CN113640427B - 一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中药成分检测技术领域，尤其涉及一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法及应用。本发明用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测小续命汤标准汤剂中的指标成分，具有较高的精密度、准确度、稳定性和重现性，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱等各指标成分色谱峰之间能够有效分离，从而能够快速、准确地检测小续命汤标准汤剂中的多种指标成分。

Description

一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法及应用
技术领域
本发明属于中药成分检测技术领域，尤其涉及一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法及应用。
背景技术
经典名方“小续命汤”出自唐·孙思邈的《备急千金要方》，其组成药味和用量为：人参14.0g、黄芩14.0g、甘草14.0g、肉桂14.0g、麻黄14.0g、附子7.0g、白芍14.0g、川芎14.0g、防风21.0g、苦杏仁14.0g、防己14.0g、生姜70.0g。小续命汤有效成分主要包括黄酮类(主要来自黄芩、甘草)、生物碱类(主要来自附子、麻黄、防己)、皂苷类(主要来自人参、甘草)、非皂苷萜类(主要来自芍药)及色原酮类(主要来自防风)，此外还含有脂肪酸类、脂肪醇类、氰苷类(主要来自苦杏仁)、苯酞类(主要来自川芎)等。小续命汤具有神经细胞保护、神经血管单元保护、线粒体功能保护、减轻脑水肿、预防脑血管疾病、改善记忆、降血脂及抗凝血等，常用于治疗中风及其后遗症、吉兰-巴雷综合征、阿尔兹海默症、类风湿关节炎、颈椎病、周围神经病变等疾病。
小续命汤的临床疗效及药理作用已得到科学验证，其有效成分研究也取得进展，但小续命汤汤剂整体质量控制仍乏系统性研究。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法和应用，该定量检测方法具有较高的精密度、准确度、稳定性和重现性，能够快速、准确地同时检测小续命汤标准汤剂中的多种指标成分。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法：用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测所述小续命汤标准汤剂中的指标成分，所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶超高效液相色谱柱；
流动相A为含有0.2％v/v甲酸的0.002mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003225536320000021
流速：0.18～0.22mL/min；
柱温：25～35℃；
PDA检测波长为275～285nm。
相对于现有技术而言，本发明采用超高效液相色谱/质谱联用的分析方法所采用的上述液相色谱条件具有较高的精密度、准确度、稳定性和重现性，各指标成分色谱峰之间能够有效分离，从而能够快速、准确地同时检测小续命汤标准汤剂中的以上各种指标成分。
其中小续命汤标准汤剂可按如下制备方法进行制备：
将去节寸斩后的麻黄14.0g用500mL水浸泡1.5h；同时，将人参、黄芩、甘草、肉桂、川芎、白芍、苦杏仁、防己各14.0g，“煻灰炮”附子7.0g，防风21.0g，共10味药用1000mL水浸泡1.5h；
将麻黄及其浸泡液敞盖单煎20min(待煎液沸腾后开始计时)，并在麻黄单煎期间去沫；麻黄单煎完毕后，加入除生姜外的其余10味药及其浸泡液，合盖共同煎煮90min(待煎液沸腾后开始计时)；
11味药共同煎煮完毕后，过滤，加入由生姜(70.0g)新鲜挤出的姜汁，合盖共同煎煮20min(待煎液沸腾后开始计时)，煎煮完成后过滤，将所得煎液冷却至室温，得小续命汤标准汤剂。
结合第一方面，所述指标成分包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、粉防己碱、防己诺林碱和8-姜酚。
结合第一方面，所述定量检测方法在检测前用甲醇稀释所述小续命汤标准汤剂，作为供试样品。
结合第一方面，所述色谱柱优选采用Shimadzu Shim-pack XR-ODSⅢUHPLC柱，规格为2.0×50mm，1.6μm。
