CN108051396A - 一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，包括下列步骤：样本收集，采集已检验合格的心可舒片样品的近红外漫反射光谱；用高效液相色谱法测定样品中有效成分含量作为对照值；建立样品近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型；采集待测样品的近红外漫反射光谱；将特征光谱输入校正模型，计算得到待测样品中丹参素钠等各成分含量值。该方法适用于心可舒片剂及其相关剂型有效成分含量的快速检测，被测样品不需要进行复杂的预处理，与HPLC法相比，可以节省大量的分析时间和样品，是一种方便、快速、无损的绿色分析技术。
Description
技术领域
本发明涉及一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，具体涉及采用近红外光谱法 (NIRS)检测心可舒片中丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、熊果酸、金丝桃苷、木香烃内酯和葛根素等有效成分含量，属于医药检测领域。
背景技术
心可舒片为山东沃华医药科技股份有限公司独家产品，由丹参(以丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B作为指标性成分)、三七(以熊果酸作为指标性成分)、山楂(以金丝桃苷等作为指标性成分)、葛根(以葛根素作为指标性成分)、木香(以木香烃内酯作为指标性成分) 5味中药组成，具有活血化瘀、行气止痛的功效，用于冠心病、心绞痛、高脂血症、脑动脉硬化、中风及中风后遗症等，现已广泛应用于临床。
目前，心可舒制剂的质量控制较为简单，如2015版中国药典中心可舒片标准中主要采用薄层色谱法对其中的化合物进行鉴别，也采用高效液相色谱法(HPLC)对少数几个化合物进行含量测定。然而，现有方法大多比较简单、粗糙，样品处理过程及操作复杂，难以全面反映该复方制剂的质量情况，特别是药典标准中特征图谱项需要近120分钟才能获得完整图谱，分析时间长，严重影响对多批次产品质量的快速检测。因此需要建立一种快速、简便的检测方法。
近红外(near infrared，NIR)光谱分析是近年迅速发展起来的一种快速检测方法，它无需对样品做复杂的预处理即可直接对多种成分含量同时进行测定，具有快速、方便、无污染、非破坏性等优点，已在众多工业领域的过程分析和质量控制中得到应用。
发明内容
本发明采用NIR法对心可舒片剂有效成分含量进行快速检测，可同时监测复方制剂中多个含量指标，省去了常规分析中样品处理等多个繁琐步骤。NIR快速、无损、准确的特征实现了样品含量的快速、及时测定，能够及时发现生产过程的异常情况，以便生产人员及时采取措施，避免更大的损失。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下，一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，包括下列步骤：
(1)样本收集：采集已检验合格的心可舒片样品的近红外漫反射光谱；
(2)用高效液相色谱法测定样品中有效成分含量作为对照值，其中所述有效成分包括：丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、熊果酸、金丝桃苷、木香烃内酯和葛根素；
(3)建立样品近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型；
1)异常样本的剔除；
2)样本集的划分；
3)波段范围建模优化；
4)光谱预处理方法建模优化；
5)校正模型建立；
(4)采集待测样品的近红外漫反射光谱；
(5)将特征光谱输入校正模型，计算得到待测样品中丹参素钠等各成分含量值。
优选的，应用傅立叶变换近红外光谱仪采集心可舒片的近红外漫反射光谱，其采样装置为积分球漫反射测样器件或光纤探头。
优选的，采集心可舒片的近红外漫反射光谱时扫描次数为1～128，分辨率为4～16cm-1，光谱扫描范围10000-4000cm-1，重复实验多次，取平均光谱。
优选的，建模谱段为8700.00～4500.00cm-1。
优选的，优选的建模波段为6400～5800cm-1。
优选的，对光谱进行预处理的方法选自下列方法中的一种或几种：一阶或二阶微分、Norris导数滤波、Savitzky-Golay平滑、多元散射校正、标准正则变换。
