CN110579548B - 一种野菊花药材质量评价方法及应用 - Google Patents

一种野菊花药材质量评价方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种野菊花药材质量评价方法及应用，首先构建野菊花药材的指纹图谱，通过模式识别法对指纹图谱进行分析，结合一测多评全面反映野菊花药材中多成分的定性定量信息；首先制备混合对照品溶液、供试品溶液，然后采用高效液相色谱对混合对照品溶液和供试品溶液分别检测，并记录混合对照品溶液和供试品溶液的指纹图谱，再通过一测多评法记录12种成分的峰面积，计算相对校正因子，用校正因子计算12种组份的含量。本发明中高效液相色谱法同时测定野菊花中12种组份含量，操作简便，重现性好，快速准确实现了野菊花中多指标成分同时定量，12种组份分离度好，为野菊花质量控制奠定理论基础。

Description

一种野菊花药材质量评价方法及应用
技术领域
本发明涉及药材质量检测领域，尤其涉及一种野菊花药材质量评价方法及应用。
背景技术
野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序，秋、冬二季花初开放时采摘，晒干，或蒸后晒干，具疏散风热、消肿解毒的功效，用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、风火赤眼、头痛眩晕等病证，有机酸和黄酮类化合物在野菊花药材中含量高，具有抗炎、抗氧化、抗菌等活性，其中咖啡酰奎尼酸类结构相似，同分异构化合物较多，对照品昂贵，野菊花临床应用广泛，资源丰富，分布全国多个省份，生长环境差异显著，成分复杂，质量控制及质量评价工作困难重重。
现有技术中指纹图谱能全面反映中药材的化学成分信息，有完整性和模糊性两大属性，其模糊性致使其缺乏准确的定性定量数据支撑，具有一定的局限性；含量测定尤其是多指标含量测定在一定程度上弥补指纹图谱法对于中药质量评价的不足及单一成分含量测定对质量评价的局限性，传统色谱峰指认需要大量对照品做参照，指认色谱峰越多对照品需求量越大，研究成本高，外标法含量测定离不开对照品，且要求对照品纯度高，结构相似的对照品如咖啡酰奎宁酸类化合物分离提纯难，价格昂贵，严重阻碍色谱峰指认及多指标含量测定。
而一测多评含量测定法借助易得价廉的单一对照品，利用相对校正因子可实现多指标成分的同时定量，相对保留值可准确指认、定位待测色谱峰；野菊花产地广泛，主成分分析、聚类分析等模式识别方法对于分析不同产地野菊花药材之间差异，通过产地间聚类趋势，可直观体现野菊花药材产地信息及预测野菊花药材产地归属。
发明内容
本发明通过构建野菊花药材HPLC指纹图谱，建立对照指纹图谱，分析21批不同产地野菊花药材指纹图谱的相似度，借助主成分分析、聚类分析模式识别法对21个不同产地的野菊花药材指纹图谱数据进行分析，结合一测多评法全面反映野菊花药材中12种成分的定性定量信息，以解决背景技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种野菊花药材质量评价方法，包括指纹图谱法和模式识别法，还包括一测多评法，构建野菊花药材的指纹图谱，模式识别法分析不同产地野菊花药材聚类趋势，以绿原酸为内参物，一测多评法明确野菊花药材指纹图谱中12个特征组分位置及含量；所述野菊花药材指纹图谱中12个特征组分为5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素；
构建野菊花药材的指纹图谱，包括以下步骤：
步骤(1)制备混合对照品溶液：分别称取5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素适量，加溶剂溶解，制得混合对照品原液，然后精密量取1、2、4、6、8、10mL混合对照品原液于10mL棕色量瓶中，用上述溶剂定容至刻度，混合均匀，得到系列浓度混合对照品溶液，4℃避光存储；
步骤(2)制备供试品溶液：取不同产地的野菊花药材粉末0.25g，称定，置具塞锥形瓶中，加入溶剂100ml，称定重量，回流1～3小时，再称定重量，用上述溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，置于1.5mL进样小瓶，备测；
步骤(3)采用高效液相色谱对所述混合对照品溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
(4)建立对照指纹图谱：将所述步骤(3)中供试品溶液的指纹图谱数据加载到中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，以开始时间为0，结束时间为55对指纹图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.01，中位数法生成对照指纹图谱，经多点校正，峰匹配，生成对照指纹图谱；
模式识别法包括相似度分析、主成分分析及聚类分析法，具体操作步骤为：
步骤a、相似度分析为计算不同产地野菊花药材指纹图谱之间的相似度以及与对照指纹图谱的相似度；
步骤b、主成分分析为对不同产地野菊花药材指纹图谱进行主成分分析，两个主成分累计贡献达到80.92％，包含了大部分信息，其中第1主成分贡献率为71.66％，第2主成分特征值为9.26％，以第1、2主成分进行投影，得到主成分投影图；
步骤c、聚类分析为对不同产地野菊花药材的指纹图谱数据进行聚类分析；
一测多评法为取上述步骤(1)中混合对照品原液1、5、10、15、20、25μL进样注入高效液相色谱仪，分别记录不同进样体积时12个特征组份的峰面积，选择内参物，按公式fs/i＝fs/fi＝(Wi×As)/(Ws×Ai)(式中As为内参物峰面积，Ws为内参物的量，Ai为组分i的峰面积；Wi为组分i的量)，分别计算5-咖啡酰奎宁酸(A)、咖啡酸(C)、1,3-二咖啡酰奎宁酸(D)、木犀草苷(E)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(F)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(G)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(H)、蒙花苷(I)、木犀草素(J)、芹菜素(K)、金合欢素(L)的相对校正因子，用校正因子计算12个组份的含量。
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，步骤(1)和步骤(2)中所述的溶剂为甲醇水溶液，步骤(2)中所述的回流为水浴回流。
