CN113390985B - 一种麻黄汤物质基准及其制备方法和质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中草药质量控制领域,具体涉及一种麻黄汤物质基准及其制备方法和质量检测方法。本发明提供的麻黄汤物质基准的制备方法,将制备冻干粉改为制备标准汤剂,无需浓缩、干燥等操作,避免了一些重要成分(如桂皮醛)的挥发;基于该方法所制备的麻黄汤物质基准,能够还原古方麻黄汤“一碗汤”的原汁原味,可用于指导实际工业生产。本发明提供的对麻黄汤物质基准的质量检测方法,将对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的定量测定与对甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸的定性分析融合,同时开发出新的色谱条件,分离度更好,稳定性更优,检测时间短、效率高。
Description
技术领域
本发明属于中草药质量控制领域,具体涉及一种麻黄汤物质基准及其制备方法和质量检测方法。
背景技术
经典名方因疗效确切,目前仍在广泛应用。为支持经典名方的开发,国家药品监督管理局2018年5月发布《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》指出,经典名方制剂的研制分“经典名方物质基准”研制与制剂研制两个阶段,申请人应当按照古代经典名方目录公布的处方、制法研制“经典名方物质基准”,并根据“经典名方物质基准”开展经典名方制剂的研究,证明经典名方制剂的关键质量属性与“经典名方物质基准”确定的关键质量属性一致。
麻黄汤,出自张仲景所著《伤寒论》,是国家中医药管理局2018年4月发布的《古代经典名方目录(第一批)》中的第四首,功能发汗解表,宣肺平喘,主治外感风寒表实证。麻黄汤组方中有效成分复杂,若采用规模化生产,其关键质量属性很难保证与传统汤剂的关键质量属性一致,故在实际应用时,只能采用传统中药煎煮方式服用。
麻黄汤物质基准的制备需遵循传统处方的组成、煎药方法,制备流程标准化和规范化,进而保证其质量的稳定性,后期麻黄汤制剂工艺的确定及标准制定依据皆来自其“物质基准”的研究,因此,麻黄汤物质基准的构建具有极其重要的实际应用价值。目前对麻黄汤物质基准的研究尚处于摸索之中,虽提出了一些新的制备方法,但仍存在诸多问题,如在制备麻黄汤物质基准过程中,因某些重要成分丢失而无法完全反映麻黄汤剂的关键质量属性;又如,麻黄汤物质基准的质量检测方法效率低、稳定性差,尚无较为全面的、系统的质量评价体系。
有鉴于此,有必要开发一种新的麻黄汤物质基准及其制备方法和质量检测方法。
发明内容
发明要解决的问题
为解决上述存在的技术问题,本发明提供一种新的麻黄汤物质基准的制备方法,该制备方法能够还原传统工艺,以确保麻黄汤物质基准与传统汤剂的一致性。
本发明还提供了根据上述制备方法所制备的麻黄汤物质基准,可更好地指导实际工业生产,体现经典名方物质基准的价值。
本发明还提供了上述麻黄汤物质基准的质量检测方法,其稳定性和检测效率均更高。
用于解决问题的方案
本发明提供一种麻黄汤物质基准的制备方法,包括以下步骤:
称取麻黄41.4重量份,加入水1800体积份,将电陶炉加热功率调至1500~2100W至煮沸,再调至500~700W煎煮20~30min,除去浮沫,然后加入桂枝27.6重量份、燀苦杏仁27.6重量份和炙甘草13.8重量份,在500~700W下继续煎煮30~60min,过滤,所得滤液加水定容,即为麻黄汤物质基准;
其中,重量份和体积份的对应关系为g/mL。
本发明还提供一种麻黄汤物质基准,其通过本发明所述的制备方法而获得。
优选地,所述麻黄汤物质基准中,包含桂皮醛。
进一步优选地,所述麻黄汤物质基准中,包含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸。
更进一步优选地,所述麻黄汤物质基准中,以麻黄41.4重量份为基准,所述盐酸麻黄碱与所述盐酸伪麻黄碱的总含量为0.270~0.580重量份,所述苦杏仁苷的含量为0.270~0.560重量份,并且,
在第二色谱条件下,所述麻黄汤物质基准的特征图谱中至少包含6个特征峰,所对应的相对保留时间依次为0.34、0.74、0.84、1.00、1.16和1.21,其偏差值在±5%之内;其中,所述第二色谱条件包括:C18色谱柱;流动相:二元流动相体系,其中:流动相A为乙腈,流动相B为0.15%(v/v)磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:254nm。
优选地,所述第二色谱条件中,梯度洗脱的程序如下:0~5min,21%流动相A;5~30min,21%→55%流动相A。
本发明还提供了一种麻黄汤物质基准的质量检测方法,包括以下步骤:
制备第一对照品溶液、第二对照品溶液以及麻黄汤物质基准的供试品溶液;
将所述第一对照品溶液和所述供试品溶液按照第一色谱条件分别进行液相检测,将所述第二对照品溶液和所述供试品溶液按照第二色谱条件进行液相检测,得到各自的液相图谱;
以所述第一对照品溶液的液相图谱作为对照,判断所述供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷是否符合含量要求;以所述第二对照品溶液的液相图谱作为对照,判断所述供试品溶液的液相图谱中是否包含符合特征峰要求的色谱峰;
其中,所述第一对照品溶液溶解有盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷,所述第二对照品溶液溶解有甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵。
优选地,所述的质量检测方法:
制备所述第一对照品溶液的步骤包括:将所述盐酸麻黄碱、所述盐酸伪麻黄碱和所述苦杏仁苷混合后采用甲醇溶解,制成每1mL含盐酸麻黄碱40~60μg、盐酸伪麻黄碱10~30μg、苦杏仁苷20~40μg的混合溶液;
制备所述第二对照品溶液的步骤包括:将所述甘草苷、所述肉桂酸、所述桂皮醛和所述甘草酸铵混合后采用甲醇溶解,制成每1mL含甘草苷30~50μg、肉桂酸90~110μg、桂皮醛10~30μg、甘草酸铵90~110μg的混合溶液;
制备所述供试品溶液的步骤包括:将所述麻黄汤物质基准采用水和甲醇稀释,密塞,称重,超声,并补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;其中,所述麻黄汤物质基准、所述水和所述甲醇的体积比为10:15:25。
进一步优选地,将所述麻黄汤物质基准先用水稀释,再用甲醇稀释,然后采用中性氧化铝吸附;
更进一步优选地,所述中性氧化铝的目数为100~200。
进一步优选地,超声处理之后采用甲醇水溶液补足减失的重量;
更进一步优选地,所述甲醇水溶液中甲醇体积分数为50%。
优选地,所述的量检测方法:
所述第一色谱条件包括:色谱柱:Ultimate Phenyl-Ether色谱柱;流动相:二元流动相体系,其中:流动相A为乙腈,流动相B为0.15%(v/v)磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:207nm。
进一步优选地,所述第一色谱条件中,所述梯度洗脱的程序如下:0~17min,3%→4%流动相A;17~30min,4%→7%流动相A;30~45min,7%流动相A;45~60min,5%→11%流动相A。
优选地,所述的质量检测方法:
所述第二色谱条件包括:色谱柱:C18色谱柱;流动相:二元流动相体系,其中:流动相A为乙腈,流动相B为0.15%磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:254nm。
进一步优选地,所述第二色谱条件中,所述梯度洗脱的程序如下:0~5min,21%流动相A;5~30min,21%→55%流动相A。
优选地,所述的质量检测方法:
判断是否符合特征峰要求时,确定所述供试品溶液的液相色谱中是否包含有对应桂皮醛特征峰的色谱峰。
进一步优选地,确定所述供试品溶液的液相图谱中是否包含有至少6个色谱峰,其中,4个所述色谱峰分别对应甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵的特征峰,并且所述色谱峰是否符合关于相对保留时间的规定。
更进一步优选地,所述关于相对保留时间的规定如下:
在所述供试品溶液的液相图谱中,以有对照品参比且峰面积最大的色谱峰为S峰,各色谱峰相对于S峰的相对保留时间在规定值的±5%之内。
优选地,所述的质量检测方法:
所述含量要求为:所述供试品溶液中,以麻黄41.4重量份为基准,所述盐酸麻黄碱与所述盐酸伪麻黄碱的总含量为0.270~0.580重量份,所述苦杏仁苷的含量为0.270~0.560重量份;
所述特征峰要求为:所述供试品溶液的液相图谱中至少包含有对应桂皮醛特征峰的色谱峰;优选地,所述供试品溶液的液相图谱中包含有至少6个色谱峰,其中,4个所述色谱峰分别对应甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵的特征峰,并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定。
发明的效果
本发明提供的麻黄汤物质基准的制备方法,对现有工艺进行改进,将制备冻干粉改为制备标准汤剂,无需浓缩、干燥等操作,避免了一些重要成分(如桂皮醛)的挥发,能够更好地还原古方。
进一步地,本发明根据上述制备方法制备的麻黄汤物质基准,能够还原古方麻黄汤“一碗汤”的原汁原味,可用于指导实际工业生产。
进一步地,本发明提供的上述麻黄汤物质基准的质量检测方法,将对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的定量测定与对甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸的定性分析融合,同时开发出新的色谱条件,分离度更好,稳定性更优,检测时间短、效率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为第一对照品溶液的含量测定液相图谱;
图2为实施例1制备的供试品溶液的含量测定液相图谱;
图3为实施例2制备的供试品溶液的含量测定液相图谱;
图4为实施例3制备的供试品溶液的含量测定液相图谱;
图5为第二对照品溶液的特征图谱;
图6为实施例1制备的供试品溶液的特征图谱;
图7为实施例2制备的供试品溶液的特征图谱;
图8为实施例3制备的供试品溶液的特征图谱;
图9为含量测定方法学中专属性考察的液相图谱;
图10为特征图谱方法学中专属性考察的液相图谱;
图11为对比例1制备的供试品溶液的含量测定液相图谱;
图12为对比例1制备的供试品溶液的特征图谱;
图13为第三对照品溶液在检测波长为207nm时的特征图谱;
图14为第三对照品溶液在检测波长为254nm时的特征图谱;
图15为对比例2中供试品溶液在检测波长为207nm时的特征图谱;
图16为对比例2中供试品溶液在检测波长为254nm时的特征图谱;
图17为本发明制备的供试品溶液的麻黄鉴别薄层色谱;
图18为本发明制备的供试品溶液的桂枝鉴别薄层色谱;
图19为本发明制备的供试品溶液的炙甘草鉴别薄层色谱;
图20为本发明制备的供试品溶液的燀苦杏仁鉴别薄层色谱。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外,为了更好地说明本发明,在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解,没有某些具体细节,本发明同样可以实施。在另外一些实例中,对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述,以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明,本说明书中所使用的单位均为国际标准单位,并且本发明中出现的数值,数值范围,均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中,使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中,使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中,“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生,并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中,所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如,特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中,并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外,应理解,所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<第一方面>
本发明提供了一种麻黄汤物质基准的制备方法,包括以下步骤:
取麻黄41.4重量份,加入水1800体积份,将电陶炉加热功率调至1500~2100W至煮沸,再调至500~700W煎煮20~30min,除去浮沫,然后加入桂枝27.6重量份、燀苦杏仁27.6重量份和炙甘草13.8重量份,在500~700W下继续煎煮30~60min,过滤,所得滤液加水定容,即为麻黄汤物质基准;
其中,重量份和体积份的对应关系为g/mL。
“经典名方物质基准”,是指以古籍中记载的古代经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的基准,除成型工艺外,其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致。依照现有技术所开发的麻黄汤物质基准难以还原古方原汁原味,而且,为方便保存和运输,现有技术中一般是将麻黄汤经冷冻干燥制备得到冻干粉,而麻黄汤中的易挥发物质(如桂皮醛)绝大部分会因此而损失。本发明提供的麻黄汤物质基准的制备方法,对现有工艺进行改进,将制备冻干粉改为制备标准汤剂,无需浓缩、干燥等步骤,避免了一些重要成分(如桂皮醛)的挥发,能够更好地还原古方。
在本发明一些具体的实施方案中,将麻黄置于砂锅中,加入上述规定量的水,采用电陶炉加热,调节其加热功率为1500~2100W至煮沸,再调至500~700W煎煮20~30min,其目的是将麻黄去沫。古人认为“沫令人烦”,通过煎煮操作除去浮沫,可更好地还原古方。若煎煮时间过短,所产生浮沫少;若煎煮时间过长,将影响桂枝、燀苦杏仁和炙甘草三味药材的煎煮效果。在实际操作时,上述煎煮过程中,水的蒸发量约为400体积份。
