CN107688061A - 一种抗炎消毒胶囊的指纹图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提供一种抗炎消毒胶囊的指纹图谱。用高效液相色谱法检测抗炎消毒胶囊的多指标成分，构建具有16个特征峰的色谱图，以6号峰作为参比峰，以计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。通过对抗炎消毒胶囊的指纹图谱的构建，提供一种有效可靠的抗炎消毒胶囊的质量控制方法及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种抗炎消毒胶囊的指纹图谱的构建方法。
背景技术
炎症主要有细菌、病毒引起，表现为发热、头痛、咽喉痛、肌肉酸痛、周身关节痛等。我国传统中医、中药能够做到标本兼治，全面调节炎症发生的各个环节。根据民间植物抗炎药开发出了抗炎消毒胶囊，由山银花、野菊花、穿心莲、肿节风等药材组成，临床效果显著。
国际社会对药品的要求是“安全、有效、可控”。现行的中药质量标准，对中成药的质量控制是以传统的性状鉴别和显微鉴别确定真伪，以理化鉴别评价优劣，少数药味对其1～2个指标成分进行检测和控制。从传统中医药观点来看，检测任何一种活性成分均不能反映复方制剂所体现的整体疗效，中医辨证施治用的是药味而非某个化学成分。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，采用“共有峰”的方式来判断相似程度从而达到控制目的。可利用指纹图谱表达成品的质量、实现对工艺操作和原药材的质控；也可利用指纹追根溯源来寻找工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。
中药指纹图谱是指某种或几种中药材中所共有的，具有特征性的某类成分的色谱或光谱的图谱。当前，中药指纹图谱质量控制技术作为控制中药质量均一性和稳定性的检测手段，是中药现代化的关键技术之一，这对有效地控制中药材的质量有重要意义。色谱指纹图谱质量控制技术是当前中药质量研究的亮点。对于成份复杂的中药，过去那种以单一有效成分作为其质量控制指标的做法是不全面的，用“盲人摸象”做比喻是再贴切不过的了。而色谱指纹图谱质量控制模式则以色谱分析为手段，从中获取反映中药内在质量的信息，通过对指纹特征的分析比较，评价中药内在质量的真实性、一致性和稳定性，这是现阶段综合评价中药质量的最优技术，国家药品监督管理局已要求中药制剂实施指纹图谱质量控制。据报道，日本汉方药主要生产企业在于20世纪80年代就已经在企业内部采用液相指纹图谱控制质量，美国、德国、法国等国家亦对植物草药采用指纹图谱质量控制技术。随着中医中药的推广应用，指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已为国际所共识。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，通过对抗炎消毒胶囊的指纹图谱的构建方法的研究，提供一种有效可靠的抗炎消毒胶囊的质量控制方法及其应用。通过对指纹图谱的多个指标成分进行分析，表达更丰富的化学组成，将中药指纹图谱的整体特征和成分特异性统一起来，进一步扩展和规范指纹图谱在中药领域中的应用。
本发明的技术方案如下所述：本发明所述抗炎消毒胶囊的指纹图谱，用高效液相色谱法检测抗炎消毒胶囊的多指标成分，构建具有16个特征峰的色谱图，以6号峰作为参比峰计算，所述共有峰的相对保留时间分别为：1号峰0.28-0.29，2号峰0.47-0.49，3号峰0.63-0.64，4号峰0.79-0.80，5号峰0.92-0.93，6号峰1.000，7号峰1.01-1.02，8号峰1.12-1.13，9号峰1.19-1.20，10号峰1.43-1.45，11号峰1.47-1.48，12号峰1.52-1.55，13号峰1.57-1.59，14号峰1.63-1.65，15号峰1.89-1.92，16号峰2.77-2.78。
所述的1、11号峰为肿节风特征峰，16号峰为穿心莲特征峰，3、10、12、15号峰为野菊花特征峰，5、9号峰为山银花特征峰，8号峰为肿节风与野菊花共有特征峰，2、4、6、7、13、14号峰为四味药材共有特征峰。
所述的6号峰为绿原酸，10号峰为木犀草苷、11号峰为异嗪皮啶、16号峰为脱水穿心莲内酯。
以6号峰作为参比峰计算，所述共有峰的相对峰面积分别为：1号峰0.120-0.147，2号峰0.094-0.105，3号峰0.135-0.151，4号峰0.190-0.218，5号峰0.076-0.108，6号峰1.000，7号峰0.178-0.189，8号峰0.124-0.139，9号峰0.188-0.201，10号峰0.072-0.080，11号峰0.068-0.104，12号峰0.134-0.148，13号峰0.690-0.742，14号峰0.519-0.564，15号峰0.078-0.082，16号峰0.037-0.049。
所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；进样量20μL，检测波长254nm。
所述高效液相色谱法采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.4％的磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式；
所述梯度洗脱方式为：0-20min，流动相A的体积百分数由1％变化至25％；20-35min，流动相A的体积百分数由25％变化至35％；35-50min，流动相A的体积百分数由35％变化至90％。