结合第一方面，流速、柱温、检测波长可进一步优选，以获得更准确的检测结果，优选的范围值为：流速0.19～0.21mL/min，柱温27～32℃，检测波长277～282nm。更进一步优选的参数为：流速0.2mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。
结合第一方面，所述超高效液相色谱/质谱联用分析方法中，所述质谱优选采用联三重四极杆质谱(QQQ-MS)。
优选地，用所述质谱对除黄芩苷之外的其余所述指标成分定量分析，用PDA在280nm吸收波长下测定黄芩苷的色谱峰面积，并根据标准曲线计算黄芩苷含量。黄芩苷在小续命汤标准汤剂中的含量较高，质谱响应很强，容易出现过载的问题，为避免质谱过载对定量分析的影响，优选使用二极管阵列(PDA)检测器(检测波长280nm)单独对黄芩苷的含量进行定量分析。
本发明第二方面提供了上述定量检测方法在小续命汤标准汤剂质量控制中的应用，用所述定量检测方法检测小续命汤标准汤剂中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、粉防己碱、防己诺林碱和8-姜酚。
结合第二方面，小续命汤标准汤剂质量控制还包括用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测所述小续命汤标准汤剂中的肉桂酸，所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶超高效液相色谱柱；
流动相A为0.005mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003225536320000041
流速：0.18～0.22mL/min；
柱温：25～35℃；
不设置PDA检测波长。
结合第二方面，所述色谱柱优选采用Shimadzu Shim-pack XR-ODS Ⅲ UHPLC柱，规格为2.0×50mm，1.6μm。
优选地，流速为0.19～0.21mL/min，柱温为27～32℃。更进一步优选的参数为：流速0.2mL/min，柱温30℃。
结合第二方面，小续命汤标准汤剂质量控制还包括用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测所述小续命汤标准汤剂中的麻黄碱和伪麻黄碱，所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：苯基柱；
流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003225536320000042
流速：0.18～0.22mL/min；
柱温：25～35℃；
不设置PDA检测波长。
结合第二方面，所述色谱柱优选采用Phenomenonex Synergi HPLC苯基柱(4.6×250mm，4μm)。
优选地，流速为0.19～0.21mL/min，柱温为27～32℃。更进一步优选的参数为：流速0.2mL/min，柱温30℃。
上述定量检测方法中的17种指标成分以及肉桂酸、麻黄碱和伪麻黄碱全面覆盖了小续命汤中的12味原料药，能够反映12味原料药的质量情况，且以上20种成分与各单味药的药理活性及整体汤剂的临床疗效密切相关，同时在各单味药及整体汤剂中也具有一定的含量，因此，将上述定量分析方法结合肉桂酸、麻黄碱和伪麻黄碱的定量分析，能较为全面、有效地反映出标准汤剂的质量情况，为“小续命汤”的安全有效使用提供参考，同时也为“小续命汤”的标准化生产提供依据。
附图说明
图1为实施例3中人参皂苷Rg1的线性回归曲线；
图2为实施例3中人参皂苷Re的线性回归曲线；
图3为实施例3中黄芩苷的线性回归曲线；
图4为实施例3中甘草苷的线性回归曲线；
图5为实施例3中甘草酸的线性回归曲线；
图6为实施例3中肉桂酸的线性回归曲线；
图7为实施例3中麻黄碱的线性回归曲线；
图8为实施例3中伪麻黄碱的线性回归曲线；
图9为实施例3中次乌头碱的线性回归曲线；
图10为实施例3中苯甲酰乌头原碱的线性回归曲线；
图11为实施例3中苯甲酰次乌头原碱的线性回归曲线；
图12为实施例3中苯甲酰新乌头原碱的线性回归曲线；
图13为实施例3中芍药苷的线性回归曲线；
图14为实施例3中阿魏酸的线性回归曲线；
图15为实施例3中升麻素苷的线性回归曲线；
图16为实施例3中5-O-甲基维斯阿米醇苷的线性回归曲线；
图17为实施例3中的线性回归曲线；
图18为实施例3中粉防己碱的线性回归曲线；
图19为实施例3中防己诺林碱的线性回归曲线；
图20为实施例3中8-姜酚的线性回归曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
