CN114200052B

CN114200052B - 当归与酒当归的鉴别方法

Info

Publication number: CN114200052B
Application number: CN202111507318.5A
Authority: CN
Inventors: 纪玉华; 魏梅; 孙冬梅; 洪婉敏; 刘涛乾; 蒋海龙; 邱彩月; 林荣楷; 梁志毅
Original assignee: Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangdong Yifang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: CN114200052A

Abstract

本发明提供了一种当归与酒当归的鉴别方法，包括如下步骤：取当归药材与酒当归饮片，分别进行超高效液相色谱分析，构建当归药材的特征图谱与酒当归饮片的特征图谱；取当归药材与酒当归饮片，分别进行色度值测定，获取当归药材的红绿方向色度值a_DG ^*与黄蓝方向色度值b_DG ^*，以及酒当归饮片的红绿方向色度值a_JDG ^*与黄蓝方向色度值b_JDG ^*；取待测物，进行超高效液相色谱分析以及色度值测定，将获得的待测物的图谱与当归药材的特征图谱、酒当归饮片的特征图谱进行比较，将获得的待测物的红绿方向色度值a^*与a_DG ^*、a_JDG ^*进行比较，将获得的待测物的黄蓝方向色度值b^*与b_DG ^*、b_JDG ^*进行比较。

Description

当归与酒当归的鉴别方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种当归与酒当归的鉴别方法。

背景技术

当归为伞形科当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其性温，味甘、辛，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。酒当归为当归的一种常用炮制品，其效活血通经，主要用于经闭痛经、风湿痹痛、跌扑损伤。饮片或炮制品会存在活性成分的差异，造成功效的不同。因此，对同种药材而不同炮制方法所获得的产品进行鉴别，对于提升中药品质具有重要的实际意义。

中药材鉴别方法可分为传统鉴别和现代鉴别，传统鉴别指的是利用人体触觉、嗅觉、味觉、听觉、视觉等感官，包括眼看、口尝、鼻闻、手摸等简便方法，结合水试、火试法判断药材的真伪及质量，是历代中医评价及保证药材品质的主要手段，具有一定的主观性，在中药材鉴别中非常局限。

现代鉴别则结合现代科技，包括理化鉴别、显微鉴别、色谱鉴别等，如高效液相色谱法、红外分光光度法、近红外光谱法、薄层色谱法。利用高效液相色谱鉴别当归与酒当归的方法虽能够将两者区分，但分析时间较长，并且所获得的特征峰差异较小，存在假阳性和假阴性问题，容易导致结论的偏差。

发明内容

基于此，本发明提供了一种当归与酒当归的鉴别方法，其中超高效液相色谱分析法能够获得较多的可鉴别的特征峰，分析时间短，且稳定性、精密度和重现性均良好，同时结合色度值测定，进一步增强了鉴别结果的可信度，避免假阳性和假阴性问题的发生。

本发明通过如下技术方案实现。

一种当归与酒当归的鉴别方法，包括如下步骤：

取当归药材与酒当归饮片，分别进行超高效液相色谱分析，构建所述当归药材的特征图谱与所述酒当归饮片的特征图谱；

取当归药材与酒当归饮片，分别进行色度值测定，获取所述当归药材的红绿方向色度值a_DG ^*与黄蓝方向色度值b_DG ^*，以及所述酒当归饮片的红绿方向色度值a_JDG ^*与黄蓝方向色度值b_JDG ^*；

取待测物，进行超高效液相色谱分析以及色度值测定，将获得的所述待测物的图谱与所述当归药材的特征图谱、所述酒当归饮片的特征图谱进行比较，将获得的所述待测物的红绿方向色度值a^*与a_DG ^*、a_JDG ^*进行比较，将获得的所述待测物的黄蓝方向色度值b^*与b_DG ^*、b_JDG ^*进行比较。

在其中一个实施例中，构建所述当归药材的特征图谱与所述酒当归饮片的特征图谱包括如下步骤：

取尿苷、腺苷、鸟苷、色氨酸与绿原酸对照品，制备第一混合对照品溶液；

取5-羟甲基糠醛、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H与藁本内酯对照品，制备第二混合对照品溶液；

