CN102183590A - 一种心可舒制剂指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药用制剂的检测方法，具体涉及一种中药制剂心可舒指纹图谱的测定方法。本发明主要采用高效液相色谱法检测，色谱柱为PHENOMENEX LUNAC-18柱；流动相：乙腈-0.05％磷酸水，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，检测波长278nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl，理论塔板数按葛根素峰计算不低于2000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在60min内被检测完。
Description
技术领域
本发明涉及以天然植物药材原料制成的心可舒制剂HPLC指纹图谱的构建方法，以及由此法所得到的心可舒制剂HPLC标准指纹图谱。
背景技术
心可舒制剂是由多种天然中药材经精工制作而成的中药复方制剂，现已证明其含有多种生物活性物质。主要成分包括丹参、葛根、三七、木香、山楂。
药理及动物实验证实：心可舒制剂具有活血化瘀，行气止痛之功能，达到增加冠脉流量，改善心肌的供血、供氧，改善左室做功，使心脏的“泵”功能加强而起到显著的治疗作用。冠心病心绞痛的基本病理过程是在冠状动脉痉挛，粥样硬化的基础上发生心肌氧代谢供需失调，供血不足，耗氧量增加是缺血性心脏病的主要因素。理想而有效的治疗药物是以增加冠状动脉血流量的同时又降低心肌耗氧量，在某些状态下降低心肌耗氧尤为重要。而心可舒制剂不但具有以上治疗特性，并对改善心肌的营养状态，增强心肌抗缺血能力，以及对由垂体后叶素引起的心肌缺血有明显的保护作用。通过临床观察治疗结果证实，心可舒制剂治疗冠心病疗效显著，对冠心病心绞痛缩短疗效时间，迅速缓解症状、病情，减轻患者痛苦和经济负担，提高生活质量起到其他抗冠心病心绞痛类药物无法比拟和替代的良好作用。
心可舒制剂对心血管病具有标本兼治的独特作用，重在治本，因此远期疗效尤为突出，随用药持续时间的延长，疗效越加显著，无明显不良反应。对老年慢性病，如糖尿病，高血脂、哮喘及外周血管病变患者无禁忌。心可舒制剂比β受体阻滞剂更适宜冠心病患者长期治疗，克服β受体阻滞剂用药过程中需慎重调整剂量的麻烦，所以是慢性患者长期治疗的新一代广谱高效的血管类药物。
自心可舒制剂上市以来，因其治疗效果好，见效快，价格便宜，受到了广大患者的好评。
随着科技不断创新和发展，发明人又对心可舒制剂做了更加深入的研究，为提高测定心可舒制剂的有效成分及其含量的准确性，本发明提供一种检测更加准确、操作更加便捷、快速的心可舒制剂HPLC指纹图谱的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种心可舒制剂HPLC指纹图谱的测定方法，通过此测定方法，可控制心可舒制剂质量；本发明所述的心可舒制剂可以为：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂等所有口服制剂。
指纹图谱是将供试品和对照品的标准图谱相对照的技术，包括标准图谱的建立和供试品实际测定技术。
本发明的心可舒制剂HPLC指纹图谱的比较测定方法如下：
(1)心可舒制剂供试品溶液的制备：称取本品研燥细粉(液体制剂真空干燥后研细粉)，精密称取0.1g置10ml量瓶中，精密加入70％(v/v)的甲醇5ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，静置放冷，称重，70％甲醇补足减失的重量，离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，即得。
(2)对照品溶液的制备：精密称取原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B适量，加甲醇使溶解，精密称取丹参素钠适量，加30％甲醇使溶解，分别制成对照品溶液；原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B、丹参素钠分别为：原儿茶醛为21μg/ml，葛根素为79μg/ml，大豆苷为50μg/ml，大豆苷元为50μg/ml，丹酚酸B为130μg/ml，丹参素钠为70μg/ml。
(3)心可舒制剂中成分的定性定量测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，进样，用高效液相色谱仪测定，得到色谱图，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积；以定性定量，同时比较供试品的指纹图谱，对照品的指纹图谱和标准指纹图谱；
其中所述高效液相色谱仪中的色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈:磷酸水。磷酸水(％)92～10：乙腈(％)8～90；线性梯度洗脱；T(min)：0～120；柱温10～50℃；检测波长278nm；
其中所述标准指纹图谱用以下方法建立，取10批心可舒制剂的，分别按上述供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，根据检测所得的10批检测数据，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行评价，在278nm检测波长下的相似度大于0.9的图谱为标准指纹图谱；
其中所述标准指纹图谱在278nm检测波长下的指纹图谱具有14个特征峰，其中归属山楂的有2个特征峰；归属丹参的有3个特征峰；归属葛根的有7个特征峰；4号峰为丹参素，5号峰为原儿茶醛，7号峰为葛根素，11号峰为大豆苷，12号峰为丹酚酸B，13号峰为大豆苷元；