优选的，建立心可舒片近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型的方法选自：偏最小二乘回归法、主成分回归法或多元线性回归法。
优选的，在建立校正模型时通过交叉验证确立校正模型的主因子数。
优选的，所述步骤(5)运用偏最小二乘回归法建立心可舒片近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型，通过留一法交叉验证确立主因子数。
优选的，所述测定心可舒片样品的近红外光谱数据的方法可以是直接扫描片剂的近红外光谱图，或将样品粉碎，过筛，取心可舒片粉末，测定其近红外光谱。
本发明的有益效果：
该方法适用于心可舒片剂及其相关剂型有效成分含量的快速检测，被测样品不需要进行复杂的预处理，与HPLC法相比，可以节省大量的分析时间和样品，是一种方便、快速、无损的绿色分析技术。
附图说明
图1不同间隔数下iPLS回归分析直方图；
图2优选的建模波段示意图；
图3浓缩液中丹参素-Na含量模型的RMSECV与主成分数关系图；
图4校正集样品真实值和预测值相关系数图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的目的是提供一种心可舒片剂有效成分含量的快速检测方法，主要包括下述步骤： (1)样本收集：采集已检验合格的心可舒片样品的近红外漫反射光谱；仪器：傅立叶变换近红外光谱仪，采样装置为积分球漫反射测样器件或光纤探头、信号采集及数据处理软件可采用Results信号采集、TQAnalyst数据处理软件或OPUS光谱软件。扫描条件：使用积分球漫反射测样器件或光纤探头进行扫描。扫描样品前，先扫描背景。测试条件：扫描次数1～ 128，分辨率4～16cm-1，光谱扫描范围10000cm-1-4000cm-1，重复扫描多次，取平均光谱。(2) 用高效液相色谱法测定样品中有效成分含量作为对照值，其中所述有效成分包括丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、熊果酸、金丝桃苷、木香烃内酯和葛根素；(3)建立样品近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型；1)异常样本的剔除：对原始光谱进行预处理，消除各种干扰因素引起的光谱偏差；采用Chauvenet检验法和杠杆值与学生化残差值相结合的方法进行异常样本的剔除；2)样本集的划分：采用K-S算法划分校正集和验证集样品；3) 波段范围建模优化：建模谱段为8700.00～4500.00cm-1；4)光谱预处理方法建模优化：选择一阶或二阶微分、Norris导数滤波、Savitzky-Golay平滑、多元散射校正、标准正则变换等方法的一种或多种对原始光谱进行预处理；5)校正模型建立：对样本集近红外光谱数据运用偏最小二乘回归法建立心可舒片样品特征光谱和各成分含量之间的校正模型，其中偏最小二乘回归算法以及建模波段和预处理方法均通过TQ analyst软件实现；(4)采集待测样品的近红外漫反射光谱；取待测的心可舒片成品，按照与校正集样本相同的光谱采集参数采集近红外光谱，(5)将特征光谱输入校正模型，计算得到待测样品中丹参素钠等各成分含量值。
其中，通常应用傅立叶变换近红外光谱仪采集心可舒片的近红外漫反射光谱，其采样装置可使用积分球漫反射测样器件或光纤探头，信号采集及数据处理软件可采用Results信号采集、TQAnalyst数据处理软件或OPUS光谱软件。对原始光谱进行预处理的方法包括但不限于：一阶或二阶微分、Norris导数滤波、Savitzky-Golay平滑、多元散射校正、标准正则变换等。这些方法可以单独使用，也可以多个同时使用，以达到最佳的预处理效果。建立 NIR光谱与心可舒片成分含量之间的校正模型方法包括但不限于：偏最小二乘回归法(PLSR)、主成分回归法(PCR)、多元线性回归法(MLR)等。优选偏最小二乘回归法。通过交叉验证确立模型的主因子数，并评定校正模型的性能评价参数。
本发明的检测方法，其检测条件是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器和试药
Agilent 1260高效液相色谱仪，四元泵、DAD检测器、ALS自动进样器、柱温箱Chem-Station for LC 3工作站；Millipore超纯水器(美国Millipore公司)；Antaris Ⅱ近红外光谱仪(Thermo Fisher公司)，玻璃样品管(内径4mm)，Result光谱采集软件， TQAnalyst化学计量学分析软件(Thermo Fisher公司)，Matlab 2010化学计量学分析软件(MathWorks,USA)；双效浓缩罐。