将所述第一混合对照品溶液与所述第二混合对照品溶液分别进行超高效液相色谱测定；

取当归药材与酒当归饮片，分别制备当归供试品溶液与酒当归供试品溶液，然后分别对所述当归供试品溶液与所述酒当归供试品溶液进行超高效液相色谱测定，构建所述当归药材的特征图谱与所述酒当归饮片的特征图谱。

在其中一个实施例中，分别制备当归供试品溶液与酒当归供试品溶液包括如下步骤：

将所述当归药材与30％甲醇混合，进行超声提取，过滤，取滤液，制备所述当归供试品溶液；

将所述酒当归饮片与30％甲醇混合，进行超声提取，过滤，取滤液，制备所述酒当归供试品溶液。

在其中一个实施例中，所述当归药材的特征图谱中特征峰的数量为11；所述酒当归饮片的特征图谱中的特征峰的数量为14；

其中，所述酒当归饮片的特征图谱中，相对保留时间为0.303min～0.309min的特征峰、相对保留时间为0.441min～0.446min的特征峰、相对保留时间为1min的特征峰，以及相对保留时间为1.269min～1.272min的特征峰为鉴别所述当归与所述酒当归的峰。

在其中一个实施例中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液；采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0min～3min，流动相A的体积百分数为0％；3min～5min，流动相A的体积百分数由0％变化至2％；5min～11min，流动相A的体积百分数由2％变化至8％；11min～20min，流动相A的体积百分数由8％变化至30％；20min～21min，流动相A的体积百分数由30％变化至40％；21min～32min，流动相A的体积百分数由40％变化至70％；32min～34min，流动相A的体积百分数由70％变化至100％；34min～34.1min，流动相A的体积百分数由100％变化至0％；34.1min～40min，流动相A的体积百分数为0％。

在其中一个实施例中，超高效液相色谱分析的条件包括：色谱柱为T3色谱柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.25mL/min～0.40mL/min；进样量为1.5μL～2.5μL；波长为260nm～300nm。

在其中一个实施例中，酒当归饮片的制备包括如下步骤：

将当归饮片，加黄酒拌匀，闷透，用文火炒干。

在其中一个实施例中，色度值测定包括如下步骤：

破碎样品，过筛后进行压制，测定。

在其中一个实施例中，色度值测定的条件包括：光源D65，标准观察角10°，照明口径50mm，扫描速度600nm/min，狭缝宽度1nm。

在其中一个实施例中，a_DG ^*为3.42～7.05，b_DG ^*为14.34～18.85；a_JDG ^*为8.49～10.57，b_JDG ^*为18.46～22.95。

与现有技术相比较，本发明的当归与酒当归的鉴别方法具有如下有益效果：

本发明所述的鉴别方法通过采用超高效液相色谱分析技术，获得当归与酒当归之间较多的可鉴别的特征峰，体现为当归特征图谱有11个特征峰，而酒当归特征图谱有14个特征峰，其中酒当归特征图谱中的第2个、第5个、第8个与第12个峰可作为鉴别两者的特征峰。本发明所述的超高效液相色谱法分析时间短，并且稳定性、精密度与重现性均较好；同时结合色彩图像技术，即色度值测定，判断两者存在明显色差，在超高效液相色谱分析方法的基础上进一步增强了鉴别结果的可信度，从而避免出现假阳性和假阴性的问题。

附图说明

图1为本发明实施例提供的10批当归药材UPLC特征图谱；

图2为本发明实施例提供的10批酒当归药材UPLC特征图谱；

图3为本发明实施例提供的当归与酒当归对照特征图谱R；

图4为本发明实施例提供的混合对照品色谱图；其中，1表示尿苷，3表示腺苷，4表示鸟苷，6表示色氨酸，7表示绿原酸；

图5为本发明实施例提供的混合对照品色谱图；其中，5表示5-羟甲基糠醛，8表示阿魏酸，9表示洋川芎内酯I，10表示洋川芎内酯H，14表示藁本内酯；

图6为本发明实施例提供的主成分得分图；

图7为本发明实施例提供的主成分二维载荷图；

图8为本发明实施例提供的OPLS-DA得分图；

图9为本发明实施例提供的OPLS-DA S-plot图；

图10为本发明实施例提供的OPLS-DA的VIP预测值得分图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种当归与酒当归的鉴别方法，包括如下步骤：