“小续命汤”的组成药味和用量为：人参14.0g、黄芩14.0g、甘草14.0g、肉桂14.0g、麻黄14.0g、附子7.0g、白芍14.0g、川芎14.0g、防风21.0g、苦杏仁14.0g、防己14.0g、生姜70.0g。小续命汤有效成分主要包括黄酮类(主要来自黄芩、甘草)、生物碱类(主要来自附子、麻黄、防己)、皂苷类(主要来自人参、甘草)、非皂苷萜类(主要来自芍药)及色原酮类(主要来自防风)，此外还含有脂肪酸类、脂肪醇类、氰苷类(主要来自苦杏仁)、苯酞类(主要来自川芎)等。对有效成分进行定量分析，对于其标准化生产以及安全有效使用具有重要意义。但是，若对小续命汤的有效成分进行逐一定量需要消耗大量时间，在规模化生产过程中对于中间过程控制和产品质量检验都会存在诸多不便。
为了能在更短的时间内对尽可能多的有效成分进行定量分析，本发明实施例提供了一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，该定量检测方法通过采用超高效液相色谱/质谱联用分析方法，先用超高效液相色谱同时分离出小续命汤标准汤剂中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、防己生物碱类和8-姜酚等指标成分，再用质谱对除黄芩苷之外的其余指标成分定量分析，用标准曲线法对黄芩苷定量分析，从而能够快速检测出以上多种指标成分的含量。
其中超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶超高效液相色谱柱；
流动相A为含有0.2％v/v甲酸的0.002mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性洗脱梯度如下：
Figure BDA0003225536320000071
流速：0.18～0.22mL/min；
柱温：25～35℃；
PDA检测波长为275～285nm。
本申请实施例中，流速优选0.19～0.21mL/min，柱温优选27～32℃，检测波长优选277～282nm。进一步优选的参数为：流速0.2mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。
本申请实施例中，色谱柱为Shimadzu Shim-pack XR-ODS Ⅲ UHPLC柱，规格为2.0×50mm，1.6μm。
本申请实施例中，质谱检测器为串联三重四极杆质谱仪。
为了全面地反映小续命汤标准汤剂的质量情况，每一味药的存在与否、含量高低都应该在标准汤剂的质量标准中有所体现。因此，本发明实施例还提供了上述检测方法在小续命汤标准汤剂质量控制中的应用，除了检测上述指标成分外，还对肉桂酸、麻黄碱和伪麻黄碱进行定量检测，使各单味药都至少有1个指标成分。该质量控制为小续命汤标准汤剂的安全有效使用提供参考，同时也为小续命汤标准汤剂的标准化生产提供依据。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。
实施例1
本发明实施例提供了一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，指标成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、粉防己碱、防己诺林碱和8-姜酚。用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测小续命汤标准汤剂中的指标成分，超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS Ⅲ UHPLC柱，规格为2.0×50mm，1.6μm；
流动相A为含有0.2％v/v甲酸的0.002mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003225536320000081
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
PDA检测波长为280nm。
用PDA在280nm吸收波长下测定黄芩苷的色谱峰面积，并根据标准曲线计算黄芩苷含量；用串联三重四极杆质谱对除黄芩苷之外的其余所述指标成分定量分析，质谱条件如表1所示：
表1人参皂苷等16种指标成分的定量分析QQQ-MS条件
Figure BDA0003225536320000082
Figure BDA0003225536320000091
Figure BDA0003225536320000101
实施例2
本发明实施例提供了一种小续命汤标准汤剂的质量控制方法，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、粉防己碱、防己诺林碱、8-姜酚、肉桂酸、麻黄碱和伪麻黄碱作为指标成分。用实施例1中的定量检测方法对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、粉防己碱、防己诺林碱和8-姜酚进行定量检测，并用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测小续命汤标准汤剂中的肉桂酸、麻黄碱和伪麻黄碱。