一般来说，标准标准指纹图谱和对照品的指纹图谱应重合，该图谱对于同一产品具有唯一性，可以用来判断被测样品中是否含有对照品成分及其含量。
本发明的测定方法，采用高效液相色谱法，其色谱条件优选为：
色谱柱为：
Phenomenex Luna C-18：(4.6×250mm；5μm)；
Agilent Hypersil C-18：(4.6×250mm；5μm)；
Diamonsil C-18：(4.6×250mm；5μm)；
Elite Lichrosorb Rp-18e：(4.6×250mm；5μm)；
Merck Lichrospher Rp-18e：(4.6×250mm；5μm)
柱温：30℃，
流动相：A为乙腈，B为磷酸水，
洗脱方式：梯度洗脱，
流动相流速：1.0ml/min，
进样量：10μl。
其中，所述流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液。
其中，所述梯度洗脱时间为50-100分钟，优选为70-80分钟，进一步优选为75分钟。
优选的，本发明的色谱条件为：
色谱柱：Phenomenex Luna C-18：(4.6×250mm；5μm)，
流动相：乙腈-0.05％磷酸水，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，
洗脱方式：梯度洗脱，
检测波长278nm，
柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl，
理论塔板数按葛根素峰计算不低于50000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在60min内被检测完。
其中，梯度洗脱过程如下：
| 时间(分钟) | 流动相A | 流动相B |
| 0-21 | 8～12％ | 92％～88％ |
| 21-31 | 12％～17％ | 88％～83％ |
| 31-55 | 17～38％ | 83％～62％ |
| 55-65 | 38％～90％ | 62％～10％ |
| 65-75 | 90％ | 10％ |
本发明的测定方法是经过科学的筛选得来的，分别对供试品溶液的制备条件，色谱条件，检测波长和分析时间等条件进行了优选。
其中，供试品溶液制备条件的考察，试验比较了不同提取溶剂如丙酮、乙醇、甲醇的回流提取和索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，结果以70％甲醇超声提取的总体效果为佳。同时还考察了以甲醇为提取溶剂，不同提取时间(10min，20min，30min)的提取效果。结果表明，以70％甲醇为提取溶剂，超声提取20min，提取较为完全，操作方法简便，且方法稳定、重现性好。采用70％甲醇超声提取样品，所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。
其中，色谱条件的选择及优化在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验。结果表明，用乙腈-0.05％磷酸水进行梯度洗脱为佳，色谱峰检测比较全面，锋形尖锐且分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。
其中，检测波长的选择，对200～600nm扫描的各波长下的色谱图进行比较分析，结果278nm处检测的色谱图不仅基线平稳，信息量多，各色谱峰的分离效果很好，峰面积大。因此，选278nm作为检测波长。同时按照试行标准的要求考察了其他波长下的色谱图，其结果显示心可舒制剂在不同波长下的色谱指纹图谱具有很好的相似度。
其中，分析时间的选择在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了2h的色谱行为图。结果表明60min以后基本没有色谱峰出现，同时为了照顾样品的差异性，保证所有样品的特征峰都能够被检出，因此选择75min作为分析时间。
本发明的测定方法与现有方法相比较，检测更加准确，操作更加简便，有效的缩短了检测时间，重现性好和信息量大。
附图说明
图1、心可舒片的色谱指纹图谱
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1、测定方法
本发明的的测定方法包括以下步骤：
(1)心可舒制剂溶液的制备：称取本品研燥细粉(液体制剂真空干燥后研细粉)，精密称取0.1g置10ml量瓶中，精密加入70％(v/v)的甲醇5ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，静置放冷，称重，70％甲醇补足减失的重量，离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，即得。
(2)对照品溶液的制备：精密称取原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B适量，加甲醇使溶解，精密称取丹参素钠适量，加30％甲醇使溶解，分别制成对照品溶液，原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B、丹参素钠分别为：原儿茶醛为21μg/ml，葛根素为79μg/ml，大豆苷为50μg/ml，大豆苷元为50μg/ml，丹酚酸B为130μg/ml，丹参素钠为70μg/ml。
(3)心可舒制剂HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，进样，用高效液相色谱仪测定，以对照品(葛根素)的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，及得到心可舒制剂HPLC指纹图谱；