取当归药材与酒当归饮片，分别进行超高效液相色谱分析，构建当归药材的特征图谱与酒当归饮片的特征图谱；

取当归药材与酒当归饮片，分别进行色度值测定，获取当归药材的红绿方向色度值a_DG ^*与黄蓝方向色度值b_DG ^*，以及酒当归饮片的红绿方向色度值a_JDG ^*与黄蓝方向色度值b_JDG ^*；

取待测物，进行超高效液相色谱分析以及色度值测定，将获得的待测物的图谱与当归药材的特征图谱、酒当归饮片的特征图谱进行比较，将获得的待测物的红绿方向色度值a^*与a_DG ^*、a_JDG ^*进行比较，将获得的待测物的黄蓝方向色度值b^*与b_DG ^*、b_JDG ^*进行比较。

在一个具体的示例中，构建当归药材的特征图谱与酒当归饮片的特征图谱包括如下步骤：

将第一混合对照品溶液与第二混合对照品溶液分别进行超高效液相色谱测定；

取当归药材与酒当归饮片，分别制备当归供试品溶液与酒当归供试品溶液，然后分别对当归供试品溶液与酒当归供试品溶液进行超高效液相色谱测定，构建当归药材的特征图谱与酒当归饮片的特征图谱。

在一个具体的示例中，制备第一混合对照品溶液包括如下步骤：

取尿苷、腺苷、鸟苷、色氨酸与绿原酸对照品，与30％甲醇混合。

在一个具体的示例中，制备第二混合对照品溶液包括如下步骤：

取5-羟甲基糠醛、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H与藁本内酯对照品，与甲醇混合。

在一个具体的示例中，分别制备当归供试品溶液与酒当归供试品溶液包括如下步骤：

将当归药材与30％甲醇混合，进行超声提取，过滤，取滤液，制备当归供试品溶液；

将酒当归饮片与30％甲醇混合，进行超声提取，过滤，取滤液，制备酒当归供试品溶液。

在一个具体的示例中，当归药材的特征图谱中特征峰的数量为11；酒当归饮片的特征图谱中的特征峰的数量为14；

其中，酒当归饮片的特征图谱中，相对保留时间为0.303min～0.309min的特征峰、相对保留时间为0.441min～0.446min的特征峰、相对保留时间为1min的特征峰，以及相对保留时间为1.269min～1.272min的特征峰为鉴别当归与酒当归的峰。

在一个具体的示例中，超高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液；采用梯度洗脱方式；梯度洗脱方式为：0min～3min，流动相A的体积百分数为0％；3min～5min，流动相A的体积百分数由0％变化至2％；5min～11min，流动相A的体积百分数由2％变化至8％；11min～20min，流动相A的体积百分数由8％变化至30％；20min～21min，流动相A的体积百分数由30％变化至40％；21min～32min，流动相A的体积百分数由40％变化至70％；32min～34min，流动相A的体积百分数由70％变化至100％；34min～34.1min，流动相A的体积百分数由100％变化至0％；34.1min～40min，流动相A的体积百分数为0％。

0.1％甲酸溶液作为流动相时，特征图谱峰信息较丰富，分离效果和响应值优于其他流动相。

在一个具体的示例中，超高效液相色谱分析的条件包括：色谱柱为T3色谱柱；柱温为28℃～32℃；流速为0.25mL/min～0.40mL/min；进样量为1.5μL～2.5μL；波长为260nm～300nm。

在一个具体的示例中，色谱柱选自Waters CORTECS UPLC T3柱。Waters CORTECSUPLC T3柱的分离效果最佳。

可以理解地，在本发明中，柱温包括但不限于28℃、29℃、30℃、31℃、32℃。优选地，柱温为30℃。柱温为30℃时样品分离度较高、峰形对称，能够满足分析要求。

可以理解地，在发明中，流速包括但不限于0.25mL/min、0.26mL/min、0.28mL/min、0.30mL/min、0.32mL/min、0.36mL/min、0.38mL/min、0.40mL/min。优选地，流速选自0.3mL/min。