检测肉桂酸时，超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS Ⅲ UHPLC柱，规格为2.0×50mm，1.6μm；
流动相A为0.005mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003225536320000111
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
不设置PDA检测波长。
检测麻黄碱和伪麻黄碱时，超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：Phenomenonex Synergi HPLC苯基柱(4.6×250mm，4μm)；
流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的程序如下：
Figure BDA0003225536320000112
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
不设置PDA检测波长。
质谱条件如表2所示。
表2肉桂酸、麻黄碱和伪麻黄碱的定量分析QQQ-MS条件
Figure BDA0003225536320000113
Figure BDA0003225536320000121
实施例3
本发明实施例对以上实施例1、2的检测方法进行了方法学验证。
1.实验材料
本实验所用药味的名称、基源、批号、产地等信息如表3所示。
表3方法学验证所用药味信息
名称 基源 批号 产地
人参 Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎 1709272 吉林靖宇
黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根 HQ180324 山西闻喜
甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎 17111412 甘肃陇西
肉桂 Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮 RG1809191 广东肇庆
麻黄 Ephedra sinica Stapf的干燥草质茎 MH180321 内蒙古赤峰
附子 Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品 180727-1 四川江油
川芎 Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎 18091424 四川什邡隐峰
白芍 Paeonia lactiflora Pall.的干燥根 BS180312 四川中江
防风 Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根 FF180315 河南安阳
苦杏仁 Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.的干燥成熟种子 KXR180311 陕西榆林靖边
防己 Stephania tetrandra S.Moore的干燥根 FJ180311 江西新余
生姜 Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎 / 北京本地超市
本实验所用对照品均购自，批号分别为：人参皂苷Rg1 110703-201933，人参皂苷Re 110754-201827，黄芩苷110715-201821，甘草苷111610-201607，甘草酸铵110731-202021，肉桂酸110786-201604，盐酸麻黄碱171241-201809，盐酸伪麻黄碱171237-201510，次乌头碱110798-201609，苯甲酰乌头原碱111794-202006，苯甲酰次乌头原碱111796-201906，苯甲酰新乌头原碱111795-201805，芍药苷110736-201943，阿魏酸110773-201614，升麻素苷111522-201712，5-O-甲基维斯阿米醇苷111523-201610，苦杏仁苷110820-201607，粉防己碱110711-201810，防己诺林碱110793-201807，8-姜酚111993-201601。
采用HPLC面积归一化法测定，纯度均≥98％。
其他试剂分别为：超纯水(由Milli-Q超纯水系统制备)、甲醇(HPLC级，Fisher，LOT201209)、乙腈(HPLC级，Fisher，LOT202888)、甲酸(LC/MS级，Fisher，LOT202674)、乙酸铵(LC/MS级，SIGMA，73594-100G-F)等。
