功率：180-220W，频率：40-60kHz)处理8-12min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)检测：取上步得到的供试品溶液5-15μL，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
3)结果判断：上步得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行对照，相似度大于90％即为样品合格；
优选的，本发明的方法，步骤如下：
1)供试品溶液的配制：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL；精密吸取温经汤标准汤剂10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，超声(功率：200W，频率：50kHz)处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)检测：取上步得到的供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
3)结果判断：上步得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行对照，相似度大于90％即为样品合格；
其中，检测步骤所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为Phenomenext Luna C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相为甲醇(A)，0.05％甲酸水溶液(B)，
梯度洗脱：
0～15min，10％～20％A；
15～30min，20％～35％A；
30～60min，35％～55％A；
60～75min，55％～65％A；
75～85min，65％～90％A；
85～95min，95％～10％A；
95～100min，10％A；
检测波长为:0～30min,240nm；30～38min,203nm；38～50min,320nm；50～58min,203nm；58～68min,280nm；68～100min,220nm。
进样量为：10μL；
体积流量为：0.9mL/min；
柱温为：30℃。
其中，结果判断步骤所述标准对照指纹图谱的建立方法，步骤如下：
1)对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、吉马酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草苷、甘草酸铵、β-蜕皮甾酮对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为129.5、89.2、321.4、58.7、232.6、117.9、235.6、124.8、136.2、259.3、285.6μg/mL的混合对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL，精密吸取温经汤标准汤剂10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，超声(功率：200W，频率：50kHz)处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别以同样方法制备10批次以上，取出10批次以上采用现有技术方法检测为合格的供试品溶液，作为标准对照指纹图谱制备的供试品溶液；
3)各单味药材溶液的制备：分别称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，分别加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL，再分别精密吸取各溶液10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，超声(功率：200W，频率：50kHz)处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各单味药材供试品溶液；
4)标准对照指纹图谱的确定：取以上步骤得到的对照品溶液，供试品溶液，各单味药材溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；将所得色谱图输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，经过筛选，以5号峰作参照峰，得到标准对照指纹图谱。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器与试药
1.1仪器Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；XS205DU电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；SCQ-2211A数控超声波清洗机型数控超声波清洗机(上海声彦超声波仪器有限公司)；DK-98-11A电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。
1.2试药对照品阿魏酸、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、吉马酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草苷、甘草酸铵、β-蜕皮甾酮购自中国食品药品检定研究院；色谱级甲醇、甲酸色谱纯(德国Merck)；分析级甲醇、乙醇(广州化学试剂厂)；其他试剂均为分析纯,水为超纯水。
当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草、牛膝均购于山东省药材公司。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱为Phenomenext Luna C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇(A)，0.05％甲酸水溶液(B)，
梯度洗脱：
0～15min，10％～20％A；
15～30min，20％～35％A；
30～60min，35％～55％A；
60～75min，55％～65％A；
75～85min，65％～90％A；
85～95min，95％～10％A；
95～100min，10％A；
检测波长为:0～30min,240nm；30～38min,203nm；38～50min,320nm；50～58min,203nm；58～68min,280nm；68～100min,220nm。
进样量为10μL；体积流量为0.9mL/min；柱温为30℃。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、吉马酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草苷、甘草酸铵、β-蜕皮甾酮对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为129.5、89.2、321.4、58.7、232.6、117.9、235.6、124.8、136.2、259.3、285.6μg/mL的混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备：温经汤标准汤剂参考《妇人大全良方》中记载的温经汤的制法，先将方中各单味药材粉碎为粗粉，然后称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL，即得。分别以同样方法制备10批次标准汤剂(S1-S10)。
精密吸取温经汤标准汤剂10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，超声(功率：200W，频率：50kHz)处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3各单味药材溶液的制备：取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术、人参、甘草、牛膝等9味药材，分别按处方比例精密称定质量，置50mL量瓶中，按“2.2.2”项下方法制备各单味药材供试品溶液。
2.3方法学考察