可以理解地，在本发明中，进样量包括但不限于1.5μL、1.6μL、1.7μL、1.8μL、1.9μL、2.0μL、2.1μL、2.2μL、2.3μL、2.4μL、2.5μL。

可以理解地，在本发明中，波长包括但不限于260nm、265nm、270nm、275nm、280nm、285nm、290nm、295nm、300nm。优选地，波长选自280nm。在280nm左右，当归药材、酒当归饮片样品溶液可以检测到的色谱峰最多，且各色谱峰的峰面积较大。

在一个具体的示例中，酒当归饮片的制备包括如下步骤：

将当归饮片，加黄酒拌匀，闷透，用文火炒干。

在一个具体的示例中，色度值测定包括如下步骤：

破碎样品，过筛后进行压制，测定。

在一个具体的示例中，色度值测定的条件包括：光源D65，标准观察角10°，照明口径50mm，扫描速度600nm/min，狭缝宽度1nm。

在一个具体的示例中，a_DG ^*为3.42～7.05，b_DG ^*为14.34～18.85；a_JDG ^*为8.49～10.57，b_JDG ^*为18.46～22.95。

在一个更为具体的示例中，色度值测定包括如下步骤：

取当归药材，测定明度色度值L_DG ^*、红绿方向色度值a_DG ^*与黄蓝方向色度值b_DG ^*；

取酒当归饮片，测定明度色度值L_JDG ^*、红绿方向色度值a_JDG ^*与黄蓝方向色度值b_JDG ^*；

根据公式ΔE^*＝(ΔL^*2+Δa^*2+Δb^*2)^1/2计算酒当归与当归的色差ΔE^*，其中，ΔL^*＝L_JDG ^*－L_DG ^*，Δa^*＝a_JDG ^*－a_DG ^*，Δb^*＝b_JDG ^*－b_DG ^*；

取待测物，测定色度值明度色度值L^*、红绿方向色度值a^*与黄蓝方向色度值b^*。

在一个具体的示例中，ΔE^*为6.21～16.09。

ΔL^*＝L_JDG ^*－L_DG ^*，Δa^*＝a_JDG ^*－a_DG ^*，Δb^*＝b_JDG ^*－b_DG ^*，分别表示炮制品酒当归与当归药材在明度、红绿、黄蓝的差异，色差ΔE^*＝(ΔL^*2+Δa*²+Δb*²)^1/2用于表达生品到炮制品的总体颜色变化，ΔE^*值越大，代表炮制品与生品色度值相差越大，当ΔE^*为6～12个色差单位(1ΔE^*＝1NBS)时，其色差可被肉眼识别，当色差单位＞12时，则色差显著。由表3可知，ΔE^*范围为6.21～16.09，表明可明显识别同批次酒当归炮制品与当归生品；Δa^*均值为4.55，范围为2.14～6.53，表明当归炮制后红色加深；Δb^*均值为4.15，范围为-0.17～8.56，表明当归炮制后黄色加深。与当归相比，酒当归a^*值、b^*值具有极显著性差异，L^*值不具有显著性差异，说明a^*值、b^*值可用于当归与酒当归的鉴别依据之一。

以下结合具体实施例对本发明的当归与酒当归的鉴别方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。

实施例1

本实施例提供一种当归与酒当归的超高效液相色谱法，具体如下：

一、主要仪器与试剂

H-class型超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；TS7700型分光测色仪(深圳市三恩时科技有限公司)；ME204E型(1/1万)电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；XP26型(1/100万)电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；乙腈(德国默克股份有限公司)、甲酸(佛山西陇化学有限公司)为色谱纯，其他为分析纯。水为超纯水(取自实验室Milli-Q超纯水系统)。