乙腈、甲醇为色谱纯(Merck,Darmstadt,Germany)，甲酸为色谱纯(Tedia 公司)。丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、熊果酸、金丝桃苷、木香烃内酯和葛根素标准品 (中国食品药品检定研究院)；其余试剂均为分析纯。95％工业酒精，蒸馏水。
2方法
2.1供试品溶液的配制：
取心可舒片，粉碎成细粉，取0.1g，精密称定，置10ml具塞量瓶中，精密加入70％v/v 甲醇水溶液5ml，密塞，称定重量，超声处理20min，取出，放冷，再称定重量，用70％v/v 甲醇水溶液补足减失的重量，离心10min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；
2.2对照品溶液的配制：
取丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品、丹酚酸B对照品、熊果酸对照品、金丝桃苷对照品、木香烃内酯对照品和葛根素对照品适量，精密称定，分别加入70％v/v甲醇水溶液，制成1ml溶液中含50μg丹参素钠、20μg原儿茶醛、100μg丹酚酸B、200μg熊果酸、100 μg金丝桃苷、20μg木香烃内酯和150μg葛根素的7种对照品溶液；
2.2.1指标性成分含量的测定
以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；
以乙腈为流动相A，以0.5％v/v甲酸水溶液为流动相B，并采用下列梯度洗脱方式：0～3min，流动相A的体积百分比为10％～19％，流动相B的体积百分比为90％～81％；3～7min，流动相A的体积百分比为19％～28％，流动相B的体积百分比为81％～72％；7～10min，流动相 A的体积百分比为28％～50％，流动相B的体积百分比为72％～50％；10～13min，流动相A的体积百分比为50％～75％，流动相B的体积百分比为50％～25％；13～16min，流动相A的体积百分比为75％～90％，流动相B的体积百分比为25％～10％；
流速为0.1～0.5ml/min；
柱温为30℃；
检测波长采用下列变化方式：0～1.5min，检测波长为340nm；1.5～13min，检测波长为 287nm；13～16min，检测波长为225nm；
精密吸取7种对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入超高效液相色谱仪，分别测定各种成分的含量。
2.3近红外光谱的采集
采集光谱所用的近红外光谱仪器为美国Thermo Fisher公司生产的AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪；光谱采集范围：4000cm-1-10000cm-1；扫描次数：32；分辨率：8cm-1；利用近红外光谱仪采集60批已检验合格的心可舒片的原始NIR光谱，每个样品重复扫描3次，取平均光谱。
2.4校正集和验证集的划分
采用K-S算法划分校正集和验证集样品。
2.5心可舒样品的近红外光谱
3.3校正集和验证集样品的划分结果
由matlab软件中K-S算法，按校正集：验证集为4:1划分出48个校正集样品和12个验证集样品。
3.4光谱预处理方法的选择
近红外光谱中包含复杂的样品化学信息，在分析过程中，近红外光谱受多种因素的干扰。在建立校正模型之前需要采用化学计量学的方法对光谱作适当的预处理以减少或消除这些影响，改善模型的性能。
以浓缩液中丹参素-Na的含量近红外预测模型的建立为例。近红外光谱采用无处理、一阶微分、二阶微分、SG 5点平滑、SG 7点平滑、SG 9点平滑、SG 11点平滑、SG 13点平滑、一阶微分+SG 5点平滑、一阶微分+SG 7点平滑、一阶微分+SG 9点平滑、一阶微分 +SG11点平滑、一阶微分+SG 13点平滑、一阶微分+SG 15点平滑、二阶微分+SG 5点平滑、二阶微分+SG 7点平滑、二阶微分+SG 9点平滑、二阶微分+SG 11点平滑、二阶微分+SG 13点平滑、二阶微分+SG 15点平滑、一阶微分+Norris 5点平滑、一阶微分+Norris 7点平滑、一阶微分+Norris 9点平滑、一阶微分+Norris 11点平滑、一阶微分+Norris 13 点平滑、一阶微分+Norris 15点平滑的预处理方法得到的结果见表。
表5-2不同预处理方法结果比较