示例性地,煮沸操作的加热功率可以为1500W、1600W、1700W、1800W、1900W、2000W和2100W等,时间可以为9min、10min、11min、12min、13min和14min等;煎煮操作的加热功率可以为500W、550W、600W、650W和700W等,时间可以为20min、22min、25min、27min和30min等。
当加入桂枝、燀苦杏仁和炙甘草后,继续在500~700W下煎煮30~60min。若煎煮时间过短,将影响四味药材中有效成分的溶出效果;若煎煮时间过长,将导致苦杏仁苷的含量降低。示例性地,当加入上述三味药材后,加热功率可以为500W、550W、600W、650W和700W等,时间可以为30min、35min、40min、45min、50min、55min和60min等。
在本发明一些具体的实施方案中,采用100~200目筛对煎煮之后的药液混合物过滤,保证所得滤液具有较好的澄清度。示例性地,滤材规格可选择100目、120目、150目和200目,优选200目。
根据所加入各味药材的质量,向上述滤液中加入特定比例的水进行定容,可将麻黄汤物质基准中指标性成分的含量控制在适宜范围内,以此用于指导实际生产。如当麻黄质量为41.4g时,过滤后加水定容至500mL;当麻黄质量为82.8g时,过滤后加水定容至1000mL;等等。
<第二方面>
本发明提供一种麻黄汤物质基准,其通过上述制备方法而获得。
根据上述制备方法而获得的麻黄汤物质基准,可充分保留各味药材中的有效成分,能够尽最大限度还原古方麻黄汤“一碗汤”的原汁原味,可用于指导实际工业生产,体现经典名方物质基准的价值。
在本发明一些具体的实施方案中,上述麻黄汤物质基准包含有桂皮醛。桂皮醛是麻黄汤的有效成分,属于易挥发物质,现有技术在制备麻黄汤冻干粉时因经浓缩、干燥等过程,绝大部分桂皮醛会因此而损失,因此,桂皮醛可作为考察麻黄汤能否作为物质基准的指标性成分。
在本发明一些优选的实施方案中,上述麻黄汤物质基准包含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸。盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱源自麻黄;苦杏仁苷源自燀苦杏仁;桂皮醛和大部分肉桂酸源自桂枝,少部分肉桂酸源自麻黄;甘草酸和甘草苷源自炙甘草。以此7种作为指标性成分,更能够较为全面地反映麻黄汤物质基准的关键质量属性。
在本发明一些优选的实施方案中,以麻黄41.4重量份为基准,所述盐酸麻黄碱与所述盐酸伪麻黄碱的总含量为0.270~0.580重量份;以燀苦杏仁27.6重量份为基准,所述苦杏仁苷的含量为0.270~0.560重量份,并且,
在第二色谱条件下,麻黄汤物质基准的特征图谱中至少包含6个特征峰,所对应的相对保留时间依次为0.34、0.74、0.84、1.00、1.16和1.21,其偏差值在±5%之内;其中,第二色谱条件包括:C18色谱柱;流动相:二元流动相体系,其中:流动相A为乙腈,流动相B为0.15%磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:254nm。
在本发明一些优选的实施方案中,第二色谱条件中,梯度洗脱的程序如下:0~5min,21%流动相A;5~30min,21%→55%流动相A。
麻黄汤物质基准中相关指标性成分的含量和特征图谱应分别满足上述要求,可用于指导实际生产。
<第三方面>
本发明提供一种麻黄汤物质基准的质量检测方法,包括以下步骤:
制备第一对照品溶液、第二对照品溶液以及麻黄汤物质基准的供试品溶液;
将第一对照品溶液和供试品溶液按照第一色谱条件分别进行液相检测,将第二对照品溶液和供试品溶液按照第二色谱条件进行液相检测,得到各自的液相图谱;
以第一对照品溶液的液相图谱作为对照,判断供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷是否符合含量要求;以第二对照品溶液的液相色谱作为对照,判断供试品溶液的液相图谱中是否包含符合特征峰要求的色谱峰;
其中,第一对照品溶液溶解有盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷,第二对照品溶液溶解有甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵。
本发明提供的麻黄汤物质基准的质量检测方法,通过对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸等多种指标性成分进行分析,即可构建一种能够较为准确且全面地反映麻黄汤物质基准有效成分的质量评价体系,为判断麻黄汤能否作为用于指导实际生产的质量标准提供了简单可靠的检验手段。
同时,本发明开发出新的色谱条件,在对上述指标性成分进行分析时,所得液相色谱中色谱峰的分离度更好,稳定性更优;尤其是在第二色谱条件下对甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸等6种指标性成分进行定性分析时,还能缩短检测时间,提高检测效率。
溶液制备
在本发明一些具体的实施方案中,制备第一对照品溶液的步骤包括:将盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷混合后采用甲醇溶解,即得;优选地,精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷适量,加入甲醇,制成每1mL含盐酸麻黄碱40~60μg、盐酸伪麻黄碱10~30μg、苦杏仁苷20~40μg的混合溶液。第一对照品溶液中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的浓度应控制在上述范围内,浓度太低可能不出峰;浓度太高,可能出现过饱和平头峰,导致定量不准确。
制备第二对照品溶液的步骤包括:将甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵混合后采用甲醇溶解,即得;优选地,精密称取甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵适量,加入甲醇,制成每1mL含甘草苷30~50μg、肉桂酸90~110μg、桂皮醛10~30μg、甘草酸铵90~110μg的混合溶液。第二对照品溶液中的甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵的浓度应控制在上述范围内,浓度太低可能不出峰;浓度太高,可能出现过饱和平头峰,导致定量不准确。
制备供试品溶液的步骤包括:将麻黄汤物质基准采用水和甲醇稀释,密塞,称重,超声,并补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。若全部采用水稀释,更多杂质将被溶解,并在后续检测时被检出,导致检测基线不平整,从而影响指标性成分的检测效果;若全部采用甲醇稀释,液相图谱中将会产生溶剂效应。以水和甲醇对供试品溶液稀释,减小了供试品溶液的极性,从而使得部分杂质不溶,利于在后续吸附或过滤操作时被去除。
其中,麻黄汤物质基准、水和甲醇的体积比为10:15:25,即甲醇体积分数为50%,此体积比下色谱响应较好。
在本发明一些优选的实施方案中,将麻黄汤物质基准先用水稀释,再用甲醇稀释,更利于麻黄汤物质基准的溶解。若先用甲醇稀释,甲醇极性小于水,导致有些极性较大的成分析出,即使再加水也难以再溶解。