其中所述高效液相色谱仪中的色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈:磷酸水。磷酸水(％)92～10：乙腈(％)8～90；线性梯度洗脱；T(min)：0～120；柱温10～50℃；检测波长278nm；
在建立心可舒制剂指纹图谱时，取10批以上心可舒制剂的同一剂型，分别按所述供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，根据检测所得的10批以上检测数据，建立心可舒制剂的高效液相图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行评价，在278nm检测波长下的相似度大于0.9；
其中所述心可舒制剂HPLC指纹图谱在278nm检测波长下的指纹图谱有14个主要的特征峰，其中归属山楂的有2个特征峰；归属丹参的有3个特征峰；归属葛根的有7个特征峰，所述的图谱图形如说明书附图中的附图一。
所述的心可舒制剂的构建方法，利用DAD检测器对主要特征峰进行峰纯度检查，通过其UV吸收曲线与对照品的UV吸收曲线及保留时间等的比较确定：
4号峰为丹参素，5号峰为原儿茶醛，7号峰为葛根素，11号峰为大豆苷，12号峰为丹酚酸B，13号峰为大豆苷元；
其中，步骤3)高效液相色谱条件：
色谱柱为Phenomenex Luna C-18柱(4.6×250mm，5μm)(美国Phenomenex公司)；流动相：乙腈-0.05％磷酸水，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液。
洗脱方式：梯度洗脱，检测波长278nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl。理论塔板数按葛根素峰计算不低于50000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在60min内被检测完。其中，流动相线性梯度表：
其中，步骤4)将供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
实施例2、测定方法
1器材与方法
1.1仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器，Agilent EZChrom色谱工作站；METTLER AE240天秤(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HC-3516高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；Milli-Q超纯水系统(Millipore，Bedford，MA，USA)；SENCO，W2018型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；IKARV05基本型1-B旋转蒸发仪(德国IKA集团)；SHB-3A型循环水多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；
1.2试剂甲醇、乙腈为色谱醇(美国Tedia试剂公司)，水为超纯水，其他试剂均为国产分析纯。
1.3对照品
1.4色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C-18柱(4.6×250mm，5μm)(美国Phenomenex公司)；流动相：乙腈-0.05％磷酸水，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液。检测波长278nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl。理论塔板数按葛根素峰计算不低于50000，与其它主要峰的分离度均大于1.0，所有组分均在60min内被检测完。见表1。
表1 指纹图谱流动相线性梯度表
| 时间(分钟) | 流动相A | 流动相B |
| 0-21 | 8～12％ | 92％～88％ |
| 21-31 | 12％～17％ | 88％～83％ |
| 31-55 | 17～38％ | 83％～62％ |
| 55-65 | 38％～90％ | 62％～10％ |
| 65-75 | 90％ | 10％ |
1.5供试品溶液的制备：
取心可舒制剂粉碎至细粉(液体制剂减压真空干燥后粉碎)过60目筛，取约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入70％甲醇5ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，离心(3000r/min)10min，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
1.6对照品溶液的制备：
精密称取原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B适量，加甲醇使溶解，精密称取丹参素钠适量，加30％甲醇使溶解，分别制成对照品溶液，原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B、丹参素钠浓度分别为：原儿茶醛为21μg/ml，葛根素为79μg/ml，大豆苷为50μg/ml，大豆苷元为50μg/ml，丹酚酸B为130μg/ml，丹参素钠为70μg/ml。
1.7检测方法的验证