二、酒当归的制备

取当归药材，除去杂质，洗净，润透，切薄片，低温(55℃)干燥，得净当归片。取净当归片，照酒炙法(《中国药典》2020年版通则0213)，置炒制容器内炒干至饮片深黄色或浅棕黄色，略有焦斑，略有酒香气。

三、高效液相色谱分析

1、溶液制备

对照品溶液的制备：取尿苷、腺苷、鸟苷、色氨酸、绿原酸对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含尿苷52.920μg、腺苷58.923μg、鸟苷33.415μg、色氨酸38.162μg、绿原酸37.863μg的混合对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；取5-HMF、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯对照品适量，加甲醇制成每1mL含5-HMF 191.300μg、阿魏酸73.954μg、洋川芎内酯I 29.558μg、洋川芎内酯H 69.338μg、藁本内酯114.268μg的混合对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液的制备：取当归药材(或酒当归)粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加30％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2、色谱条件

Waters CORTECS UPLC T3色谱柱(2.1×150mm，1.6μm)；流动相乙腈(A)-0.1％甲酸(B)，梯度洗脱，0～3min，0％(A)；3～5min，0％～2％(A)；5～11min，2％～8％(A)；11～20min，8％～30％(A)；20～21min，30％～40％(A)；21～32min，40％～70％(A)；32～34min，70％～100％(A)；34～34.1min，100％～0％(A)；34.1～40min，0％(A)；检测波长：280nm；柱温30℃；流速0.3mL/min；进样量2μL。

3、色谱条件的优化

(1)检测波长

分别取当归药材、酒当归饮片粉末约0.5g，精密称定，至具塞锥形瓶中；分别精密加入30％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，称定重量，用30％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液，即得当归供试品溶液与酒当归供试品溶液。所述的甲醇百分含量均为体积百分含量，按上述色谱条件进样分析，记录200～300nm范围内的吸收光谱。

实验结果：在280nm左右，当归药材、酒当归饮片样品溶液可以检测到的色谱峰最多，且各色谱峰的峰面积较大，因此选择280nm为检测波长。

(2)色谱柱

取同一当归药材、酒当归饮片供试品溶液，分别选择常用色谱柱Waters CORTECSUPLC T3(2.1×150mm,1.6μm)、Waters HSS T3(100mm×2.1mm，1.7μm)和Agilent SB(100mm×2.1mm，1.8μm)，按上述色谱条件，进样测定，比较不同色谱柱的分离效果。

实验结果，Waters CORTECS UPLC T3柱和Waters HSS T3柱对样品分离效果较好，基线平稳，Waters CORTECS UPLC T3柱分离效果最佳，最终选择Waters CORTECS UPLC T3色谱柱为当归药材、酒当归饮片特征图谱使用柱。

(3)流动相

取同一当归药材、酒当归饮片试品溶液，分别考察流动项乙腈-0.1％冰醋酸、乙腈-0.1％甲酸、乙腈-0.1％磷酸为洗脱系统，按上述色谱条件进样分析。

实验结果，0.1％甲酸溶液作为流动相时，特征图谱峰信息较丰富，分离效果和响应值优于其他流动相，最终选择0.1％甲酸溶液为流动相。

(4)柱温

取同一当归药材、酒当归饮片供试品溶液，采用同一色谱柱和液相色谱仪，按照上述色谱条件，分别在不同柱温(30℃、35℃、40℃)下进样，记录色谱图。

结果表明，30℃柱温时样品分离度较高、峰形对称，能够满足分析要求，因此选择30℃柱温进行分析。

(5)流速

取当归药材、酒当归饮片供试品溶液，按照上述色谱条件，分别用不同流速(0.25mL/min、0.30mL/min、0.40mL/min)，进样测定，记录色谱图。

结果表明，用上述3种流速对样品进行检测时，不同流速对各色谱峰的分离情况和相对峰面积有一定的影响，但对特征图谱各特征峰的相对保留无显著影响，因此固定流速为0.3mL/min。

4、当归、酒当归UPLC特征图谱的建立

(1)精密度试验：取酒当归供试品(S1)，按上述第1点制备供试品溶液，按上述第2点色谱条件连续进样6次，以峰8(阿魏酸)作为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01％～0.14％，相对峰面积的RSD为0.87％～2.09％，表明仪器精密度良好。