根据上表R、RMSEC、RMSEP、PCs各项指标，可以看出，一阶微分、二阶微分此类预处理方法所处理光谱后，建模效果均不理想，经微分+SG平滑预处理后，RMSEP降低，而RMSEP显著增大，表明模型没有较好的预测能力，一阶微分+Norris平滑预处理后，R、RMSEC、RMSEP值都得到改善，综合考虑各指标，最终选择一阶微分+Norris5点平滑预处理作为最佳光谱预处理方法。
3.5特征光谱区间优化选择
采用iPLS考察不同光谱区间对模型的影响。
将整个谱图划分为10-25个间隔，分别进行考察。如图4所示，A、B、C、
D分别是10、15、20、25个间隔数所得到的iPLS回归分析直方图。d分别是10、15、20、25个间隔数所得到的iPLS回归分析直方图。优选的建模波段示意图见图1,优选波段为6400～5800cm-1。
3.6最优化模型
选用最佳的光谱预处理方法和优选的光谱区间建立PLS模型。用验证集样品对模型性能进行验证。
3.6.1主因子数的选取
在校正集样品一定的情况下，采用不同的主因子数，所建立的PLS回归模型的预测能力会有较大的差异；主因子数太小，会导致用于建模的信息不全，建模预测能力低；而主因子数取得太大是，会使得模型过于付出，出现过拟合的现象。图2为RMSECV随PLS主因子数的变化图，从图中可以看出，丹参素-Na在线测定最佳建模主因子数为6。
3.6.1最优化模型的建立
综合考虑以上考察因素，最终选择在6400～5800cm-1光谱范围内，采用一阶微分+Norris5 点平滑对原始光谱进行预处理，选取最小的RMSECV值对应的主成分数为最佳的主成分数，建立PLS回归模型，采用偏最小二乘回归法交互验证建立PLS回归模型。得到的丹参素钠等成分的建模结果见图4。(A)丹参素钠；(B)葛根素；(C)原儿茶醛；(D)丹酚酸B；(E)金丝桃苷；(F)熊果酸；(G)木香烃内酯；
实施例1
将本发明的方法应用于心可舒片有效成分含量的快速检测：
(1)样本收集：使用AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪采集10批已检验合格的心可舒片的原始NIR光谱，光谱采集范围：4000cm-1-10000cm-1；扫描次数：32；分辨率：8cm-1；每个样品重复扫描3次，取平均光谱。
(2)用高效液相色谱法测定样品中有效成分含量作为对照值，其中所述有效成分包括丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、熊果酸、金丝桃苷、木香烃内酯和葛根素；
供试品溶液的配制：
取心可舒片，粉碎成细粉，取0.1g，精密称定，置10ml具塞量瓶中，精密加入70％v/v 甲醇水溶液5ml，密塞，称定重量，超声处理20min，取出，放冷，再称定重量，用70％v/v 甲醇水溶液补足减失的重量，离心10min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；
对照品溶液的配制：
取丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品、丹酚酸B对照品、熊果酸对照品、金丝桃苷对照品、木香烃内酯对照品和葛根素对照品适量，精密称定，分别加入70％v/v甲醇水溶液，制成1ml溶液中含50μg丹参素钠、20μg原儿茶醛、100μg丹酚酸B、200μg熊果酸、100 μg金丝桃苷、20μg木香烃内酯和150μg葛根素的7种对照品溶液；
指标性成分含量的测定
以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；
以乙腈为流动相A，以0.5％v/v甲酸水溶液为流动相B，并采用下列梯度洗脱方式：0～3min，流动相A的体积百分比为10％～19％，流动相B的体积百分比为90％～81％；3～7min，流动相A的体积百分比为19％～28％，流动相B的体积百分比为81％～72％；7～10min，流动相 A的体积百分比为28％～50％，流动相B的体积百分比为72％～50％；10～13min，流动相A的体积百分比为50％～75％，流动相B的体积百分比为50％～25％；13～16min，流动相A的体积百分比为75％～90％，流动相B的体积百分比为25％～10％；
流速为0.1～0.5ml/min；
柱温为30℃；
检测波长采用下列变化方式：0～1.5min，检测波长为340nm；1.5～13min，检测波长为 287nm；13～16min，检测波长为225nm；
精密吸取7种对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入超高效液相色谱仪，分别测定各种成分的含量。
