CN111413443B - 一种当归及其饮片的特征图谱、构建方法和鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种当归的特征图谱及其构建方法和鉴别方法，通过高效液相色谱法建立当归药材及其多种炮制品的特征图谱，包括分别从当归药材与其饮片提取并制得供试品溶液；制备对照品溶液，将供试品溶液和对照品溶液分别进行高效液相色谱法检测，即得对应的特征图谱，可以快速的区别出当归药材及其炮制品，方法简单方便，具有操作简单、分离度好、精密度高、重复性好以及稳定性好等优点。

Description

一种当归及其饮片的特征图谱、构建方法和鉴别方法

技术领域

本发明是一种当归及其饮片的特征图谱、构建方法和鉴别方法，具体的说，是一种专门针对酒洗当归、酒制当归、水洗当归炮制工艺所制得的当归炮制品及当归药材的特征图谱及其构建方法，以及用该特征图谱鉴别当归药材、酒洗当归、酒制当归、水洗当归炮制品的方法，属于中药材检测技术领域。

背景技术

当归为伞形科植物当归的干燥根，性温，味甘、辛、微苦；最早记载于《神农本草经》，有补气补血、补血活血、调经止痛、润肠通便等功效，在历代医学著作中，均有对当归的记载。当归作为传统常用药，当归药材的炮制也被大家所重视，当归炮制资料最早出现在《刘涓子鬼遗方》中，从此，当归炮制的认识也由浅及深。当归的古代炮制有25种之多，有不同处理方式的，如常温，加热、用辅料，非辅料的；热处理方式的主要有清炒、辅料炒、蒸、煮、煨、煅等；所用辅料的有酒、醋、米、盐、生地汁、芍药汁、吴茱萸、姜汁、黑豆汁、土等；其中酒为应用范围最广泛的一种，有“酒制、酒炒、酒洗、酒蒸”。这些方法一直沿用至今，而且在中国药典与各地炮制规范均记载了“酒当归”的制品。

现代药理研究表明，中药炮制能够改变药物性能、引药归经，使药物对机体的作用趋向性发生改变，例如杨敏在“不同炮制方法对当归有效成分含量的影响”（《中国继续医学教育》，Vol.11，No.3）中指出了针对不同当归炮制品：生当归、酒炙当归、土炒当归、当归碳，进行有效成分含量比较时，上述几种当归炮制品的有效成分：挥发油、阿魏酸、总鞣质的含量均不相同。因此，在当归饮片的临床应用中，根据当归饮片的药效需求选择合适的炮制方法，即可使得炮制的中药饮片药效得以最大发挥，同时增强其药理作用。

随着现代化工艺的不断发展，当归的炮制工艺逐渐改进，现有常用的当归炮制品有酒洗当归：取当归，酒洒拌匀，使之闷润，低温干燥，酒制当归：按照《中国药典》2015版当归项下炮制，水洗当归：取当归，水洒拌匀，使之闷润，低温干燥，为更好的提供临床应用需求，务必需要对当归炮制品进行鉴别，现有专利文献CN107422063A（一种当归饮片与酒当归饮片及其配方颗粒的薄层鉴别方法，20171201）公开了一种用于区别当归饮片、酒当归饮片、当归配方颗粒和酒当归配方颗粒的薄层鉴别方法，另，现有专利文献CN108680673A（当归饮片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，20181019）还公开通过构建当归饮片HPLC指纹图谱以更为全面的评价当归饮片的质量。然而，目前并未公开任何专门针对酒洗当归、酒制当归以及水洗当归三种炮制方法制得的当归炮制品以及当归药材进行鉴别的方法，为此，本发明提供了一种当归特征图谱的构建方法及其鉴别方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种当归的特征图谱及其构建方法和鉴别方法，通过高效液相色谱法建立当归药材及其多种炮制品的特征图谱，可以快速的区别出当归药材及其炮制品，方法简单方便。