1.7.1滞后峰检测：为了验证最佳线性梯度洗脱程序是否能较全面的检出制剂中的化学成分，延长测试时间至2.5小时，即：在最有的梯度条件下的梯度运行时间变为原来的两倍，即记录时间为150min，结果65分钟之后未见滞后峰出现。说明最佳线性梯度洗脱程序能较为全面的检出心可舒制剂中的化学成分。
1.7.2专属性试验：空白试验用按处方比例制备的含淀粉、滑石粉、硬脂酸镁、聚乙二醇等在70％甲醇溶液处理进样分析，结果空白没有干扰峰。
1.7.3仪器精密度实验
取批号为100912的心可舒片，按正文方法(指按本发明技术方案中所述的方法，下同)制备供试品溶液，连续进样6次测定，测定结果见表2、3。
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(峰面积2％以上)的峰面积基本一致(RSD小于3％)又以第一次进样所得指纹图谱作为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后6次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求。
表2心可舒制剂液相指纹图谱精密度考察结果
(主要峰的相对保留时间)
| 1针 | 2针 | 3针 | 4针 | 5针 | 6针 | |||
| 3 | 0.2972 | 0.2970 | 0.2971 | 0.2971 | 0.2970 | 0.2971 | 0.2971 | 0.03 |
| 4 | 0.3211 | 0.3206 | 0.3209 | 0.3207 | 0.3209 | 0.3208 | 0.3209 | 0.05 |
| 5 | 0.6310 | 0.6310 | 0.6312 | 0.6311 | 0.6311 | 0.6311 | 0.6311 | 0.02 |
| 6 | 0.6815 | 0.6806 | 0.6815 | 0.6815 | 0.6815 | 0.6814 | 0.6813 | 0.05 |
| 7(S) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| 9 | 1.0954 | 1.0951 | 1.0950 | 1.0947 | 1.0946 | 1.0949 | 1.0949 | 0.03 |
| 10 | 1.1342 | 1.1357 | 1.1352 | 1.1352 | 1.1349 | 1.1353 | 1.1351 | 0.04 |
| 11 | 1.2962 | 1.2978 | 1.2974 | 1.2975 | 1.2969 | 1.2977 | 1.2973 | 0.05 |
| 12 | 1.9465 | 1.9529 | 1.9508 | 1.9511 | 1.9501 | 1.9520 | 1.9506 | 0.11 |
| 13 | 1.9864 | 1.9923 | 2.0000 | 1.9900 | 1.9887 | 1.9903 | 1.9903 | 0.10 |
| 14 | 2.0205 | 2.0268 | 2.0254 | 2.0246 | 2.0235 | 2.0252 | 2.0252 | 0.10 |
表3心可舒制剂液相指纹图谱精密度考察结果
(主要峰的相对峰面积)
以上结果表明，Agilent 1200液相色谱仪的精密度良好。
1.7.2样品的稳定性实验
取批号为100923的心可舒片，按正文方法制备供试品溶液，分别于0h/2h/4h/8h/12h/24时考察稳定性，共测得7次，测定结果见表4、5。结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(峰面积大于2％以上)的峰面积基本一致(RSD＜3％)，又以第一次进样所得指纹图谱作为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后6次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度符指纹图谱的技术要求。
表4心可舒制剂液相指纹图谱稳定性考察结果
(主要峰的相对保留时间)
表5心可舒制剂液相指纹图谱稳定性考察结果
(主要峰的相对保留时间)
| 7(S) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| 9 | 0.2203 | 0.2229 | 0.2225 | 0.2222 | 0.2227 | 0.2228 | 0.2229 | 0.2223 | 0.415 |
| 10 | 0.1350 | 0.1356 | 0.1348 | 0.1356 | 0.1357 | 0.1361 | 0.1344 | 0.1353 | 0.446 |
| 11 | 0.2287 | 0.2302 | 0.2301 | 0.2312 | 0.2320 | 0.2310 | 0.2334 | 0.2309 | 0.639 |
| 12 | 0.2150 | 0.2162 | 0.2161 | 0.2155 | 0.2146 | 0.2132 | 0.2138 | 0.2149 | 0.052 |
| 13 | 0.0959 | 0.0969 | 0.0965 | 0.0961 | 0.0961 | 0.0951 | 0.0945 | 0.0959 | 0.844 |
| 14 | 0.1531 | 0.1546 | 0.1545 | 0.1551 | 0.1559 | 0.1561 | 0.1559 | 0.1550 | 0.680 |
以上结果表明，供试品在24小时内测定是稳定的。
1.7.3方法重复性实验
取批号为100812的心可舒片，按正文方法平行制备5份供试品溶液，依法测定，测定结果见表6、7。