在本发明一些具体的实施方案中,中性氧化铝可吸附供试品溶液的杂质,从而减少液相图谱中基线噪音,峰纯度更好。在本发明一些优选的实施方案中,中性氧化铝的目数为100~200。
在制备供试品溶液时,在本发明一些优选的实施方案中,超声处理之后采用甲醇水溶液补足减失的重量;更优选地,甲醇水溶液中甲醇体积分数为50%。
色谱条件
在本发明一些具体的实施方案中,上述第一色谱条件包括:色谱柱:UltimatePhenyl-Ether色谱柱;流动相:二元流动相体系,其中,流动相A为乙腈,流动相B为0.15%(v/v)磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:207nm。
对于第一色谱条件,在本发明一些优选的实施方案中,其梯度洗脱的程序如下:0~17min,3%→4%流动相A;17~30min,4%→7%流动相A;30~45min,7%流动相A;45~60min,5%→11%流动相A。
在本发明一些具体的实施方案中,上述第二色谱条件包括:色谱柱:C18色谱柱(如Diamonsil C18色谱柱);流动相:二元流动相体系,其中,流动相A为乙腈,流动相B为0.15%(v/v)磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:254nm。
对于第二色谱条件,在本发明一些优选的实施方案中,其梯度洗脱的程序如下:0~5min,21%流动相A;5~30min,21%→55%流动相A。在对麻黄汤物质基准进行定性分析时,通过对色谱条件进行优化,6种指标性成分的色谱峰分离度更好,稳定性更优,检测时间更短。
评价方法
依据以下方法对麻黄汤物质基准的质量进行评价:
判断供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的含量是否符合含量要求;同时,判断供试品溶液的液相图谱中是否包含符合特征峰要求的色谱峰。其中,上述含量要求为:供试品溶液中,以麻黄41.4重量份为基准,所述盐酸麻黄碱与所述盐酸伪麻黄碱的总含量为0.270~0.580重量份;以燀苦杏仁27.6重量份为基准,所述苦杏仁苷的含量为0.270~0.560重量份;上述特征峰要求为:供试品溶液的液相图谱中应至少包含有对应桂皮醛特征峰的色谱峰。
桂皮醛属易挥发物质,在制备麻黄汤物质基准时极易损失,因此,桂皮醛可作为评价麻黄汤物质基准质量的指标性成分,通过分析供试品溶液中是否含有桂皮醛,并结合测定供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的含量是否符合含量要求,即可评价该麻黄汤物质基准的质量。
在对供试品溶液进行定性分析时,在本发明一些优选的实施方案中,确定供试品溶液的液相图谱中是否包含有至少6个色谱峰,其中:
应包含4个色谱峰,分别与第二对照品溶液的液相图谱中的甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵特征峰的保留时间相同;除此之外,根据相对保留时间稳定及各批次合格的麻黄汤物质基准均能检出且峰面积相对较高的原则,还适宜选出2种重复性较好的色谱峰作为特征峰,并且该色谱峰符合关于相对保留时间的规定。通过判断是否包含6个色谱峰能够更准确、更全面地评价麻黄汤物质基准的质量。
在对供试品溶液进行定性分析时,在本发明一些具体的实施方案中,关于相对保留时间的规定如下:在供试品溶液的液相图谱中,以有对照品参比且峰面积最大的色谱峰为S峰,各色谱峰相对于S峰的相对保留时间在规定值的±5%之内。具体地,以与肉桂酸对照品相应的峰为S峰,计算无对照品参比的2种未知成分的色谱峰的相对保留时间是否在规定值的±5%之内,规定值为0.74、0.84、1.00(S峰)。
考虑到检测条件会发生变化,为更准确地分析供试品溶液液相图谱中的色谱峰,各色谱峰均采用相对保留时间计算,即以肉桂酸对照品相应的峰为S峰,计算各色谱峰的相对保留时间是否在规定值的±5%之内,规定值为0.34、0.74、0.84、1.00(S峰)、1.16、1.21。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实验仪器、试剂、药品及药材
1.仪器
高效液相色谱仪(LC-20AT串联双柱塞泵,DGU-20A在线脱气系统,SIL-20A自动进样器,CTO-20AC柱温箱,SPD-M20A二极管阵列检测器;厂家:日本岛津);
十万分之一电子天平(型号:XSR105A;厂家:梅特勒-托利多);
数控超声波清洗器(型号:KQ-250DB;厂家:昆山市超声仪器有限公司);
便携式灶头(微电脑电陶炉)(型号:1647;厂家:广东艾诗凯奇智能科技有限公司);
砂锅(规格:3L;厂家:潮州市一壶百饮电器实业有限公司)。
2.试剂
乙腈(色谱纯,Fisher chemical);
磷酸(色谱纯,MREDA);
甲醇(分析纯,北京化工厂);
中性氧化铝(层析用,100~200目,国药集团化学试剂有限公司)
超纯水(哇哈哈纯净水)。
3.药品
盐酸麻黄碱(批号:171241-201809;含量:100%),购于中国食品药品检定研究院;
盐酸伪麻黄碱(批号:171237-201510;含量:99.8%),购于中国食品药品检定研究院;
苦杏仁苷(批号:110820-201808;含量:88.2%),购于中国食品药品检定研究院;
甘草苷(批号:111610-201908;含量:95.0%),购于中国食品药品检定研究院;
肉桂酸(批号:110786-201604;含量:98.8%),购于中国食品药品检定研究院;
桂皮醛(批号:110710-202022;含量:99.5%),购于中国食品药品检定研究院;
甘草酸铵(批号:110731-202021;含量:96.2%),购于中国食品药品检定研究院。
4.药材
麻黄为草麻黄Ephedra sinica Stapf的干燥草质茎,桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝,炙甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎的炮制加工品,燀苦杏仁为蔷薇科植物杏Prunus armeniaca L.的炮制加工品。制备麻黄汤物质基准所使用的麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草的批次(或批号)及产地信息如表1中所示。
表1麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草的相关信息
实施例1麻黄汤物质基准的制备
称取麻黄41.4g置于砂锅中,加入水1800mL,调节电陶炉加热功率为1500W,将体系加热至煮沸状态,从室温至煮沸用时12min;再调节加热功率为600W,煎煮25min,此时水的蒸发量为400mL,通过小勺撇去浮沫;然后加入桂枝27.6g、燀苦杏仁27.6g和炙甘草13.8g,在600W下继续煎煮45min,200目筛过滤,得到滤液约450mL,加水定容至500mL,即为麻黄汤物质基准。
其中,上述麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草四味药材分别对应表1中批号:H170183001-3、S174560S01、H180119001-3和H170001002。
实施例2麻黄汤物质基准的制备