(2)稳定性试验：取酒当归供试品溶液，按上述第2点色谱条件分别在0、2、4、8、12、24h依次进样，以峰8(阿魏酸)作为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01％～0.37％，相对峰面积的RSD为3.15％～4.97％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

(3)重复性试验：取同一批酒当归供试品(S1)6份，按上述第1点制备供试品溶液，按上述第2点色谱条件进样测定，以峰8(阿魏酸)作为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01％～0.12％，相对峰面积RSD为1.75％～4.12％，表明该方法重复性较好。

(4)当归、酒当归UPLC特征图谱的建立：按上述第1点制备10批当归药材供试品溶液和酒当归供试品溶液，进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，建立10批当归、酒当归的特征图谱，经系统自动匹配，生成对照特征图谱(R)。10批当归特征图谱共标定11个共有峰，酒当归特征图谱共标定14个共有峰，通过对照品比对，确定峰1为尿苷，峰3为腺苷，峰4为鸟苷，峰5为5-羟甲基糠醛(5-HMF)，峰6为色氨酸，峰7为绿原酸，峰8为阿魏酸，峰9为洋川芎内酯I，峰10为洋川芎内酯H，峰14为藁本内酯。由结果可知，酒当归特征图谱的峰2、峰5(5-HMF)、峰12由当归药材炮制后产生。

10批当归药材样品中特征峰的保留时间RSD均小于0.6％，符合标准规定。各特征峰的相对峰面积差异较大，RSD值在24.14～73.18％之间，说明不同产地、批次样品所含各成分的相对峰面积比例差异较大，各特征峰的峰面积一定程度上反应不同当归药材样品的质量情况；10批酒当归饮片样品中特征峰的保留时间RSD均小于1％，符合标准规定。各特征峰的相对峰面积差异较大，RSD值在17.49～90.26％之间，说明不同产地、批次样品所含各成分的相对峰面积比例差异较大。

10批当归特征图谱相对保留时间如表1所示，10批当归特征图谱相对峰面积如表2所示，10批酒当归相对保留时间如表3所示，10批酒当归特征图谱相对峰面积如表4所示。色谱峰缺失峰面积以0计。10批当归UPLC特征图谱如图1所示，10批酒当归的UPLC特征图谱如图2所示，当归和酒当归的对照图谱R如图3所示，混合对照品图谱如图4、图5所示。

表1 10批当归特征图谱相对保留时间

表2 10批当归特征图谱相对峰面积

表3 10批酒当归特征图谱相对保留时间

表4 10批酒当归特征图谱相对峰面积

(5)相似度评价：采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件，以对照特征图谱R为参照，10批当归药材样品相似度为0.927～0.999，10批酒当归样品相似度为0.879～0.995，表明10批当归药材、酒当归特征图谱相似度较高，酒当归炮制过程稳定可行。

(6)当归、酒当归特征图谱共有峰峰面积的差异性分析：10批当归、酒当归特征图谱各共有峰的峰面积经标准化处理后，采用SPSS 20.0软件进行配对样本t检验，结果见表5。其中，峰2、峰5(5-HMF)、峰12在当归药材中未检出，为炮制后产生，峰13、峰14(藁本内酯)峰面积不符合正态分布规律，故以上色谱峰采取Mann-Whitney U(二样本)检验。配对样本t检验结果表明，与当归药材相比，酒当归特征图谱共有峰中峰1、峰3、峰6、峰8(阿魏酸)、峰11的峰面积具有极显著性差异，峰4、峰7、峰10的峰面积具有显著性差异，峰9不具有显著性差异。Mann-Whitney U(二样本)检验结果表明，峰2、峰5(5-HMF)、峰12在当归、酒当归组别间有极显著性差异，峰13、峰14(藁本内酯)在当归、酒当归组别间没有统计学差异。炮制后，酒当归中峰1(尿苷)、峰3(腺苷)、峰4(鸟苷)、峰7的峰面积增加，峰6(色氨酸)、峰8(阿魏酸)、峰9(洋川芎内酯I)、峰10(洋川芎内酯H)、峰11、峰13、峰14(藁本内酯)的峰面积降低，峰2、峰5(5-HMF)、峰12在当归药材中未检出，为炮制后产生。因此，峰2、峰5(5-HMF)、峰12可以作为当归生品与炮制品鉴别的特征性指标。