2.仪器
LC/QQQ-MS分析仪(
Figure BDA0003225536320000131
型号：LC-30AD&LCMS-8050)。
3.溶液配制
3.1药味的炮制加工与汤剂的煎煮
精确称取去节寸斩后的麻黄14.0g置于洁净200mL玻璃烧杯中，加入500mL超纯水浸泡1.5h；同时，精确称取人参、黄芩、甘草、肉桂、川芎、白芍、苦杏仁、防己各14.0g，“煻灰炮”附子7.0g，防风21.0g，共10味药置于另一洁净的2000mL玻璃烧杯中，加入1000mL超纯水浸泡1.5h。
将麻黄连同浸泡液倒入陶瓷煎药锅中，并用300mL超纯水清洗烧杯，清洗液一并倒入陶瓷煎药锅。打开万用电热丝炉，在1000W功率下敞开盖子单独煎煮麻黄，待煎液沸腾后开始计时，共煎煮20min。在麻黄单独煎煮期间，若煎液有泡沫产生，则需使用漏勺将泡沫捞出(即为古籍所记载的“去沫”操作)。
麻黄单独煎煮完毕后，将除生姜外的其余10味药连同浸泡液倒入陶瓷煎药锅中，并用200mL超纯水清洗烧杯，清洗液一并倒入陶瓷煎药锅。打开万用电热丝炉，在500W功率下合上盖子共同煎煮11味药，待煎液沸腾后开始计时，共煎煮90min。(即为古籍所记载的“以水一斗，煮取三升”)
在11味药共同煎煮工作即将完成时，精确称取70.0g生姜，先切成拇指头大小的小块，再使用榨汁机进行榨汁，取榨好的姜汁，密封备用。
11味药共同煎煮完毕后，先使用1层无纺纱布对煎液进行过滤，再将陶瓷煎药锅中的药渣尽可能地取出，并置于3层无纺纱布中对药渣进行充分拧挤，将药渣中吸附的煎液尽可能地挤出。合并过滤的煎液和挤药渣得到的煎液，重新倒回陶瓷煎药锅中，将新鲜姜汁倒入煎药锅中，打开万用电热丝炉，在500W功率下合上盖子与煎液共同煎煮12味药，待煎液沸腾后开始计时，共煎煮20min，趁热将煎液倒入1000mL玻璃量筒中，记录煎液体积，再尽量全部转移至样品瓶中，盖上盖子后(未完全盖实，避免瓶内气体冷却收缩后瓶盖难以打开)室温下冷却至室温，得小续命汤标准汤剂，转移至4℃冰箱中冷藏保存(盖实盖子)备用。
3.2标准汤剂供试品溶液的制备
将4℃冰箱保存的小续命汤标准汤剂取出，立即取适量上清液置于洁净2.0mL离心管中，12000r/min离心10min，精密吸取上清液950μL置于另一个洁净的2.0mL离心管中，精密添加甲醇50μL，涡旋30s充分混匀，再经12000r/min离心10min，取上清液，即得小续命汤标准汤剂样品原液(×1液)。精密吸取小续命汤标准汤剂样品原液(×1液)100μL置于洁净2.0mL离心管中，精密添加5％甲醇水溶液900μL，涡旋30s充分混匀，再经12000r/min离心10min，取上清液，即得小续命汤标准汤剂样品稀释液(×10液；即稀释10倍)。
3.3对照品溶液的制备
精密称量适量对照品，置于适当容积(1mL、5mL、10mL、25mL或50mL)的棕色量瓶中，后精密添加甲醇稀释至刻度线处，即得该对照品的保存母液，再使用甲醇将对照品保存母液逐级稀释成一系列浓度的对照品工作溶液，用于分析方法的方法学验证实验中。各对照品浓度分别为：
人参皂苷Rg1 0.146mg/mL，人参皂苷Re 0.132mg/mL，黄芩苷2.35mg/mL，甘草苷0.442mg/mL，甘草酸0.454mg/mL，肉桂酸0.692mg/mL，盐酸麻黄碱0.254mg/mL，盐酸伪麻黄碱0.332mg/mL，次乌头碱0.127mg/mL、苯甲酰乌头原碱0.338mg/mL、苯甲酰次乌头原碱0.161mg/mL、苯甲酰新乌头原碱0.192mg/mL、芍药苷7.63mg/mL、阿魏酸0.736mg/mL、升麻素苷0.384mg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.556mg/mL、苦杏仁苷0.312mg/mL、粉防己碱0.388mg/mL、防己诺林碱0.482mg/mL，8-姜酚0.0524mg/mL。
4、方法学的验证
4.1精密度
取同一份对照品工作溶液，使用实施例1、2的定量检测方法连续进样分析6次，根据同一指标成分的峰面积数据结果，计算RSD值。
4.2重复性
使用同一份小续命汤标准汤剂，按照标准汤剂供试品溶液的制备方法，平行制备6份小续命汤标准汤剂样品稀释液(×10液)，并对这6份平行制备样品使用实施例1、2的定量检测方法进行连续分析，根据同一指标成分的峰面积数据结果，计算RSD值。
4.3稳定性
取同一份小续命汤标准汤剂样品稀释液(×1液)，使用实施例1、2的定量检测方法，在样品制备后的0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h等时间点对该样品进行分析，根据同一指标成分的峰面积数据结果，计算RSD值。
4.4准确度