本发明通过下述技术方案实现：一种当归及其饮片特征图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）分别制备当归药材的供试品溶液、酒洗当归饮片的供试品溶液、酒制当归饮片的供试品溶液、水洗当归饮片的供试品溶液以及对照品溶液；

（2）将步骤（1）制得的供试品溶液和对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到对应的特征图谱；

（3）以步骤（2）中对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的特征图谱。

所述步骤（1）中，酒洗当归饮片是以当归药材为原料，经酒洒拌匀，闷润，低温干燥后炮制而成，所述酒为黄酒，当归药材与黄酒的质量比为1：1。

所述步骤（1）中，酒制当归饮片是以当归药材为原料，经酒洒拌匀，闷润，文火翻炒，放凉后炮制而成。

所述步骤（1）中，水洗当归饮片是以当归药材为原料，经水洒拌匀，闷润，低温干燥后炮制而成。

所述步骤（1）中，供试品溶液的制备方法包括：取当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片以及水洗当归饮片分别用甲醇溶解后，经超声处理、放冷、过滤后，制得对应的供试品溶液。

所述对照品溶液的制备方法包括：取阿魏酸对照品，用甲醇溶解后，制得每1ml甲醇溶液中阿魏酸的含量为50μg的对照品溶液。

所述步骤（2）中，高效液相色谱检测条件满足：

液相色谱柱：C18色谱柱；

柱温：30℃；

检测波长：290nm；

流动相A为乙腈，流动相B为0.1磷酸，梯度脱洗。

所述梯度脱洗过程为：

0～30min，流动相A为10～30%，流动相B为90～70%，

30～45min，流动相A为30～80%，流动相B为70～20%，

45～60min，流动相A为80～95%，流动相B为20～5%。

一种当归及其饮片的特征图谱，包括采用权利要求1所述方法构建得到的当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的特征图谱。

一种当归及其饮片的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）取待鉴定的当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片，分别制备当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的样品溶液；

（2）将步骤（1）制得的样品溶液，分别进行高效液相色谱检测，即得对应的待鉴别的特征图谱；

（3）将步骤（2）得到的待鉴别的特征图谱，与权利要求1所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对，若待鉴别的特征图谱与之对应的构建得到的特征图谱一致，则鉴别为质量合格。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明采用高效液相色谱法构建了当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的特征图谱，并通过此特征图谱的方法，实现了酒洗当归饮片、酒制当归饮片与当归药材和水洗当归饮片的快速鉴别，方法简单。

（2）本发明首次提出了对多种不同炮制方法制得的当归饮片建立特征图谱方法的鉴别，特别针对酒洗当归饮片与当归药材、酒制当归饮片以及水洗当归饮片的特征图谱进行区别，可实现不同炮制方法所得饮片的快速鉴别。

（3）本发明方法以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，具有操作简单、分离度好、精密度高、重复性好以及稳定性好等优点。

（4）本发明方法首次提出了酒洗当归饮片的鉴别方法，在特定的检测条件下，通过以阿魏酸色谱峰作为参照物S峰，可实现酒洗当归饮片与酒制当归饮片之间，酒洗当归饮片与当归药材之间，酒洗当归饮片与水洗当归饮片之间，酒制当归饮片与当归药材之间，酒制当归饮片与水洗当归饮片之间采用特征图谱方法的鉴定。

附图说明

图1为当归药材进行波长考察的特征图谱。

图2为当归药材进行柱温考察的特征图谱。

图3为当归药材进行流速考察的特征图谱。

图4为当归药材进行提取溶剂考察的特征图谱。

图5为当归药材的供试品溶液进行提取方法考察的特征图谱。

图6为当归药材的供试品溶液进行溶剂用量考察的特征图谱。

图7为当归药材的供试品溶液进行提取时间考察的特征图谱。

图8为当归药材的供试品溶液以不同对照品溶液进行检测时的色谱峰指认图。

图9为28批次当归药材验证的特征图谱。

图10为28批次酒洗当归饮片验证的特征图谱。

图11为当归药材及其饮片鉴别的特征图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例涉及的试验仪器及材料如下（%均以质量浓度计）：