所述高效液相色谱法还包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：称取抗炎消毒胶囊样品内容物2g，置25ml容量瓶中，加50％甲醇15-20ml，超声处理20-40分钟，放冷，用50％甲醇加至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)混合对照品溶液的制备：精密精密称取绿原酸、木犀草苷、异嗪皮啶、脱水穿心莲内酯各2-10mg，分别置10mL容量瓶中，加50％甲醇制成对照品储备液；依次吸取5ml、1ml、1ml、1ml、1ml，置25mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)HPLC指纹图谱的测定：吸取供试品溶液、对照品溶液各20ul，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，即得到抗炎消毒胶囊HPLC指纹图谱；
本发明还公开了利用上述抗炎消毒胶囊的指纹图谱在抗炎消毒胶囊或其浸膏半成品检测中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明建立了抗炎消毒胶囊指纹图谱技术标准，通过指纹图谱中共有峰的有无及特征，有效地全面监控半成品和成品的质量，监控生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。
(2)本发明建立基于多指标成分的抗炎消毒胶囊质量标准，可精确控制与评价抗炎消毒胶囊的质量。通过色谱指纹特征相似程度的比较，评价优劣、考察稳定性和一致性，弥补了现行质量控制方法的不足。
(3)本发明提高了抗炎消毒胶囊成品、半成品的质量监控标准，有效的避免了产品伪造，保证该品种的正常生产、流通秩序。
(4)本发明的方法还具有良好的可行性、稳定性和重现性。
附图说明
图1为混合对照品HPLC色谱图；
图2为10批供试品HPLC色谱叠加图；
图3为抗炎消毒胶囊HPLC指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体说明本发明。
实施例1
实例一：抗炎消毒胶囊的指纹图谱的构建方法
1、实验仪器与材料
LC‐10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津)；
色谱柱(phenomenex Synergi Fusion-RP C18(250mm×4.6mm，4um)色谱柱)；
乙腈(色谱纯)；
甲醇(分析纯)；
磷酸(分析纯)；
氨水(分析纯，25％-28％)；
对照品：绿原酸、木犀草苷、异嗪皮啶、脱水穿心莲内酯对照品；
供试品：抗炎消毒胶囊样品。
2、色谱条件
phenomenex Synergi Fusion-RP C18(250mm×4.6mm，4um)色谱柱；以乙腈(A)-0.4％磷酸溶液(B)为流动相，流速1.0mL·min-1，采用梯度洗脱：0→20min，流动相A的体积占比由1％提升25％；20→35min，流动相A的体积占比由25％提升35％；35→50min，流动相A的体积占比由35％提升90％。检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：20μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000。
3、试验方法与结果
3.1对照品溶液的制备称取绿原酸、木犀草苷、异嗪皮啶、脱水穿心莲内酯各2-10mg，分别置10mL容量瓶中，加50％甲醇制成对照品储备液；依次吸取5ml、1ml、1ml、1ml、1ml，置25mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
3.2供试品溶液的制备称取抗炎消毒胶囊样品内容物2g，置25ml容量瓶中，加50％甲醇15-20ml，超声处理20-40分钟，放冷，用50％甲醇加至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.3方法学考察
3.3.1精密度试验取抗炎消毒胶囊样品1份，按“3.2”项下供试品溶液的制备方法处理得供试品溶液，分别吸取该供试品溶液，连续进样20uL6次，按“2、”项下色谱条件测定，记录指纹图谱，以绿原酸色谱峰(指纹图谱中6号峰)为参比峰，计算指纹图谱中个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果所有共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明方法精密度良好。
3.3.2重复性试验取同一批抗炎消毒胶囊样品，按“3.2”项下供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液6份，分别吸取进样20uL，按“2、”项下色谱条件测定，记录指纹图谱，以绿原酸色谱峰(指纹图谱中6号峰)为参比峰，计算指纹图谱中个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果所有共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明方法重现性良好。
3.3.3稳定性试验取“3.3.1”项下供试品溶液，分别在0、3、6、9、12小时进样20uL，按“2、”项下色谱条件测定，记录指纹图谱，以绿原酸色谱峰(指纹图谱中6号峰)为参比峰，计算指纹图谱中个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果所有共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，表明供试品溶液在12小时内稳定。
3.4指纹图谱的测定取10批抗炎消毒胶囊样品各1份，按“3.2”项下供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液。吸取对照品溶液、10批供试品溶液各20ul，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到液相色谱图，见图1、图2。
