CN111721880B

CN111721880B - 一种双柱串联hplc-ms肿节风指纹图谱建立方法

Info

Publication number: CN111721880B
Application number: CN202010624253.1A
Authority: CN
Inventors: 刘旭海; 熊静; 邓攀; 朱明辉; 钟志坚; 张细和; 董文; 黄素荣; 李德安; 张礼仲; 陈小荣
Original assignee: Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangzhong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: CN111721880A

Abstract

本发明提供一种双柱串联液相色谱‑质谱联用（HPLC‑MS）肿节风的对照指纹图谱及其构建方法，所述方法包括以下步骤：步骤1，精密称取肿节风药材粉末（3号筛），加入甲醇，超声，过滤，定容，所得溶液即为供试品溶液；步骤2，将供试品溶液注入高效液相色谱‑质谱联用仪，测定，记录谱图相关信息；步骤3，将所得谱图与肿节风药材对照指纹图谱，两者符合，为合格品。本发明所建立指纹图谱分析方法分离度高、信息量大、辨别力强，可以运用于肿节风药材的质量控制过程。

Description

一种双柱串联HPLC-MS肿节风指纹图谱建立方法

技术领域

本发明涉及一种双柱串联液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）肿节风的对照指纹图谱及其构建方法和应用，属于中药检测技术领域。

背景技术

草珊瑚，又名九节花、骨风消、九节兰等，属金粟兰科植物，其干燥地上部分称之为九节茶，干燥全草称之为肿节风。肿节风清热凉血，活血消斑，祛风通络，具有抗炎、抗肿瘤等多重功效，有“中药抗生素”之美誉，同时还具有类人参的机体免疫调节功能。肿节风及其制剂毒副作用小，临床安全性极佳，可运用于急性扁桃体炎、病毒性肝炎、骨折、类风湿性关节炎等诸多疾病的治疗。

肿节风药材化学成分丰富，生物活性多，药理作用广泛，在复方草珊瑚含片、血康口服液、新癀片等多种中药制剂中均有运用，全国以肿节风为原料生产中成药的厂家已有50余家，产值达数亿元。近年来，国内外对于肿节风的有效成分及其药理作用进行了大量的实验研究，取得了丰硕的研究成果，这也在一定程度上加速了肿节风的产业化运用。

“药材好，药才好”，这是中药制药人普遍的共识。然而，近年来我国中药材产地及种源混乱，药材质量不断下降，中药材掺假、掺杂、染色、熏硫、重金属、农残等问题越演愈烈，中药材质量已经成为严重制约中药行业发展的羁绊。2015版《中华人民共和国药典》一部是目前国内各类中药材的主要质量检测依据，其常规指标主要包括性状、显微及薄层鉴别等一般常规内容，此外部分药材还会借鉴西药的方式，选定1~2个化学成分或（和）一类化学组分进行含量测定。药典中规定的这些检测指标信息不够全面，并不能全面反映药材的药用信息，特别是中药材的疗效优劣。长期以来对于中药基础化学研究的不足，使得国人现今仍对许多中药材的关键有效成分缺乏了解，中药材的运用很多时候还只是建立在经验研究的基础之上，这也直接影响到了中药材的规范化质量控制。

指纹图谱技术是目前国际公认的草药制剂质量控制技术，美国、英国、印度等国家和地区均将指纹图谱纳入其草药制剂质量控制范畴。本研究在充分采集各产地肿节风代表性样品基础上，运用HPLC-MS技术开展肿节风种源研究，建立双柱串联肿节风指纹图谱，并进行成分分析，进一步提升了对肿节风药材的质量把控能力，对确保肿节风相关产品疗效稳定性具有深远意义。

发明内容

为了克服现行大多数实验室使用传统HPLC开展中药指纹图谱研究中遇到的指纹图谱的分离难及成分鉴别能力差等问题，本发明提供一种中药材的指纹图谱建立方法，将双柱串联方法和HPLC-MS技术引入中药指纹图谱研究范畴，极大地提升了中药指纹图谱的分离能力及成分鉴别能力，具体涉及一种双柱串联HPLC-MS肿节风指纹图谱检测方法。