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(在中峰面积2％以上)的峰面积基本一致(RSD＜3％)，又以第一份供试品溶液所得指纹图谱作为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后4份供试品溶液所得指纹图谱的相似度结果相似度均符合指纹图谱的技术要求
表6、心可舒制剂液相指纹图谱重现性考察结果
(主要峰的相对保留时间)
| 14 | 2.0247 | 2.0275 | 2.0301 | 2.0402 | 2.0381 | 2.0321 | 0.332 |
表7心可舒制剂液相指纹图谱精密度考察结果
(主要峰的相对峰面积)
以上方法学考察结果表明，用本法测定心可舒片的指纹图谱，样品稳定性、仪器精密度、方法重复性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。
1.8心可舒制剂标准指纹图谱的获得及相似度限度的确定
1.8.1十二批大生产成品的测定和标准指纹图谱的获得
十二批成品均有山东沃华医药科技股份有限公司生产，批号分别为：090509、090515、090510、090511、100429、090407、090404、100648、101065、100423、090403、100536。
按正文方法制备供试品溶液，依法测定，十二批成品的液相指纹图谱叠加图谱；用中药色谱指纹图谱相似度评价系统以这十二批成品指纹图谱为基础获得的标准指纹图谱；手动或使用软件计算标准指纹图谱。
1.8.2心可舒片相似度限定的确定
以相似度计算软件生产的心可舒片标准液相指纹图谱为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算每批成品指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.9(见表8)。根据大生产实际，为了有效、全面控制产品质量，规定心可舒片指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算，相似度应大于0.90.
表8、十二批心可舒片指纹图谱相似度考察结果
| 批号 | 相似度 |
| 090509 | 0.995 |
| 090515 | 0.967 |
| 090510 | 0.978 |
| 090511 | 0.988 |
| 100429 | 0.993 |
| 090407 | 0.965 |
| 090404 | 0.959 |
| 100648 | 0.981 |
| 101065 | 0.972 |
| 100423 | 0.964 |
| 090403 | 0.985 |
| 100536 | 0.997 |
实施例3、心可舒片
【处方】葛根600g，山楂600g，丹参600g，三七40g，木香40g
【制法】1/3山楂、三七、木香粉碎成细粉，其余山楂、葛根加60％乙醇温浸30分钟后，加热回流提取二次，第一次2.5小时，第二次2小时，合并醇提液，减压回收乙醇，滤过，滤液备用；丹参加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎煮液，滤过，将上述滤液与煎煮液混合均匀，浓缩至相对密度1.24～1.26(75℃～80℃测)。将浸膏与细粉混匀，制成颗粒，干燥，压片，包衣，即得。
实施例4、心可舒胶囊
【处方】山楂 葛根 丹参 三七 木香
【制法】以上五味，取三七、木香粉碎成细粉，山楂、葛根加60％乙醇温浸30分钟后，加热回流提取二次，第一次2.5小时，第二次2小时，合并醇提液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.35(20℃)；丹参加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎煮液，滤过，浓缩至相对密度1.35(20℃)；将上述两种稠膏于80℃下干燥，粉碎成细粉与三七、木香细粉混匀，制成颗粒，干燥，分装成1000粒，即得。
参见：心可舒胶囊收载于中药部颁标准15册。
Claims (10)
1.一种心可舒制剂指纹图谱的测定方法，其特征包括以下步骤：
(1)心可舒制剂供试品溶液的制备：称取本品研燥细粉(液体制剂真空干燥后研细粉)，精密称取0.1g置10ml量瓶中，精密加入70％(v/v)的甲醇5ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，静置放冷，称重，70％甲醇补足减失的重量，离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，即得；
(2)对照品溶液的制备：精密称取原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B适量，加甲醇使溶解，精密称取丹参素钠适量，加30％甲醇使溶解，分别制成对照品溶液；原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B、丹参素钠分别为：原儿茶醛为21μg/ml，葛根素为79μg/ml，大豆苷为50μg/ml，大豆苷元为50μg/ml，丹酚酸B为130μg/ml，丹参素钠为70μg/ml；
(3)心可舒制剂中成分的定性定量测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，进样，用高效液相色谱仪测定，得到色谱图，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积；同时比较供试品的指纹图谱，对照品的指纹图谱和标准指纹图谱；