高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪、Waters 2998-e2695型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、XP26（梅特勒-托利多仪器有限公司）；

超纯水机：细胞型1810A（上海摩勒科学仪器有限公司）；

超声波清洗器：KQ5200DB型（600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司）；

色谱柱： Agilent SB-C18 250×4.6mm 5um、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm、Agilent TC-C18 250×4.6mm 5um；

乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；

阿魏酸（中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614，含量以99%计）色氨酸（中国食品药品检定研究院，批号：140686-201303，含量以99.9%计）；

藁本内酯（中国食品药品检定研究院，批号：111737-201608）；

绿原酸（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201817，含量以96.2%计）；

洋川芎内酯

（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18041806）。

28批当归药材及28批酒洗当归饮片。

实施例1：

本实施例涉及当归饮片的炮制，包括酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片。

具体炮制工艺如下：

酒洗当归饮片：以当归药材为原料，经酒（黄酒）洒拌匀，闷润，低温干燥后炮制而成，每100g当归药材取黄酒100g。

酒制当归饮片：以当归药材为原料，经酒洒拌匀，闷润，文火翻炒，放凉后炮制而成。

水洗当归饮片：以当归药材为原料，经水洒拌匀，闷润，低温干燥后炮制而成。

实施例2：

本实施例涉及当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片特征图谱的建立。

具体步骤如下：

（1）制备供试品溶液：以当归药材和实施例1所述炮制工艺制得的酒洗当归饮片、酒制当归饮片以及水洗当归饮片为样品，精密称取各样品0.2g置于锥形瓶中，精密加入70%甲醇10ml，经超声处理30分钟，功率600W，频率45kHz，放冷至室温，再次称定重量，用70%甲醇补足减少的重量，过滤，取续滤液即得。

（2）制备对照品溶液：取阿魏酸对照品，用70%甲醇溶解后，制得每1ml甲醇溶液中阿魏酸的含量为50μg的对照品溶液。

（3）将步骤（1）制得的供试品溶液和步骤（2）制得的对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到对应的特征图谱。

高效液相色谱检测条件满足：

液相色谱柱：C18色谱柱；

柱温：30℃；

检测波长：290nm；

流动相A为乙腈，流动相B为0.1磷酸，进行梯度脱洗，梯度脱洗过程为：

0～30min，流动相A为10～30%，流动相B为90～70%，

30～45min，流动相A为30～80%，流动相B为70～20%，

45～60min，流动相A为80～95%，流动相B为20～5%。

（4）以步骤（3）中对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的特征图谱。

构建的当归药材的特征图谱共有8个特征峰，其中与阿魏酸参照物相应的峰为S峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.389（峰1）、0.481（峰2）、1.000（峰3，S）、1.358（峰4）、1.389（峰5）、2.326（峰6）、2.362（峰7）、2.652（峰8）。

构建的酒洗当归饮片的特征图谱共有9个特征峰，其中与阿魏酸参照物相应的峰为S峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.280（峰1）、0.383（峰2）、0.474（峰3）、1.000（峰4，S）、1.369（峰5）、1.390（峰6）、2.409（峰7）、2.448（峰8）、2.753（峰9）。

构建的酒制当归饮片的特征图谱共有9个特征峰，其中与阿魏酸参照物相应的峰为S峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.210（峰1）、0.280（峰2）、0.383（峰3）、0.474（峰4）、1.000（峰5，S）、1.369（峰6）、2.409（峰7）、2.448（峰8）、2.753（峰9）。

构建的水洗当归饮片的特征图谱共有8个特征峰，其中与阿魏酸参照物相应的峰为S峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.389（峰1）、0.481（峰2）、1.000（峰3，S）、1.358（峰4）、1.389（峰5）、2.326（峰6）、2.362（峰7）、2.652（峰8）。