称取麻黄41.4g置于砂锅中,加入水1800mL,调节电陶炉加热功率为1500W,将体系加热至煮沸状态,从室温至煮沸用时12min;再调节加热功率为700W,煎煮22min,此时水的蒸发量为400mL,通过小勺撇去浮沫;然后加入桂枝27.6g、燀苦杏仁27.6g和炙甘草13.8g,在700W下继续煎煮37min,200目筛过滤,得到滤液约470mL,加水定容至500mL,即为麻黄汤物质基准。
其中,上述麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草四味药材分别对应表1中批号:H170182001-3、S174440S01、H180011001-3和H180160002-3。
实施例3麻黄汤物质基准的制备
称取麻黄41.4g置于砂锅中,加入水1800mL,调节电陶炉加热功率为1500W,将体系加热至煮沸状态,从室温至煮沸用时12min;再调节加热功率为800W,煎煮20min,此时水的蒸发量为400mL,通过小勺撇去浮沫;然后加入桂枝27.6g、燀苦杏仁27.6g和炙甘草13.8g,在800W下继续煎煮36min,200目筛过滤,得到滤液约470mL,加水定容至500mL,即为麻黄汤物质基准。
其中,上述麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草四味药材分别对应表1中批号:H170018001-3、S174470S01、H170107001-3和H180067002-3。
实施例4麻黄汤物质基准的质量检测方法
1制备溶液
1.1制备第一对照品溶液
精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷适量,加入甲醇制成混合溶液,其中,每1mL混合溶液中含盐酸麻黄碱50μg、盐酸伪麻黄碱20μg、苦杏仁苷30μg,即为第一对照品溶液。
1.2制备第二对照品溶液
精密称取甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵适量,加入甲醇制成混合溶液,其中,每1mL混合溶液中含甘草苷40μg、肉桂酸100μg、桂皮醛20μg、甘草酸铵100μg,即为第二对照品溶液。
1.3制备供试品溶液
分别精密量取由实施例1-3制备的麻黄汤物质基准的汤剂各10mL,分别置具塞锥形瓶中,精密加水15mL,精密加甲醇25mL,然后加入中性氧化铝(100~200目)1.90g,密塞,称定重量,超声处理20min,放冷,再称定重量,用50%甲醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即为供试品溶液。
2质量评价
2.1含量测定
在第一色谱条件下,精密吸取第一对照品溶液10μL注入液相色谱仪,得到第一对照品溶液的液相图谱,如图1所示,峰1为盐酸麻黄碱,峰2为盐酸伪麻黄碱,峰3为苦杏仁苷。根据第一对照品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的浓度与液相图谱中对应的各色谱峰峰面积,构建该3种指标性成分的“浓度-峰面积标准曲线”。
在上述同样的色谱条件下,精密吸取由实施例1-3制备的供试品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪,得到各供试品溶液的液相图谱,依次如图2-4所示。确定图2-4中对应上述3种色谱峰(峰1、峰2、峰3)的色谱峰峰面积,根据上述已构建的“浓度-峰面积标准曲线”,分别读出各供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷各自的浓度,其结果如下文表13中所示。
具体地,第一色谱条件如下:
以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以0.15%(v/v)磷酸水溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速每分钟为0.6mL,柱温为31℃,检测波长为207nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。
2.2特征图谱的检测
在第二色谱条件下,精密吸取第二对照品溶液20μL注入液相色谱仪,得到第二对照品溶液的液相图谱,如图5所示,峰1为甘草苷,峰4为肉桂酸,峰5为桂皮醛,峰6为甘草酸。
在上述同样的色谱条件下,分别精密吸取由实施例1-3制备的试品溶液各20μL,分别注入液相色谱仪,得到各供试品溶液的液相图谱,依次如图6~8所示。以第二对照品溶液的液相图谱为对照,根据相对保留时间稳定及各供试品溶液均能检出且峰面积相对较高的原则,分别从图6~8中分别选出对应的色谱峰。
具体地,第二色谱条件如下:
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm);以乙腈为流动相A,以0.15%(v/v)磷酸水溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速每分钟为1.0mL;柱温为35℃;检测波长为254nm。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。
方法学考察
1含量方法学
1.1专属性考察
制备缺麻黄的阴性对照溶液和缺燀苦杏仁的阴性对照溶液,将第一对照品溶液、实施例1制备的供试品溶液分别按照“2.1含量测定”的第一色谱条件测定,记录色谱图,如图9所示。其中,A为实施例1制备的供试品溶液,B为缺麻黄的阴性对照溶液,C为缺燀苦杏仁的阴性对照溶液,D为第一对照品溶液;峰1为盐酸麻黄碱,峰2为盐酸伪麻黄碱,峰3为苦杏仁苷。
结果表明,阴性对照品中的其它成分对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱及苦杏仁苷的测定无干扰。
1.2线性考察
对照品溶液的制备:精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成含盐酸麻黄碱(1.014mg/mL)、盐酸伪麻黄碱(0.6208mg/mL)、苦杏仁苷(0.9482mg/mL)的溶液作为储备液。取对照品储备液1mL分别至10mL、25mL、50mL、100mL、250mL量瓶,加甲醇定容制成不同浓度对照品溶液(C5、C4、C3、C2、C1)。
取对照品溶液(C1、C2、C3、C4、C5)及对照品储备液,按照含量色谱条件进样,进样体积10μL,测定峰面积,分别以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,进行线性回归。
线性方程分别为盐酸麻黄碱y=37468x+41890,r2=1;盐酸伪麻黄碱y=38988x+11051,r2=1;苦杏仁苷y=17000x+2942.6,r2=1。结果表明,盐酸麻黄碱在4.06μg/mL~1014μg/mL、盐酸伪麻黄碱在2.48μg/mL~620μg/mL、苦杏仁苷在3.79μg/mL~948μg/mL范围内线性关系良好。
1.3精密度考察
取按照实施例1方法制备的供试品溶液,按照第一色谱条件连续进样6次,计算供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的峰面积的RSD,其结果如表2所示。
表2精密度考察
由表2得知,供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的峰面积的RSD分别为0.3%、0.1%、0.4%,均小于2%,表明仪器精密度良好。
1.4稳定性考察