2.3.1精密度试验
精密吸取同一供试品溶液(S1)，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以5号峰为参照，计算得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.82％，相对峰面积的RSD均小于2.79％，表明仪器精密度良好。
2.3.2稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液(S1)，按“2.1”项下色谱条件分别于0、3、6、12、18、24h进样，以5号峰为参照，计算得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.83％，相对峰面积的RSD均小于1.69％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.3.3重复性试验
精密称定6份温经汤标准汤剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，以5号峰为参照，计算得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.75％，相对峰面积RSD均小于1.94％，表明方法重复性良好。
2.4指纹图谱的建立
2.4.1共有峰的确定
取10批温经汤标准汤剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对10批图谱进行分析，选择分离度较好且含量较大的26个色谱峰作为指纹图谱共有特征峰。
2.4.2相似度评价
分别在“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2012版)中导入10批成品的指纹图谱，生成10批指纹图谱共有模式图(图1)，并计算相似度，结果见表1，结果表明10批成品指纹图谱的相似度均在0.95以上，说明不同批次的药材成分基本一致，该制备工艺下制备的10批温经汤标准汤剂质量稳定。在供试品色谱峰中5号峰峰面积和出峰时间适中，分离度良好，故选作参照峰。以5号峰为基准，计算10批温经汤标准汤剂指纹图谱共有峰相对保留时间与相对峰面积，26个共有峰相对保留时间的RSD均小于2％，表明共有峰的出峰时间较稳定，相对峰面积的RSD相差较大，表明不同批次药材中的成分含量存在一定的差异。
2.5色谱峰指认及谱峰归属研究
2.5.1色谱峰指认
将混合对照品的色谱图与温经汤标准汤剂的指纹图谱叠加，对比二者的保留时间，可指认指纹图谱中3、4、5、8、9、10、19、21、22、23、25号峰分别为芍药苷、β-蜕皮甾酮、甘草苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、阿魏酸、人参皂苷Rb1、桂皮醛、丹皮酚、吉马酮、甘草酸铵。见图2。
2.5.2共有峰与药材的相关性研究
将2.2.3项下制备的各单味药材溶液的图谱与标准汤剂指纹图谱进行叠加(图3)，可见各药材的色谱峰与成品图谱共有峰相对应，表明药材与标准汤剂的化学成分信息有良好的相关性和一致性。再将标准汤剂指纹图谱的共有峰追溯到各单味药材，发现1号峰为川芎、人参、甘草的共有峰，2、4号峰为牛膝药材的专属峰；3、14号峰为白芍的专属峰；5、6、15、24、25号峰为甘草的专属峰；7、12号峰为当归的专属峰；8、9、11、16、17、18、19号峰为人参的专属峰；10号峰为当归、川芎的共有峰，13、20、23号峰为莪术的专属峰；21号峰为肉桂的专属峰；22、26号峰为牡丹皮的专属峰。可见，温经汤口服液组成药材的主要成分均在本专利技术得到的指纹图谱中得到了整体表征。
表1 10批温经汤样品相似度评价结果
Figure BDA0002307749680000071
需要说明的是，本发明的指纹图谱的构建方法是经过科学实验而筛选得到的，并非是本领域的常规选择，本发明主要对供试品溶液的制备方法，色谱条件，检测波长和分析时间等条件进行了优选。
其中：1)供试品溶液配制方法的考察：试验比较了不同提取溶剂如丙酮、乙醇、甲醇的水浴回流和索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，结果以甲醇超声提取的总体效果为佳。同时还考察了以甲醇为提取溶剂，不同提取时间(5,10，20min)的提取效果。结果表明，超声提取10min，提取较完全，操作方法简便，且方法稳定、重现性好。采用甲醇超声提取样品，所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。
2)色谱条件的选择及优化：在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、甲醇--0.02％磷酸水、甲醇--0.05％磷酸水、甲醇--0.1％磷酸水、甲醇-0.05％甲酸水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-0.05％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.3％磷酸水等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验。请见下表：(请将各种流动相的检测结果列于下表，以便真实客观的反应实验的结果)
表2
Figure BDA0002307749680000081
Figure BDA0002307749680000091
结果表明，用甲醇--0.05％甲酸水进行梯度洗脱为佳。
色谱峰检测比较全面，基线平稳，峰形对称，分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。
3)检测波长的选择：采用光电二极管阵列检测器(PDAD)在190～400nm波长范围内对11种待检成分进行光谱扫描，结果阿魏酸、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、吉马酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草苷、甘草酸铵、β-蜕皮甾酮的最大吸收波长分别为320、230、290、274、215、203、203、205、237、249、254nm。再结合液相色谱图，最终将波长设定为0～30min,240nm；30～38min,203nm；38～50min,320nm；50～58min,203nm；58～68min,280nm；68～100min,220nm。
4)分析时间的选择：在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了1.5h的色谱图。结果表明90min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择100min作为分析时间。
5)柱温的选择：试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对指纹图谱检测结果的影响。结果显示柱温为30℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为30℃。
6)流速的选择：试验了四个流速(0.8ml/min,0.9ml/min,1.0ml/min,1.2ml/min)对指纹图谱检测结果的影响。结果表明：流速为0.9ml/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.9ml/min。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用甲醇-甲酸水溶液系统，采用梯度洗脱的方法建立了温经汤的指纹图谱，该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大。
(2)由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息，因此，本发明选择多波长切换法进行测定，其出峰较多，反映的信息更为完全，各个峰吸收值良好，基线平稳。
(3)本发明采用指纹图谱作为温经汤口服液的质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学评价温经汤的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
附图说明
图1为10批次温经汤HPLC指纹图谱；
图2为混合对照品指纹图谱。