表5当归与酒当归特征图谱共有峰配对样本t检验结果(x±s)

注：与当归药材比较，^＊＊表示P＜0.01，^＊表示P＜0.05。

(7)主成分分析(PCA)：将10批当归药材、酒当归样品各共有峰的峰面积经标准化处理后导入Simca 14.0软件，进行主成分分析(色谱峰缺失的峰面积以0计)，共提取4个主成分，累积方差贡献率为86.6％。第1主成分特征值为7.01，方差贡献率为50.1％，第2主成分特征值为2.93，方差贡献率为20.9％，第3主成分特征值为1.17，方差贡献率为8.32％，第4主成分特征值为1.02，方差贡献率为7.25％。以第1、第2主成分为变量得到二维载荷图，第1主成分变量的权重前五名依次对应峰2、峰1(尿苷)、峰12、峰8(阿魏酸)、峰5(5-羟甲基糠醛)，由此判定峰2、峰1(尿苷)、峰12、峰8(阿魏酸)、峰5(5-羟甲基糠醛)是当归、酒当归主成分的重要组成。主成分分析得分图如图6所示，主成分分析的二维载荷图如图7所示。

(8)正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)：将10批当归药材、酒当归样品各共有峰的峰面积经标准化处理后导入Simca 14.0软件，采用OPLS-DA进行分析，在OPLS-DA得分图中每个点分别代表一个样品，点与点之间的距离代表各个样品之间存在的差异程度。结果表明10批当归、酒当归在OPLS-DA模型中分类聚集明显。其中R²Y为0.965，Q2是0.915，表示该模型拟合程度和预测能力良好。对OPLS-DA二维载荷图和模型中变量的重要度(VIP)进行分析，选择VIP预测值大于1的化学成分作为区分当归生品及炮制品酒当归的重要特征峰，依次为峰2、峰5(5-羟甲基糠醛)、峰14(藁本内酯)、峰8(阿魏酸)，提示这些色谱峰峰面积是影响当归药材和酒当归差异的主要因素。OPLS-DA得分图如图8所示，OPLS-DA S-plot图如图9所示，OPLS-DA的VIP预测值得分图如图10所示。

实施例2

本实施例提供一种当归与酒当归的色度值测定方法，具体如下：

(1)当归、酒当归色度值测定：Lab模式是国际照明委员会(CIE)于1976年公布的一种色彩模式，理论上包括了人眼可见的所有色彩。取10批当归药材、酒当归，破碎，过三号筛，取适量压制于分光测色仪载玻片上，压制厚度约为1mm。测定条件：光源D65，标准观察角10°，照明口径50mm，扫描速度600nm/min，狭缝宽度1nm，经标准白板校正后，平行测定三次取均值，记录色度值L^*(表示明度)、a^*(表示红绿方向，+a^*为红方向，-a^*为绿方向)、b^*(表示黄蓝方向，+b^*为黄方向，-b^*为蓝方向)，按公式E^*＝(L^*2+a^*2+b^*2)^1/2计算样品的总色值，色度值测定结果见表6。

表6当归、酒当归粉末色度值

ΔL^*＝L_JDG ^*－L_DG ^*，Δa^*＝a_JDG ^*－a_DG ^*，Δb^*＝b_JDG ^*－b_DG ^*，分别表示炮制品酒当归与当归药材在明度、红绿、黄蓝的差异，色差ΔE^*＝(ΔL^*2+Δa^*2+Δb^*2)^1/2用于表达生品到炮制品的总体颜色变化，ΔE^*值越大，代表炮制品与生品色度值相差越大，当ΔE^*为6～12个色差单位(1ΔE*＝1NBS)时，其色差可被肉眼识别，当色差单位＞12时，则色差显著。由表6可知，ΔE^*范围为6.21～16.09，表明可明显识别同批次酒当归炮制品与当归生品；Δa^*均值为4.55，范围为2.14～6.53，表明当归炮制后红色加深；Δb^*均值为4.15，范围为-0.17～8.56，表明当归炮制后黄色加深。