取按照实施例1方法制备的供试品溶液,分别于供试品溶液制备后0,2,4,8,12,24,36小时按第一色谱条件进样检测,计算供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的峰面积的RSD,其结果如表3所示。
表3稳定性考察
由表3得知,供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的峰面积的RSD分别为1.3%、1.2%、1.7%,均小于2%,表明供试品溶液在制备后36小时内稳定。
1.5重复性考察
按照实施例1方法平行制备6份供试品溶液,分别按照第一色谱条件进样检测,计算6份供试品溶液的麻黄汤中盐酸麻黄碱含量、盐酸伪麻黄碱含量、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量和苦杏仁苷含量的RSD,其结果如表4所示。
表4重复性考察
由表4得知,6份供试品溶液的麻黄汤中盐酸麻黄碱含量、盐酸伪麻黄碱含量、盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量、苦杏仁苷含量的RSD分别为1.1%、0.8%、1.0%、1.1%,均小于2%,表明该制备方法的重复性良好。
1.6加样回收率考察
取已知含量的麻黄汤物质基准对应实物,根据麻黄汤中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的含量按1:1的比例添加各对照品,平行制备6份供试品溶液,按第一色谱条件进行检测,计算供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的平均加样回收率,其结果如表5所示。
表5加样回收率考察
由表5得知,供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷的平均加样回收率分别为98.67%、100.49%、99.63%,表明该方法的准确度较好。
2特征图谱方法学
2.1专属性考察
按照实施例1提供的方法分别制备麻黄汤剂、缺麻黄汤剂、麻黄单味汤剂、缺桂枝汤剂、桂枝单味汤剂、缺燀苦杏仁汤剂、燀苦杏仁单味汤剂、缺炙甘草汤剂和炙甘草单味汤剂;按照实施例4“1.3制备供试品溶液”提供的方法分别制备麻黄汤供试品溶液、缺麻黄阴性对照溶液、麻黄对照溶液、缺桂枝阴性对照溶液、桂枝对照溶液、缺燀苦杏仁阴性对照溶液、燀苦杏仁对照溶液、缺炙甘草阴性对照溶液和炙甘草对照溶液,按照实施例4“2.2特征图谱的检测”方法进行检测,结果如图10。其中,A为麻黄汤供试品溶液,B为缺麻黄阴性对照溶液,C为麻黄对照溶液,D为缺桂枝阴性对照溶液,E为桂枝对照溶液,F为缺燀苦杏仁阴性对照溶液,G为燀苦杏仁对照溶液,H为缺炙甘草阴性对照溶液,I为炙甘草对照溶液。从图10中可知,麻黄汤供试品溶液(A)、麻黄对照溶液(C)和缺桂枝阴性对照溶液(D)中均含有肉桂酸(峰4),这说明,部分肉桂酸源自麻黄;缺桂枝阴性对照溶液(D)不含峰3、峰5,但含峰4,这说明,对应的峰3、峰5的成分源自桂枝,部分肉桂酸(峰4)也源自桂枝;缺炙甘草阴性对照溶液(H)不含峰1、峰2和峰6,而炙甘草对照溶液(I)含峰1、峰2和峰6,这说明,对应峰1(甘草苷)、峰2和峰6(甘草酸)的成分源自炙甘草。
2.2精密度考察
取按照实施例1方法制备的供试品溶液,按照第二色谱条件重复进样6次,计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积,其结果分别如表6和表7所示。
表6相对保留时间精密度结果
表7相对峰面积精密度结果
由表6和表7得知,供试品溶液的相对保留时间精密度合格,相对峰面积精密度合格。
2.3重复性考察
按照实施例1方法平行制备6份供试品溶液,按照第二色谱条件进行检测,计算各峰的相对保留时间和相对峰面积,其结果如表8和表9所示。
表8相对保留时间重复性结果
表9相对峰面积重复性结果
由表8和表9所示,供试品溶液的相对保留时间重复性合格,相对峰面积重复性合格。
2.4稳定性考察
取按照实施例1方法制备的供试品溶液分别于0,2,4,8,12,24小时按第二色谱条件进样检测,计算各峰的相对保留时间和相对峰面积,其结果如表10和表11所示。
表10相对保留时间稳定性结果
表11相对峰面积稳定性结果
由表10和表11得知,麻黄汤标准煎液的供试品溶液在24h内稳定,相对保留时间稳定性合格,相对峰面积稳定性合格。
2.5色谱柱考察
取按照实施例1方法制备的供试品溶液分别使用DIKMA Diamonsil C18(2)(5μm,4.6×250mm)色谱柱、Phenomenex Gemini C18(5μm,4.6×250mm)按第二色谱条件进样检测,其结果如表12。
表12色谱柱考察
从表12数据可知,不同色谱柱对各成分峰相对保留时间没有影响。
对比例
对比例1麻黄汤物质基准的制备
采用砂锅开盖煎煮,武火(功率1500W)煮沸,文火(功率600W)保持微沸。取麻黄9g,加水1800mL煎煮30min,除去浮沫,加入桂枝6g、炙甘草3g、燀苦杏仁6g,煎煮70min,过200目筛,50℃条件下减压浓缩至250mL左右,冷冻干燥(温度<-40℃,压力<20Pa)24h,得麻黄汤冻干粉。
本对比例中,麻黄、桂枝、炙甘草和燀苦杏仁的来源同实施例1。
取所得麻黄汤冻干粉约0.05g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,然后加入中性氧化铝(100~200目)1.90g,密塞,称定重量,超声处理20min,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即为供试品溶液,并按照实施例4“2.1含量测定”、“2.2特征图谱的检测”的方法分别进行含量测定和特征图谱检测,表13和图11示出了含量测定的结果,图12示出了特征图谱检测的结果。
对比例2麻黄汤物质基准的质量检测方法
将本发明实施例1制备的麻黄汤物质基准按照不同于本发明的色谱条件进行特征图谱检测。
(1)制备溶液
(1-1)制备第三对照品溶液
精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、肉桂酸和甘草酸适量,加入甲醇制成混合溶液,其中,每1mL混合溶液中含盐酸麻黄碱50μg、盐酸伪麻黄碱20μg、苦杏仁苷30μg、甘草苷40μg、肉桂酸100μg、甘草酸100μg,即为第三对照品溶液。
(1-2)制备供试品溶液
方法同“1.3制备供试品溶液”。
(2)特征图谱的检测
第三色谱条件如下:
色谱柱:Diamonsil C18(5μm,4.6×250mm),检测波长:207nm、254nm,流速:1mL/min,进样体积:20μL,柱温:35℃,以0.15%磷酸水溶液为流动相A,以乙腈为流动相B,按下表梯度洗脱。
在第三色谱条件下,精密吸取第三对照品溶液20μL注入液相色谱仪,得到第三对照品溶液的液相图谱,如图13、图14所示,峰1为盐酸麻黄碱,峰2为盐酸伪麻黄碱,峰3为苦杏仁苷,峰4为甘草苷,峰5为肉桂酸,峰6为甘草酸,其中,图13对应检测波长207nm,图14对应检测波长254nm。
在上述同样的色谱条件下,精密吸取(1-2)制备的供试品溶液10μL注入液相色谱仪,得到供试品溶液的液相图谱,如图15、图16所示,其中,图15对应检测波长207nm,图16对应检测波长254nm。