为达成上述目的，本发明采取的技术方案是：一种双柱串联HPLC-MS肿节风指纹图谱检测方法。包括以下步骤：

步骤1，对照品溶液的制备：精密称取异嗪皮啶、迷迭香酸、绿原酸对照品适量，加甲醇溶解即得。

步骤2，供试品溶液的制备：精密称取肿节风药材粉末（3号筛）1.0g，置于50ml三角瓶中，加入10ml 60%甲醇，超声30min，过滤，滤液用0.45um有机系微孔滤膜滤过，所得溶液即为供试品溶液。

步骤3，将各对照品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，记录谱图相关信息。

步骤4，将供试品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，记录谱图相关信息。

其中，色谱分离条件如下：双色谱柱，前柱Agilent 5HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5um），后柱Eclipse plus phenyl-Hexyl（250 mm×4.6 mm，5um）；流动相，0.1%甲酸乙腈溶液（A）—0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0~15 min，15%A；15~60 min，15%~30%A；60~90 min，30%~60%A）；检测波长330nm；0~15min流量为 0.3 mL/min，其余时间流量均为0.5 ml/min；进样量10ul；柱温30℃。

步骤5，使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对各供试品溶液与对照品溶液谱图进行处理，生成肿节风药材对照指纹图谱。

步骤6，将供试品所得色谱图和肿节风药材对照指纹图谱比对，两者符合，为合格品。

作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述步骤2中，肿节风药材粉末60%甲醇超声30min，提取组分多，HPLC响应值高。

作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述步骤3、4中，将各对照品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，HPLC与MS技术相结合，即使在不同实验时期HPLC色谱峰出峰时间略有偏移，也可以通过MS图谱确认参照峰，进而加以校正。

最优选的，本发明所采用的色谱分离条件：双色谱柱，前柱Agilent 5HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5um），后柱Eclipse plus phenyl-Hexyl（250 mm×4.6 mm，5um）。本发明所创建HPLC分离方法，立足于传统实验室已有实验条件，本研究突破传统思维，打破传统的液相分离过程仅选择单根短柱或单根长柱进行HPLC分离的固有模式，运用双柱串联模式开展各产地肿节风药材组分HPLC分析，获得突破性成果。

作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述步骤5中构建肿节风指纹图谱的方法为：将各产地样品测试数据导入相似度评价系统软件中，选定参照指纹图谱，并以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，同时结合多点校正法对各产地液相图谱进行匹配，得到肿节风药材对照指纹图谱。

结合HPLC-MS图谱数据及对照品比对，确认了特征峰1、特征峰2、特征峰3、特征峰5、特征峰7、特征峰9分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异嗪皮啶、迷迭香酸。

作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述肿节风指纹图谱包括10个共有特征峰，以7号峰（异嗪皮啶）为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.354；2号峰：0.452；3号峰：0.475；4号峰：0.533；5号峰：0.681；6号峰：0.931；7号峰：1.000；8号峰：1.078；9号峰：1.168；10号峰：1.368。

本发明的有益效果是打破传统HPLC方式，采用双柱串联HPLC分离模式实现了肿节风药材各组分的极大化分离，强化了传统HPLC的分离能力，同时将HPLC-MS联用技术运用于肿节风指纹图谱研究过程，确立了22个产地肿节风药材的共有图谱，识别了10个共有特征峰，并确认6个共有特征峰成分，经鉴定特征峰1、特征峰2、特征峰3、特征峰5、特征峰7、特征峰9分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异嗪皮啶、迷迭香酸。此外，HPLC与MS技术相结合，即使在不同实验时期HPLC色谱峰出峰时间略有偏移，也可以通过MS图谱确认参照峰，进而加以校正，强化了指纹图谱的重现性。

附图说明

图1为本发明的双柱串联HPLC分离结果比对图谱；

图2为本发明的22个产地肿节风药材叠加指纹图谱；

图3为本发明的肿节风药材对照指纹图谱；

图4为本发明的药材真伪鉴别图谱。

具体实施方式

实施例1 肿节风指纹图谱的构建

1、实验药材与仪器

22组肿节风药材来源及产地如表1，均经江西中医药大学刘勇老师鉴定为金粟兰科植物草珊瑚 Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai的干燥全草。