使用同一份小续命汤标准汤剂，按照标准汤剂供试品溶液的制备方法，平行制备6份小续命汤标准汤剂样品稀释液(×10液)，并使用实施例1、2的定量检测方法对这6份原始样品进行分析，得到各指标成分的原始峰面积数据，再根据标准曲线计算小续命汤标准汤剂供试品中各指标成分的原始含量(A)；接着，向已知浓度的6份原始样品中加入已知浓度(B)的对照品(加入量：原样品含量≈1:1)，测定加样样品中各指标成分的信号峰峰面积，再根据标准曲线计算6份加样样品中各指标成分的实测含量(C)，并计算加样回收率以及回收率的RSD值。
加样回收率(％)＝(C-A)/B×100％
以上精密度、重复性、稳定性、准确度试验的结果如表4所示。
表4精密度、重复性、稳定性、准确度试验结果
Figure BDA0003225536320000161
从上述结果可以看出，精密度考察结果中，除人参皂苷Re之外，其余19个指标成分的峰面积RSD值均≤3.0％，表明仪器状态良好，考虑到小续命汤标准汤剂样品的基质复杂性及多组分分析的影响，精密度标准可以适当放宽。基于上述理由，人参皂苷Re的峰面积RSD值(3.23％)在可接受范围之内，故判定实施例1、2中的定量检测方法的仪器精密度可满足实验需求。
重复性考察结果中，除人参皂苷Rg1、人参皂苷Re之外，其余18个指标成分的峰面积RSD值均≤3.0％，表明样品制备过程相对稳定，实验员的操作平行性较好。考虑到“小续命汤”标准汤剂样品的基质复杂性及多组分分析的影响，重复性标准可以适当放宽。基于上述理由，人参皂苷Rg1(3.35％)和人参皂苷Re(4.57％)的峰面积RSD值在可接受范围之内，样品制备工艺的重复性良好，故判定实施例1、2中的定量检测方法的制备重复性可满足实验需求。
稳定性考察结果中，除次乌头碱之外，其余19个指标成分的峰面积RSD值均≤3.0％，表明小续命汤标准汤剂样品在4℃保存的过程中，各指标成分的浓度相对稳定。考虑到小续命汤标准汤剂样品的基质复杂性及多组分分析的影响，稳定性标准可以适当放宽。基于上述理由，次乌头碱的峰面积RSD值(4.04％)在可接受范围之内，样品在4℃条件下保存的稳定性良好，故判定实施例1、2中的定量检测方法的样品稳定性可满足实验需求。
准确度考察结果中，20个指标成分加样回收率的RSD≤5.0％，表明操作平行性良好；根据《中国药典》(2015版)中有关规定，不同含量范围的指标成分，其加样回收率的验收标准也有所不同。次乌头碱和防己诺林碱的加样回收率在128.5％～148.5％之间，由于它们的含量范围在0.00001％～0.0001％数量级，大大超出了《中国药典》(2015版)规定的相应数量级样品的加样回收率结果所允许的范围(75％～120％)，故最终判定不适合进行定量分析，但考虑到次乌头碱是控制附子和小续命汤标准汤剂安全性的重要指标成分之一，可作为限量指标成分纳入标准。除次乌头碱和防己诺林碱之外，其余18个指标成分的加样回收率范围均满足药典标准。
4.5线性和范围
取同一指标成分的一系列浓度对照品工作溶液，使用实施例1、2的定量检测方法连续进样分析，根据对照品工作溶液的实际浓度及对应的峰面积数据结果，绘制线性回归曲线，根据回归曲线方程确定该指标成分的线性范围。各指标成分的线性回归曲线如下图1～20所示。从上述结果中可以看出，20个指标成分的线性回归曲线方程的R2≥0.9991，表明各指标成分在对应浓度范围内的线性良好，故判定实施例1、2的定量检测方法的线性和范围能满足定量分析要求。各指标成分的线性和范围情况如表5。
表5线性范围
线性范围(μg/mL) R2
人参皂苷Rg1 0.152～2.43 0.9993
人参皂苷Re 0.413～6.60 0.9997
黄芩苷 6.53～118 0.9999
甘草苷 0.735～14.7 0.9997
甘草酸 1.42～22.7 0.9995
肉桂酸 0.247～9.89 0.9994
麻黄碱 6.35～50.8 0.9993
伪麻黄碱 1.19～9.48 0.9995
次乌头碱 0.0530～0.265 0.9993
苯甲酰乌头原碱 0.0468～0.845 0.9998
苯甲酰次乌头原碱 0.0201～1.61 0.9999
苯甲酰新乌头原碱 9.60～48.0 0.9992
芍药苷 9.50～190 0.9992
阿魏酸 0.409～7.36 0.9991
升麻素苷 1.37～19.2 0.9999
5-O-甲基维斯阿米醇苷 1.54～27.8 0.9994
苦杏仁苷 0.520～10.4 0.9994
粉防己碱 0.0970～0.776 0.9996
防己诺林碱 0.0502～0.803 0.9992
8-姜酚 0.0109～0.175 0.9992
4.6定量下限