实施例3：

本实施例涉及当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的鉴别。

（1）取待鉴定的当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片，按实施例2步骤（1）供试品溶液的制备方法，分别制取当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的样品溶液；

（2）将步骤（1）制得的样品溶液，按实施例2步骤（3）的检测条件，分别进行高效液相色谱检测，即得对应的待鉴别的特征图谱；

（3）将步骤（2）得到的待鉴别的特征图谱，与实施例2步骤（4）构建得到的对应的特征图谱进行比对，若待鉴别的特征图谱与之对应的构建得到的特征图谱一致，则鉴别为质量合格。

实施例4：波长的考察

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，通过DAD检测器在190～400nm范围进行全波长扫描，结果发现在检测波长为290nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为290nm，参见图1所示特征图谱。

实施例5：柱温的考察

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，比较柱温为25℃、30℃、和35℃所得特征图谱，各柱温条件下，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故最终选择30℃作为特征图谱方法的柱温，参见图2所示特征图谱。

实施例6：流速的考察

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，比较流速为0.8ml/min,1.0 ml/min，1.2 ml/min所得的特征图谱，结果表明在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min，参见图3所示特征图谱。

实施例7：提取溶剂考察

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，比较该供试品溶液中提取溶剂为50%甲醇、甲醇、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇时的特征图谱，结果表明提取溶剂中70%甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为70%甲醇，参见图4所示特征图谱。

实施例8：提取方法的考察

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，比较该供试品溶液中的提取方式为超声提取和回流提取时的特征图谱，结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取，参见图5所示特征图谱。

实施例9：溶剂用量的考察

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，比较供试品溶液中溶剂加入量为10mL、25ml、50mL时的特征图谱，结果表明，不同溶剂加入量对峰的影响较小，故综合考虑，溶剂加入10mL较为合理，参见图6所示特征图谱。

实施例10：提取时间的考察

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，比较供试品溶液制备的提取时间为10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟时的特征图谱，结果表明，不同提取时间对色谱峰的影响较小，综合考虑，供试品提取时间确定为30分钟，参见图7所示特征图谱。

综上所述，确定本方法采用高效液相色谱构建特征图谱时，色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm），以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长：290nm。脱洗过程参见下表1所示。

表1

实施例11：色谱峰的指认

以实施例2所述当归药材的供试品溶液为对象，采用不同对照品（阿魏酸对照品溶液、藁本内酯对照品溶液、绿原酸对照品溶液、洋川芎内酯

对照品溶液）进行对比，指认出1号峰为色氨酸，3号峰为绿原酸，4号峰为阿魏酸，5号峰为洋川芎内酯Ι，7号峰为藁本内酯，参见图8所示特征图谱。

实施例12：精密度的考察

精密称取当归药材0.2g，按照实施例2所述方法制备供试品溶液，并注入液相色谱仪，连续进样6次，计算各特征峰相对保留时间RSD%<2%，表明仪器精密度良好。

实施例13：重复性的考察

精密称取6份当归药材，各0.2g，按照实施例2所述方法制备供试品溶液，并注入液相色谱仪，计算各特征峰相对保留时间RSD%<5%，表明该方法重复性良好。

实施例14：稳定性的考察

精密称取当归药材0.2g，按照实施例2所述方法制备供试品溶液，分别于0h，3h，6h，12h，24h时测定，计算各特征峰相对保留时间RSD%<5%，表明供试品供试品溶液在24小时内稳定。

实施例15：耐用性的考察

（一）不同仪器考察

精密称取当归药材0.2g，按照上述方法制备供试品溶液，Waters2998-e2695、岛津LC-20AD、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定。计算各特征峰相对保留时间RSD%<10%。表明三种仪器均适用此方法。

（二）不同色谱柱考察

精密称取当归药材0.2g，按照上述方法制备供试品溶液，分别对色谱柱为AgilentTC-C18 250×4.6mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm、Agilent HC-C18 4.6×250mm进行测定。计算各特征峰相对保留时间RSD%<10%，表明三种色谱柱均适用此方法。