表1 肿节风药材的来源及产地

Waters e2695高效液相色谱仪美国Waters公司；Waters2998二极管阵列检测器美国Waters公司；KQ-500B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；SECURA125-1CN电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SECURA224-1CN电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司； Millipore Direct-Q3UV超纯水机美国密理博公司；标准药筛绍兴市上虞张兴纱筛厂；MSQ PLUS质谱仪美国Thermo Fisher Scientific公司。

2、实验方法

（1）供试品溶液的制备

精密称取肿节风药材粉末（3号筛）1.0g，置于50ml三角瓶中，加入10ml 60%甲醇，超声30min，过滤，滤液用0.45um有机系微孔滤膜滤过，所得溶液即为供试品溶液。

（2）对照品溶液的制备

精密称取异嗪皮啶、迷迭香酸、绿原酸对照品适量，加甲醇溶解即得。

（3）色谱条件

双色谱柱：前柱Agilent 5HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5um），后柱Eclipse plusphenyl-Hexyl（250 mm×4.6 mm，5um）；流动相，0.1%甲酸乙腈溶液（A）—0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0~15 min，15%A；15~60 min，15%~30%A；60~90 min，30%~60%A）；检测波长330nm；0~15min流量为 0.3 mL/min，其余时间流量均为0.5 ml/min；进样量10ul；柱温30℃。

（4）方法学考察

精密度实验：取肿节风药材，按照“（1）”项下确认条件制备供试品溶液，采用“（3）”色谱条件连续进样6次，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.25%，各共有峰相对峰面积RSD均小于2.50%。将肿节风药材的这6次进样HPLC图谱导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012)进行相似度分析，结果显示其相似度均大于0.990，表明精密度良好，满足指纹图谱技术要求。

重复性实验：取肿节风药材6份，分别按照“（1）”项下确认条件制备供试品溶液6份，采用“（3）”色谱条件分别进样分析，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.80%，各共有峰相对峰面积RSD均小于3.00%。将得到的HPLC图谱导入软件进行相似度分析，结果显示其相似度均大于0.990，表明方法重复性良好，满足指纹图谱技术要求。

稳定性实验：取肿节风药材，按照“（1）”项下确认条件制备供试品溶液1份，分别在制备后 0h、2 h、4 h，8h、12h、24h采用“2.1”色谱条件进样检测，测得各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.30%，各共有峰相对峰面积RSD均小于2.50%。将样品图谱导入软件进行相似度分析，结果显示其相似度均大于0.990，表明供试品溶液在24h内稳定。

3、实验结果

（1）双柱串联模式确定

在获取足够多各产地肿节风药材组分信息后，进一步建立高效的HPLC分离方法是关键，药材中各组分在液相上的充分分离是进行指纹图谱构建的前提条件。创建HPLC分离方法，高效液相色谱柱的选择是关键中的关键，传统的液相分离过程通常选择单柱进行HPLC分离，但组分分离过程往往顾此失彼。为此，立足于传统实验室已有实验条件，本研究打破传统思维，运用双柱串联模式开展各产地肿节风药材组分HPLC分析，获得突破性成果。

肿节风药材不同色谱柱分析结果显示（如图1），双柱串联模式组分分离效果显著优于单柱HPLC分离过程。通过双柱串联分析，特征峰1（新绿原酸）、特征峰2（绿原酸）、特征峰3（隐绿原酸）得以有效分离，并被发现。双柱串联HPLC分离模式实现了肿节风药材各组分的极大化分离，为肿节风HPLC指纹图谱的建立奠定了基础。

（2）肿节风药材指纹图谱测定

采用双柱串联模式同时结合流动相梯度洗脱对22个不同产地肿节风样本进行HPLC分析，得到22个产地肿节风药材的液相色谱图。将各产地样品测试数据导入相似度评价系统软件中，选择S10 号样品图谱做为参照指纹图谱，并以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，同时结合多点校正法对各产地液相图谱进行匹配，得到 22个产地肿节风药材的指纹图谱（如图2）。