取同一指标成分的一系列浓度对照品工作溶液，使用实施例1、2的定量检测方法连续进样分析，根据对照品工作溶液的实际浓度及对应的峰面积数据结果，绘制线性回归曲线，根据回归曲线方程确定该指标成分的线性范围，并将线性范围的下限确定为该指标成分在该分析条件下的定量下限。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，其特征在于，用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测所述小续命汤标准汤剂中的指标成分，所述指标成分包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、粉防己碱、防己诺林碱和8-姜酚；所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶超高效液相色谱柱；
流动相A为含有0.2％v/v甲酸的0.002mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure FDA0004116997040000011
流速：0.18～0.22mL/min；
柱温：25～35℃；
PDA检测波长为275～285nm。
2.根据权利要求1所述的小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，其特征在于，所述定量检测方法还包括在检测前用甲醇稀释所述小续命汤标准汤剂，作为供试样品。
3.根据权利要求1所述的小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Shimadzu Shim-pack XR-ODSⅢUHPLC柱，规格为2.0×50mm，1.6μm。
4.根据权利要求1所述的小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，其特征在于，所述流速为0.19～0.21mL/min；和/或
柱温为27～32℃；和/或
检测波长为277～282nm。
5.根据权利要求4所述的小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，其特征在于，所述流速为0.2mL/min；和/或
柱温为30℃；和/或
检测波长为280nm。
6.根据权利要求1～5任一项所述的小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱/质谱联用分析方法中，所述质谱为串联三重四极杆质谱。
7.根据权利要求6所述的小续命汤标准汤剂中指标成分的定量检测方法，其特征在于，用所述质谱对除黄芩苷之外的其余所述指标成分定量分析，用二极管阵列检测器在280nm吸收波长下测定黄芩苷的色谱峰面积，并根据标准曲线计算黄芩苷含量。
8.权利要求1～7任一项所述小续命汤标准汤剂的定量检测方法在小续命汤标准汤剂质量控制中的应用，其特征在于，用所述定量检测方法检测小续命汤标准汤剂中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芩苷、甘草苷、甘草酸、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、苦杏仁苷、粉防己碱、防己诺林碱和8-姜酚。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述小续命汤标准汤剂质量控制还包括用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测所述小续命汤标准汤剂中的肉桂酸，所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶超高效液相色谱柱；
流动相A为0.005mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure FDA0004116997040000021
Figure FDA0004116997040000031
流速：0.18～0.22mL/min；
柱温：25～35℃；
不设置PDA检测波长。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，还包括用超高效液相色谱/质谱联用分析方法检测所述小续命汤标准汤剂中的麻黄碱和伪麻黄碱，所述超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：苯基柱；
流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
Figure FDA0004116997040000032
流速：0.18～0.22mL/min；
柱温：25～35℃；
不设置PDA检测波长。
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