（三）不同人员和时间考察

由不同人员（A、B）在不同时间（T1 、T2）分别精密称取当归药材（批号：XLS201903211）各两份，制备供试品，进行测定。计算各特征峰相对保留时间RSD%<5%，表明方法稳定性较好。

（四）多批次当归药材与酒洗当归验证考察

对各批次当归药材批号及各批次酒洗当归饮片进行特征图谱方法的鉴别，获得对应的特征图谱，即图9和图10，图9、图10中由上之下编号为1～20，其对应的当归药材和酒洗当归饮片的批号参见下表2所示。

表2

（五）酒洗当归与当归药材、酒制当归、水洗当归的HPLC比较

分别精密称取酒洗当归、当归、酒制当归、水洗当归0.2g，按照实施例2所示方法制备对应的供试品溶液，并注入高效液相色谱仪，参见图11所示的特征图谱。

由上述图1～图10可知，本发明通过分析HPLC图谱建立了一种当归及其饮片特征图谱的方法，在其色谱图中共检测出5个特征峰，并通过此方法鉴别出酒洗当归饮片与当归药材、酒制当归饮片、水洗当归饮片之间的区别。由图11可看出，几种炮制品间的鉴别是由出峰时间来确定的，酒洗当归饮片与酒制当归饮片相比，酒洗当归饮片所确定的第一个特征峰出峰时间为5.193，酒制当归饮片在其出峰时间出了0号峰，酒洗当归饮片与当归药材和水洗当归饮片相比，酒洗当归饮片比当归药材和水洗当归饮片在5.193min多了1号峰，因此，通过构建其特征图谱，即可鉴定酒洗当归饮片与当归药材、酒制当归饮片、水洗当归饮片的区别，弥补了现有技术中，对不同炮制方法制得的当归饮片之间鉴别的空白，提高了现有当归饮片在临床应用中的前景。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种当归及其饮片特征图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）分别制备当归药材的供试品溶液、酒洗当归饮片的供试品溶液、酒制当归饮片的供试品溶液、水洗当归饮片的供试品溶液以及对照品溶液：

取当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片以及水洗当归饮片分别用甲醇溶解后，经超声处理、放冷、过滤后，制得对应的供试品溶液，

取阿魏酸对照品，用甲醇溶解后，制得每1ml甲醇溶液中阿魏酸的含量为50μg的对照品溶液，

其中，酒洗当归饮片是以当归药材为原料，经酒洒拌匀，闷润，低温干燥后炮制而成，所述酒为黄酒，当归药材与黄酒的质量比为1：1，酒制当归饮片是以当归药材为原料，经酒洒拌匀，闷润，文火翻炒，放凉后炮制而成，水洗当归饮片是以当归药材为原料，经水洒拌匀，闷润，低温干燥后炮制而成；

（2）将步骤（1）制得的供试品溶液和对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，得到对应的特征图谱，所述高效液相色谱检测条件满足：

液相色谱柱：C18色谱柱，

柱温：30℃，

检测波长：290nm，

流动相A为乙腈，流动相B为0.1磷酸，梯度洗脱过程为：

0～30min，流动相A为10～30%，流动相B为90～70%，

30～45min，流动相A为30～80%，流动相B为70～20%，

45～60min，流动相A为80～95%，流动相B为20～5%；

（3）以步骤（2）中对照品溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的特征图谱。

2.一种当归及其饮片的鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）取待鉴定的当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片，分别制备当归药材、酒洗当归饮片、酒制当归饮片和水洗当归饮片的样品溶液；

（2）将步骤（1）制得的样品溶液，分别进行高效液相色谱检测，即得对应的待鉴别的特征图谱；

（3）将步骤（2）得到的待鉴别的特征图谱，与权利要求1所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对，若待鉴别的特征图谱与之对应的构建得到的特征图谱一致，则鉴别为质量合格。

Images