1.芍药苷 2.β-蜕皮甾酮 3.甘草苷 4.人参皂苷Rg1 5.人参皂苷Re 6.阿魏酸 7.人参皂苷Rb1 8.桂皮醛 9.丹皮酚 10.吉马酮 11.甘草酸铵
图3为对照药材与样品指纹图谱。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1、温经汤标准汤剂混合对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、吉马酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草苷、甘草酸铵、β-蜕皮甾酮对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为129.5、89.2、321.4、58.7、232.6、117.9、235.6、124.8、136.2、259.3、285.6μg/mL的混合对照品溶液；
2、温经汤标准汤剂供试品溶液的制备：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL，精密吸取温经汤标准汤剂10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，超声(功率：200W，频率：50kHz)处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别以同样方法制备10批次以上，取出10批次以上采用现有技术方法检测为合格的供试品溶液，作为标准对照指纹图谱制备的供试品溶液；
3、各单味药材溶液的制备：分别称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，分别加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL，再分别精密吸取各溶液10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，超声(功率：200W，频率：50kHz)处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各单味药材供试品溶液；
4、取以上步骤得到的对照品溶液，供试品溶液，各单味药材溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按照如下色谱条件进行分析：
色谱柱为Phenomenext Luna C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相为甲醇(A)，0.05％甲酸水溶液(B)，
梯度洗脱：
0～15min，10％～20％A；
15～30min，20％～35％A；
30～60min，35％～55％A；
60～75min，55％～65％A；
75～85min，65％～90％A；
85～95min，95％～10％A；
95～100min，10％A；
检测波长为:0～30min,240nm；30～38min,203nm；38～50min,320nm；50～58min,203nm；58～68min,280nm；68～100min,220nm。
进样量为：10μL；
体积流量为：0.9mL/min；
柱温为：30℃。
将所得色谱图输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到标准对照指纹图谱。
5、温经汤标准汤剂供试品溶液的配制：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL；精密吸取温经汤标准汤剂10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，超声(功率：200W，频率：50kHz)处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
6、取步骤5得到的供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按照步骤4中相同色谱条件进行分析，得到色谱图；
7、将步骤6得到的色谱图和步骤4得到的标准对照指纹图谱输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行对照，相似度大于90％即为样品合格。

Claims (1)

1.一种温经汤指纹图谱检测方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
1)待测品溶液的配制：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL；精密吸取温经汤标准汤剂10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，功率200W，频率50kHz超声处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)检测：取上步得到的待测品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
3)结果判断：上步得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行对照，相似度大于90％即为样品合格；
其中，检测步骤所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱为250mm×4.6mm，5μm，Phenomenext Luna C18柱；
流动相A为甲醇，B为0.05％的甲酸水溶液，梯度洗脱：
0～15min，10％～20％A；
15～30min，20％～35％A；
30～60min，35％～55％A；
60～75min，55％～65％A；
75～85min，65％～90％A；
85～95min，95％～10％A；
95～100min，10％A；
检测波长为:0～30min,240nm；30～38min,203nm；38～50min,320nm；50～58min,203nm；58～68min,280nm；68～100min,220nm；
进样量为：10μL；
体积流量为：0.9mL/min；
柱温为：30℃；
其中结果判断步骤所述标准对照指纹图谱的建立方法，步骤如下：
1)对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、吉马酮、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草苷、甘草酸铵、β-蜕皮甾酮对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为129.5、89.2、321.4、58.7、232.6、117.9、235.6、124.8、136.2、259.3、285.6μg/mL的混合对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL，精密吸取温经汤标准汤剂10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，功率200W，频率50kHz超声处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；分别以同样方法制备10批次以上，取出10批次以上供试品溶液，作为标准对照指纹图谱制备的供试品溶液；
3)各单味药材溶液的制备：分别称取当归、川芎、白芍、肉桂、牡丹皮、莪术粉末各1.67g，人参、甘草、牛膝粉末各3.33g，分别加水300mL，混匀，先用武火加热至沸，然后改用文火慢煎，待煎煮液至160mL左右，趁热滤过，滤液加水定容至250mL，再分别精密吸取各溶液10mL，加甲醇定容至50mL，密闭，称质量，功率200W，频率50kHz超声处理10min，放置过夜，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各单味药材供试品溶液；
4)标准对照指纹图谱的确定：取以上步骤得到的对照品溶液，供试品溶液，各单味药材溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；将所得色谱图输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，经过筛选，以5号峰甘草苷作参照峰，得到标准对照指纹图谱。
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