通过与对照品比较确定，绿原酸、木犀草苷、异嗪皮啶、脱水穿心莲内酯分别对应6、10、11、16号色谱峰。其中，绿原酸峰峰面积较大且稳定，选定为参比峰(S)。
样品指纹图谱色谱峰的归属：1、11号峰为肿节风特征峰，16号峰为穿心莲特征峰，3、10、12、15号峰为野菊花特征峰，5、9号峰为山银花特征峰，8号峰为肿节风与野菊花共有特征峰，2、4、6、7、13、14号峰为四味药材共有特征峰。
采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A版)分析，以6号峰为参比确定16个共有峰构成抗炎消毒胶囊指纹图谱的特征峰，得到抗炎消毒胶囊HPLC标准指纹图谱，见图3。10批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别见表1、表2。
如图3所示，抗炎消毒胶囊指纹图谱中，共有16个共有峰，以6号峰作为参比峰计算，所述共有峰的相对保留时间分别为：1号峰0.290，2号峰0.484，3号峰0.644，4号峰0.802，5号峰0.933，6号峰1.000，7号峰1.021，8号峰1.129，9号峰1.202，10号峰1.45，11号峰1.481，12号峰1.527，13号峰1.588，14号峰1.651，15号峰1.915，16号峰2.775。
如图3所示，抗炎消毒胶囊指纹图谱中，共有16个共有峰，以6号峰作为参比峰计算，所述共有峰的相对峰面积分别为：1号峰0.137，2号峰0.099，3号峰0.144，4号峰0.199，5号峰0.107，6号峰1.000，7号峰0.184，8号峰0.130，9号峰0.196，10号峰0.077，11号峰0.074，12号峰0.143，13号峰0.714，14号峰0.543，15号峰0.079，16号峰0.040。
表1 10批抗炎消毒胶囊共有峰的相保留时间
表2 10批抗炎消毒胶囊共有峰的相对峰面积
Claims (8)
1.一种抗炎消毒胶囊的指纹图谱，其特征在于：用高效液相色谱法检测抗炎消毒胶囊的多指标成分，构建具有16个特征峰的色谱图，以6号峰作为参比峰计算，所述共有峰的相对保留时间分别为：1号峰0.28-0.29，2号峰0.47-0.49，3号峰0.63-0.64，4号峰0.79-0.80，5号峰0.92-0.93，6号峰1.000，7号峰1.01-1.02，8号峰1.12-1.13，9号峰1.19-1.20，10号峰1.43-1.45，11号峰1.47-1.48，12号峰1.52-1.55，13号峰1.57-1.59，14号峰1.63-1.65，15号峰1.89-1.92，16号峰2.77-2.78。
2.如权利要求1所述的指纹图谱，其特征在于： 1、11号峰为肿节风特征峰，16号峰为穿心莲特征峰，3、10、12、15号峰为野菊花特征峰，5、9号峰为山银花特征峰，8号峰为肿节风与野菊花共有特征峰，2、4、6、7、13、14号峰为四味药材共有特征峰。
3.如权利要求2所述的指纹图谱，其特征在于：所述的6号峰为绿原酸，10号峰为木犀草苷、11号峰为异嗪皮啶、16号峰为脱水穿心莲内酯。
4.如权利要求1所述的指纹图谱，其特征在于：以6号峰作为参比峰计算，所述共有峰的相对峰面积分别为：1号峰0.120-0.147，2号峰0.094-0.105，3号峰0.135-0.151，4号峰0.190-0.218，5号峰0.076-0.108，6号峰1.000，7号峰0.178-0.189，8号峰0.124-0.139，9号峰0.188-0.201，10号峰0.072-0.080，11号峰0.068-0.104，12号峰0.134-0.148，13号峰0.690-0.742，14号峰0.519-0.564，15号峰0.078-0.082，16号峰0.037-0.049。
5.如权利要求1-4任何一项所述的指纹图谱，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；进样量20μL，检测波长254nm。
6.如权利要求5所述的指纹图谱，其特征在于：
所述高效液相色谱法采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度 0.4％的磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式；
所述梯度洗脱方式为：0-20min，流动相A的体积百分数由1％变化至25％； 20-35min，流动相A的体积百分数由25％变化至35％；35-50min，流动相A的体积百分数由35％变化至90％。
7.如权利要求6所述的指纹图谱，其特征在于，所述高效液相色谱法还包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：称取抗炎消毒胶囊样品内容物2g，置25ml容量瓶中，加50%甲醇15-20ml，超声处理20-40分钟，放冷，用50%甲醇加至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（2）混合对照品溶液的制备：精密精密称取绿原酸、木犀草苷、异嗪皮啶、脱水穿心莲内酯各2-10mg，分别置10mL容量瓶中，加50%甲醇制成对照品储备液；依次吸取5ml、1ml、1ml、1ml、1ml，置25mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
（3）HPLC指纹图谱的测定：吸取供试品溶液、对照品溶液各20ul，分别注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，以对照品的色谱峰相对保留时间和峰面积为1，计算供试品的相对保留时间和相对峰面积，即得到抗炎消毒胶囊HPLC指纹图谱。
8.如权利要求1-7任何一项所述的指纹图谱在抗炎消毒胶囊或其浸膏半成品检测中的应用。
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