（3）肿节风药材指纹图谱分析

“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”分析结果显示，各产地肿节风药材确认有10个共有峰（如图3）。结合HPLC-MS图谱数据及对照品比对，确认了特征峰1、特征峰2、特征峰3、特征峰5、特征峰7、特征峰9分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异嗪皮啶、迷迭香酸。HPLC与MS技术相结合，即使在不同实验时期HPLC色谱峰出峰时间略有偏移，也可以通过MS图谱确认参照峰，进而加以校正。

按照上述数据处理方式，相似度评价结果显示（如表2），22个产地肿节风样品的平均相似度为 0.946，说明不同产地的肿节风样品色谱模式大致相似，其化学成分大致相同。

表2 肿节风指纹图谱相似度评价

编号	相似度	编号	相似度
				S1	0.987	S12	0.821
S2	0.914	S13	0.959
				S3	0.971	S14	0.97
S4	0.956	S15	0.944
				S5	0.925	S16	0.968
S6	0.966	S17	0.945
				S7	0.987	S18	0.993
S8	0.959	S19	0.948
				S9	0.894	S20	0.965
S10	0.971	S21	0.987
				S11	0.951	S22	0.841

实施例2 肿节风药材真伪鉴别

为评价肿节风药材指纹图谱的在药材真伪鉴别方面的有效性，选用肿节风对照药材、鱼子兰（肿节风伪品）与肿节风对照指纹图谱进行比对性研究。

（1）采用与实施例1相同的供试品溶液的制备方法和色谱条件对肿节风对照药材、鱼子兰（肿节风伪品）指纹图谱测定。

（2）将步骤（1）所得的肿节风对照药材、鱼子兰指纹图谱与实施例1所得的22个产地肿节风药材对照指纹图谱进行比对。

（3）比对结果显示，肿节风对照药材具备肿节风对照指纹图谱的10个共有特征峰且相似度达0.925，而鱼子兰药材仅具有特征峰9（迷迭香酸），与肿节风对照指纹图谱存在显著差异（如图4）。这进一步证明，本发明建立的肿节风对照指纹图谱可以很好地实现肿节风药材真伪鉴别。

Claims

1.一种双柱串联液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）肿节风对照指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，精密称取过3号筛的肿节风药材粉末，加入甲醇，超声，过滤，定容，所得溶液即为供试品溶液；

步骤2，将供试品溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，记录谱图相关信息；

步骤3，将所得谱图与肿节风药材对照指纹图谱，两者符合，为合格品；

其中，步骤1中甲醇浓度为60%，超声时间30min；

其中，步骤2中分析条件为：双色谱柱，前柱Agilent 5HC-C18(2)：250mm×4.6mm，5μm；后柱Eclipse plus phenyl-Hexyl：250mm×4.6mm，5μm；

流动相，A相为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为0.1%甲酸，梯度洗脱：0~15min，15%A；15~60min，15%~30%A；60~90min，30%~60%A；检测波长330nm；0~15min流量为0.3mL/min，其余时间流量均为0.5ml/min；进样量10ul；柱温30℃；

其中，步骤2中构建肿节风的对照指纹图谱方法为：采用双柱串联模式同时结合流动相梯度洗脱对22个不同产地肿节风样本进行HPLC分析，得到22个产地肿节风药材的液相色谱图；将各产地样品测试数据导入相似度评价系统软件中，选择S10号样品图谱做为参照指纹图谱，并以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，同时结合多点校正法对各产地液相图谱进行匹配，生产由10个共有峰构成的肿节风药材对照指纹图谱。

2.如权利要求1所述的一种双柱串联液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）肿节风对照指纹图谱的构建方法，其特征在于：肿节风药材对照指纹图谱中结合HPLC-MS图谱数据及对照品比对，确认了特征峰1、特征峰2、特征峰3、特征峰5、特征峰7、特征峰9分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异嗪皮啶、迷迭香酸。

3.如权利要求1～2任一项所述的构建方法构建的肿节风药材的对照指纹图谱在肿节风检测中的应用。