其中所述高效液相色谱仪中的色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈:磷酸水，磷酸水(％)92～10：乙腈(％)8～90；线性梯度洗脱；T(min)：0～120；柱温10～50℃；检测波长278nm；
其中所述标准指纹图谱用以下方法建立，取10批心可舒制剂的，分别按上述供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，根据检测所得的10批检测数据，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行评价，在278nm检测波长下的相似度大于0.9的图谱为标准指纹图谱；
其中所述标准指纹图谱在278nm检测波长下的指纹图谱具有14个特征峰，其中归属山楂的有2个特征峰；归属丹参的有3个特征峰；归属葛根的有7个特征峰；4号峰为丹参素，5号峰为原儿茶醛，7号峰为葛根素，11号峰为大豆苷，12号峰为丹酚酸B，13号峰为大豆苷元。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱为：Phenomenex Luna C-18柱，(250×4.6mm，5μm)，
柱温：30℃，
流动相：A为乙腈，B为磷酸水，
洗脱方式：梯度洗脱，
流动相流速：1.0ml/min，
进样量：10μl。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液。
4.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱时间为50-100分钟。
5.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱时间为70-80分钟。
6.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程为：
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱为Phenomenex Luna C-18柱，(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸水，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，洗脱方式：梯度洗脱，检测波长278nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl，理论塔板数按葛根素峰计算不低于50000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在60min内被检测完，
其中，梯度洗脱过程如下：
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液，
(2)制备对照品溶液，
(3)取上述溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图，
(4)比较上述溶液的色谱图，即可，
其中，步骤1)供试品溶液的制备：
取心可舒片粉碎至细粉约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入70％甲醇5ml，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，离心10min，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得，
其中，步骤2)对照品溶液的制备：
精密称取原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B适量，加甲醇使溶解，精密称取丹参素钠适量，加30％甲醇使溶解，分别制成对照品溶液：原儿茶醛、葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸B、丹参素钠分别为21μg/ml，葛根素为79μg/ml，大豆苷为50μg/ml，大豆苷元为50μg/ml，丹酚酸B为130μg/ml，丹参素钠为70μg/ml，
其中，步骤3)高效液相色谱条件：
色谱条件色谱柱为Phenomenex Luna C-18柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸水，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，洗脱方式：梯度洗脱，检测波长278nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl，理论塔板数按葛根素峰计算不低于2000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在60min内被检测完，其中，梯度洗脱过程如下：
其中，步骤4)将供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱进行比对。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，选择75min作为图谱的分析时间。
10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中心可舒制剂可以为：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂等所有口服制剂。
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