(2)当归、酒当归色度值的差异性分析：采用SPSS 20.0软件对当归、酒当归的色度值L^*、a^*、b^*值进行独立样本t检验。结果表明，与当归相比，酒当归a^*值、b^*值具有极显著性差异，L^*值不具有显著性差异，说明a^*值、b^*值可用于当归与酒当归的鉴别依据之一。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：

取待测物，进行超高效液相色谱分析以及色度值测定，将获得的所述待测物的图谱与所述当归药材的特征图谱、所述酒当归饮片的特征图谱进行比较，将获得的所述待测物的红绿方向色度值a^*与a_DG ^*、a_JDG ^*进行比较，将获得的所述待测物的黄蓝方向色度值b^*与b_DG ^*、b_JDG ^*进行比较；

所述构建所述当归药材的特征图谱与所述酒当归饮片的特征图谱包括如下步骤：

取当归药材与酒当归饮片，分别制备当归供试品溶液与酒当归供试品溶液，然后分别对所述当归供试品溶液与酒当归供试品溶液进行超高效液相色谱测定，构建所述当归药材的特征图谱与所述酒当归饮片的特征图谱；

所述制备当归供试品溶液与酒当归供试品溶液包括如下步骤：

将所述当归药材与30%甲醇混合，进行超声提取，过滤，取滤液，制备所述当归供试品溶液；

将所述酒当归饮片与30%甲醇混合，进行超声提取，过滤，取滤液，制备所述酒当归供试品溶液；

所述超高效液相色谱分析的条件包括：色谱柱为T3色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1%的甲酸水溶液；采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0min~3min，流动相A的体积百分数为0%；3min~5min，流动相A的体积百分数由0%变化至2%；5min~11min，流动相A的体积百分数由2%变化至8%；11min~20min，流动相A的体积百分数由8%变化至30%；20min~21min，流动相A的体积百分数由30%变化至40%；21min~32min，流动相A的体积百分数由40%变化至70%；32min~34min，流动相A的体积百分数由70%变化至100%；34min~34.1min，流动相A的体积百分数由100%变化至0%；34.1min~40min，流动相A的体积百分数为0%。

2.根据权利要求1所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，所述当归药材的特征图谱中特征峰的数量为11；所述酒当归饮片的特征图谱中的特征峰的数量为14。

3.根据权利要求1所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，超高效液相色谱分析的条件包括：柱温为28℃~32℃；流速为0.25mL/min~0.40mL/min；进样量为1.5μL~2.5μL；波长为260nm~300nm。

4.根据权利要求3所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，所述超高效液相色谱分析的条件包括：柱温为30℃；流速为0.3mL/min；进样量为2μL；波长为280nm。

5.根据权利要求1所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，酒当归饮片的制备包括如下步骤：

将当归饮片，加黄酒拌匀，闷透，用文火炒干。

6.根据权利要求1所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，色度值测定包括如下步骤：

破碎样品，过筛后进行压制，测定。

7.根据权利要求6所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，所述色度值测定具体步骤为：

取所述当归药材，测定明度色度值L_DG ^*、红绿方向色度值a_DG ^*与黄蓝方向色度值b_DG ^*；

取所述酒当归饮片，测定明度色度值L_JDG ^*、红绿方向色度值a_JDG ^*与黄蓝方向色度值b_JDG ^*；

8.根据权利要求7所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，所述ΔE^*为6.21～16.09。

9.根据权利要求1所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，色度值测定的条件包括：光源D65，标准观察角10°，照明口径50mm，扫描速度600nm/min，狭缝宽度1nm。

10.根据权利要求1所述的当归与酒当归的鉴别方法，其特征在于，a_DG ^*为3.42~7.05，b_DG ^*为14.34~18.85；a_JDG ^*为8.49~10.57，b_JDG ^*为18.46~22.95。