(3)建立样品近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型；
1)异常样本的剔除：对原始光谱进行预处理，消除各种干扰因素引起的光谱偏差；
2)样本集的划分：采用K-S算法划分划分出8个校正集样品和2个验证集样品校正集和验证集样品；
3)波段范围建模优化：建模波段为6400～5800cm-1；
4)光谱预处理方法建模优化：选择一阶微分+Norris5点平滑对原始光谱进行预处理；
5)校正模型建立：对样本集近红外光谱数据运用偏最小二乘回归法建立心可舒片样品特征光谱和各成分含量之间的校正模型，其中偏最小二乘回归算法以及建模波段和预处理方法均通过TQ analyst软件实现；
(4)采集待测样品的近红外漫反射光谱，方法同建立模型时采集光谱的方法。
(5)将特征光谱输入校正模型，计算得到待测样品中丹参素钠等各成分含量值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)样本收集：采集已检验合格的心可舒片样品的近红外漫反射光谱；
(2)用高效液相色谱法测定样品中有效成分含量作为对照值，其中所述有效成分包括：丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、熊果酸、金丝桃苷、木香烃内酯和葛根素；
(3)建立样品近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型；
1)异常样本的剔除；
2)样本集的划分；
3)波段范围建模优化；
4)光谱预处理方法建模优化；
5)校正模型建立；
(4)采集待测样品的近红外漫反射光谱；
(5)将特征光谱输入校正模型，计算得到待测样品中丹参素钠等各成分含量值。
2.根据权利要求1所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：应用傅立叶变换近红外光谱仪采集心可舒片的近红外漫反射光谱，其采样装置为积分球漫反射测样器件或光纤探头。
3.根据权利要求2所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：采集心可舒片的近红外漫反射光谱时扫描次数为1～128，分辨率为4～16cm-1，光谱扫描范围10000-4000cm-1，重复实验多次，取平均光谱。
4.根据权利要求1所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：建模谱段为8700.00～4500.00cm-1。
5.根据权利要求4所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：优选的建模波段为6400～5800cm-1。
6.根据权利要求1所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：对光谱进行预处理的方法选自下列方法中的一种或几种：一阶或二阶微分、Norris导数滤波、Savitzky-Golay平滑、多元散射校正、标准正则变换。
7.根据权利要求1所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：建立心可舒片近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型的方法选自：偏最小二乘回归法、主成分回归法或多元线性回归法。
8.根据权利要求1所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：在建立校正模型时通过交叉验证确立校正模型的主因子数。
9.根据权利要求1所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(5)运用偏最小二乘回归法建立心可舒片近红外漫反射光谱与其有效成分含量之间的校正模型，通过留一法交叉验证确立主因子数。
10.根据权利要求1所述的一种心可舒片有效成分含量的快速检测方法，其特征在于：
所述测定心可舒片样品的近红外光谱数据的方法可以是直接扫描片剂的近红外光谱图，或将样品粉碎，过筛，取心可舒片粉末，测定其近红外光谱。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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