以图13、图14为对照,根据相对保留时间稳定及各批次供试品溶液均能检出且峰面积相对较高的原则,从图15、图16中分别选出对应的色谱峰。其中,相对保留时间为:0.69(峰1)、0.80(峰2)、1.00(峰3(S))、1.04(峰4)、1.74(峰5)、2.03(峰5)、3.33(峰7)、3.78(峰8)、4.15(峰9)、4.39(峰10)、4.47(峰11)。
对比例3麻黄汤物质基准的质量检测方法
将本发明制备的麻黄汤物质基准通过薄层分析检测。
1麻黄鉴别
供试品溶液:将表1中相同编号的麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草对应组合,按照实施例1方法制备15批麻黄汤物质基准,各取100mL,水浴蒸干,加浓氨试液数滴,再加三氯甲烷10mL,超声1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2mL充分振摇,滤过,取续滤液作为供试品溶液,编号依次为2~16。
麻黄阴性样品:制备方法同供试品溶液,其区别在于在制备时不加入麻黄,所得阴性样品编号为1。
对照品溶液:取盐酸麻黄碱对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的溶液,作为对照品溶液,编号S。
吸取上述三种溶液各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(20:5:0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以茚三酮试液,在105℃加热至斑点显色清晰,如图17所示。
2桂枝鉴别
供试品溶液:将表1中相同编号的麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草对应组合,按照实施例1方法制备15批麻黄汤物质基准,各取100mL,水浴蒸干,加乙醚10mL,浸泡30min,时时振摇,滤过,即得供试品溶液,编号依次为3~17。
桂枝阴性样品:制备方法同供试品溶液,其区别在于在制备时不加入桂枝,所得阴性样品编号为1。
对照药材溶液:取桂枝对照药材2g,加乙醚10mL,浸泡30分钟,时时振摇,滤过,滤液挥干,残渣加三氯甲烷1mL使溶解,作为对照药材溶液,编号为2。
对照品溶液:取肉桂酸对照品,加乙醚制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液,编号为S。
吸取上述四种溶液各15μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,环己烷-乙醚-冰醋酸(5:5:0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以香草醛硫酸试液,置紫外灯(254nm)下检视,如图18所示。
3炙甘草鉴别
供试品溶液:将表1中相同编号的麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草对应组合,按照实施例1方法制备15批麻黄汤物质基准,各取100mL,水浴蒸干,加甲醇30mL,超声提取1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水40mL使溶解,用正丁醇提取3吃,每次20mL,合并正丁醇液,用水洗涤3吃,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇5mL溶解,作为供试品溶液,编号依次为3~17。
炙甘草阴性样品:制备方法同供试品溶液,其区别在于在制备时不加入炙甘草,所得阴性样品编号为1。
对照药材溶液:甘草对照药材1g,加乙醚40mL,加热回流1小时,滤过,弃去醚液,药渣加甲醇30mL,加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加水40mL使溶解,用正丁醇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,用水洗涤3次,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇5mL使溶解,作为对照药材溶液,编号为2。
吸取上述三种溶液各1~2μL,分别点于同一用1wt%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10wt%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,如图19所示。
4燀苦杏仁鉴别
供试品溶液:将表1中相同编号的麻黄、桂枝、燀苦杏仁和炙甘草对应组合,按照实施例1方法制备15批麻黄汤物质基准,各取100mL,水浴蒸干,加甲醇15mL,超声30min,放冷,滤过,即得供试品溶液,编号依次为2~16。
燀苦杏仁阴性样品:制备方法同供试品溶液,其区别在于在制备时不加入燀苦杏仁,所得阴性样品编号为1。
对照品溶液:取苦杏仁苷对照品,加甲醇制成每1mL含2mg的溶液,作为对照品溶液,编号为S。
取上述三种溶液各3μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)在5~10℃下放置12小时后的下层溶液为展开剂,展开,取出,立即用0.8wt%磷钼酸的15wt%硫酸乙醇溶液浸板,在105℃加热至斑点显色清晰,如图20所示。
检测结果分析
1.含量测定分析
各麻黄汤物质基准供试品溶液的含量测定结果如下:
表13各供试品溶液含量检测结果
按照本发明“以麻黄41.4重量份为基准,盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的总含量为0.270~0.580重量份;以燀苦杏仁27.6重量份为基准,苦杏仁苷的含量为0.270~0.560重量份”的含量要求,当麻黄加入量为41.4g时,盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量应为270~580mg、苦杏仁苷含量应为270~560mg。
由表13中数据对比以及图2-4、图11对比可知,根据本发明的制备方法所制备的麻黄汤物质基准满足药典的含量要求,能够还原古方的“原汁原味”,可用于指导实际生产,而根据对比例1的制备方法所制备的麻黄汤剂中,盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量、苦杏仁苷含量均低于上述要求,不能作为物质基准。制备冻干粉会导致桂皮醛的流失,冻干粉无法保留桂皮醛,桂皮醛是药典桂枝的含量测定成分,桂枝又是麻黄汤中的臣药,冻干粉中没有桂皮醛会对药效有较大的影响。而本发明制备的汤剂中桂皮醛没有多余的损失,较好的保留了桂枝饮片中的各种成分。
2特征图谱检测分析
以与肉桂酸对照品相应的峰4为S峰,按照相对保留时间的规定计算图6~图8中对应的色谱峰,其中,相对保留时间在规定值的±5%之内,规定值为:0.34、0.74、0.84、1.00(S峰)、1.16和1.21。得到6个色谱峰:峰1、峰2、峰3、峰4、峰5和峰6,其中,峰1、峰5和峰6分别与第二对照品溶液中的甘草苷、桂皮醛和甘草酸铵的保留时间对应。这说明,依据本发明提供的制备方法所制备的麻黄汤物质基准为合格的物质基准,能够全面反映其中的有效成分,可用于指导实际生产。
图12中包含5个色谱峰:峰1(甘草苷)、峰2(未知成分)、峰3(未知成分)、峰4(肉桂酸)和峰6(甘草酸),不含对应桂皮醛的峰5,这说明,依据对比例1提供的制备方法在制备冻干粉时,桂皮醛会挥发,无法还原古方。
在检测波长为207nm时,以图13为对照,可从图15选出对应盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷特征峰对应的色谱峰(峰3、峰4和峰6)以及三个未知成分的色谱峰(峰1、峰2、峰5),但与图4相比,图15中盐酸麻黄碱(峰3)与盐酸伪麻黄碱(峰4)色谱峰、苦杏仁苷(峰6)色谱峰与其在前肩峰的分离度均较差,对应其余对照品特征峰的色谱峰分离度则更差。在检测波长为254nm时,以图14为对照,可从图16中选出对应甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸特征峰对应的色谱峰(峰7、峰9、峰10和峰11),而对应盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷特征峰的色谱峰则因吸收太弱,无法观察不到。而且,采用本对比例提供的色谱条件进行特征图谱检测需要60分钟,时间长,而本发明进行特征图谱检测时间只需30分钟,时间缩短了一半,且节省流动相,检验成本低。
3薄层分析
通过薄层分析虽然鉴别出麻黄汤中的有效成分,但步骤较为繁琐;本发明提供的质量检测方法的检测效率更高。
以上已经描述了本公开的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择,旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进,或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (13)
1.一种麻黄汤物质基准的质量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
制备第一对照品溶液、第二对照品溶液以及麻黄汤物质基准的供试品溶液;
将所述第一对照品溶液和所述供试品溶液按照第一色谱条件分别进行液相检测,将所述第二对照品溶液和所述供试品溶液按照第二色谱条件进行液相检测,得到各自的液相图谱;
以所述第一对照品溶液的液相图谱作为对照,判断所述供试品溶液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷是否符合含量要求;以所述第二对照品溶液的液相图谱作为对照,判断所述供试品溶液的液相图谱中是否包含符合特征峰要求的色谱峰;
其中,所述第一对照品溶液溶解有盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和苦杏仁苷,所述第二对照品溶液溶解有甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵;
所述第二色谱条件包括:色谱柱:C18色谱柱;流动相:二元流动相体系,其中:流动相A为乙腈,流动相B为0.15%磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:254nm;
所述第二色谱条件中,所述梯度洗脱的程序如下:0~5min,21%流动相A;5~30min,21%→55%流动相A;
所述麻黄汤物质基准的制备方法包括以下步骤:称取麻黄41.4重量份,加入水1800体积份,将电陶炉加热功率调至1500~2100W至煮沸,再调至500~700W煎煮20~30min,除去浮沫,然后加入桂枝27.6重量份、燀苦杏仁27.6重量份和炙甘草13.8重量份,在500~700W下继续煎煮30~60min,过滤,所得滤液加水定容,即为麻黄汤物质基准;其中,重量份和体积份的对应关系为g/mL。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法,其特征在于,
制备所述第一对照品溶液的步骤包括:将所述盐酸麻黄碱、所述盐酸伪麻黄碱和所述苦杏仁苷混合后采用甲醇溶解,制成每1mL含盐酸麻黄碱40~60μg、盐酸伪麻黄碱10~30μg、苦杏仁苷20~40μg的混合溶液;
制备所述第二对照品溶液的步骤包括:将所述甘草苷、所述肉桂酸、所述桂皮醛和所述甘草酸铵混合后采用甲醇溶解,制成每1mL含甘草苷30~50μg、肉桂酸90~110μg、桂皮醛10~30μg、甘草酸铵90~110μg的混合溶液;
制备所述供试品溶液的步骤包括:将所述麻黄汤物质基准采用水和甲醇稀释,密塞,称重,超声,并补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;其中,所述麻黄汤物质基准、所述水和所述甲醇的体积比为10:15:25。
3.根据权利要求2所述的质量检测方法,其特征在于,
制备所述供试品溶液的步骤包括:将所述麻黄汤物质基准先用水稀释,再用甲醇稀释,然后采用中性氧化铝吸附。
4.根据权利要求3所述的质量检测方法,其特征在于,
所述中性氧化铝的目数为100~200。
5.根据权利要求2所述的质量检测方法,其特征在于,
制备所述供试品溶液的步骤包括:超声处理之后采用甲醇水溶液补足减失的重量。
6.根据权利要求5所述的质量检测方法,其特征在于,
所述甲醇水溶液中甲醇体积分数为50%。
7.根据权利要求1-6任一项所述的质量检测方法,其特征在于,
所述第一色谱条件包括:色谱柱:Ultimate Phenyl-Ether色谱柱;流动相:二元流动相体系,其中:流动相A为乙腈,流动相B为0.15%(v/v)磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱;检测波长:207nm。
8.根据权利要求7所述的质量检测方法,其特征在于,
所述第一色谱条件中,所述梯度洗脱的程序如下:0~17min,3%→4%流动相A;17~30min,4%→7%流动相A;30~45min,7%流动相A;45~60min,7%→11%流动相A。
9.根据权利要求1-6任一项所述的质量检测方法,其特征在于,
判断是否符合特征峰要求时,确定所述供试品溶液的液相色谱中是否包含有对应桂皮醛特征峰的色谱峰。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法,其特征在于,
判断是否符合特征峰要求时,确定所述供试品溶液的液相图谱中是否包含有至少6个色谱峰,其中,4个所述色谱峰分别对应甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵的特征峰,并且所述色谱峰是否符合关于相对保留时间的规定。
11.根据权利要求10所述的质量检测方法,其特征在于,
所述关于相对保留时间的规定如下:
在所述供试品溶液的液相图谱中,以有对照品参比且峰面积最大的色谱峰为S峰,各色谱峰相对于S峰的相对保留时间在规定值的±5%之内。
12.根据权利要求1-6任一项所述的质量检测方法,其特征在于,
所述含量要求为:所述供试品溶液中,以麻黄41.4重量份为基准,所述盐酸麻黄碱与所述盐酸伪麻黄碱的总含量为0.270~0.580重量份;以燀苦杏仁27.6重量份为基准,所述苦杏仁苷的含量为0.270~0.560重量份;
所述特征峰要求为:所述供试品溶液的液相图谱中至少包含有对应桂皮醛特征峰的色谱峰。
13.根据权利要求12所述的质量检测方法,其特征在于,
所述特征峰要求为:所述供试品溶液的液相图谱中包含有至少6个色谱峰,其中,4个所述色谱峰分别对应甘草苷、肉桂酸、桂皮醛和甘草酸铵的特征峰,并且所述色谱峰符合关于相对保留时间的规定。
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