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，步骤(1)中所述混合对照品原液中5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素的浓度依次为1.92、259.18、0.86、1.06、14.45、2.85、25.82、28.7、64.82、3.85、2.88、1.60μg/mL；
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，步骤(3)中所述高效液相色谱的检测条件是采用C18为填充剂，流动相为有机相～水相，进行梯度洗脱，检测波长334nm，柱温35℃，进样量10μL；
优选的，所述梯度洗脱的程序为：0～5min，5～30min，30～32min，32～42min，42～45min，45～45.01min，45.01～50min，50～50.01min，50.01～58min，有机相的体积百分比分别为5～18％，18～21％，21～38％，38～45％，45～60％，60～80％，80～85％，85～5％，保持5％；
优选的，所述流动相的流速为1.0mL.min-1，所述流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液。
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，步骤(3)中所述供试品溶液的指纹图谱中共标定了17个共有峰，将其中12个共有峰指认为5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素。
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，所述相似度分析中不同产地野菊花药材指纹图谱的相似度差异较大，提出合格野菊花药材标准为蒙花苷含量大于8.0mg·g-1，且与对照指纹图谱相似度大于0.90。
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，所述一测多评法中所述内参物为绿原酸(B)，用所述一测多评法计算出5-咖啡酰奎宁酸(A)、咖啡酸(C)、1,3-二咖啡酰奎宁酸(D)、木犀草苷(E)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(F)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(G)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(H)、蒙花苷(I)、木犀草素(J)、芹菜素(K)、金合欢素(L)的相对校正因子分别为0.0892、0.0574、0.1185、0.1177、0.0661、0.1180、0.2047、0.1015、0.0529、0.0256、0.0982。
更优选的，采用外标法测定12种成分含量，以对照品进样浓度为横坐标(x,ng)，峰面积为纵坐标(Y)线性回归，借助标准曲线和峰面积计算待测成分含量。
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，所述一测多评法中所述高效液相色谱采用不同的高效液相色谱系统和不同的色谱柱，所述不同的高效液相色谱系统为岛津LC-20AT、岛津LC-20AD或安捷伦1260型高效液相色谱系统中的一种；所述不同的色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(Z1)，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm、AgilentExtend-C18色谱柱(Z2)，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm或NUCLEODUR-C18色谱柱(Z3)，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm中的一种。
如上所述的野菊花药材质量评价方法，优选的，所述不同的高效液相色谱系统和不同的色谱柱条件下测得各成分相对校正因子的RSD值在0.68％～4.08％之间；各成分相对保留值波动较小，RSD在1.67％～4.99％之间，相对保留值作为野菊花药材一测多评目标色谱峰的定位指标，同时结合各色谱峰的紫外特征吸收进一步确定目标峰的位置。
一种野菊花药材质量评价方法应用于鉴别不同产地野菊花药材的分类趋势，测定野菊花药材中的中咖啡酰奎宁酸类化合物、有机酸、黄酮类化合物的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明建立野菊花药材指纹图谱分析方法，构建对照指纹图谱，分析不同产地野菊花药材指纹图谱的相似度，借助主成分分析、聚类分析的模式识别法鉴别不同产地野菊花药材，结合一测多评法，建立一种谱图有参照，成分可明确，含量快测定，产地可预测的野菊花多元整体质控方法；
2、本发明中高效液相色谱法同时测定野菊花药材中12种组份含量，方法可靠，重现性好，实现了野菊花中多指标成分同时定量，12种指标成分分离度良好，为野菊花质量控制奠定理论基础；
3、本发明以绿原酸为内参物，通过一测多评法同时测定对野菊花药材中12种成分含量，方法简单、快速、准确，绿原酸化学性质比较稳定，含量较高，价廉易得，避免对照品短缺或对照品昂贵带来的定量阻碍，借助单一对照品同时测定野菊花药材12种指标成分，同时以绿原酸为内参物，借助相对保留值对其他色谱峰准确定位。
4、本发明中野菊花药材中结构相似、价格昂贵、分离难度大的咖啡酰奎宁酸类化合物分离度好，以绿原酸为内参物，一测多评法可同时测定咖啡酰奎宁酸类化合物成分含量或者总含量。
附图说明
图1、本发明具体实施例中21个不同产地野菊花药材的高效液相色谱指纹图谱；
图2、本发明具体实施例中野菊花药材的对照指纹图谱；
图3、本发明具体实施例中混合对照品溶液的色图谱；
图4、本发明具体实施例中供试品溶液的色图谱；
图5、本发明具体实施例中主成分分析图；
图6、本发明具体实施例中聚类分析树状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明建立野菊花药材指纹图谱分析方法，构建对照指纹图谱，分析不同产地野菊花药材指纹图谱的相似度，借助主成分分析、聚类分析的模式识别法鉴别不同产地野菊花药材，结合一测多评法，建立一种谱图有参照，成分可明确，含量快测定，产地可预测的野菊花多元整体质控方法；本发明中高效液相色谱法同时测定野菊花药材中12种组份含量，方法可靠，重现性好，实现了野菊花中多指标成分同时定量，12种指标成分分离度良好，为野菊花质量控制奠定理论基础；本发明以绿原酸为内参物，通过一测多评法同时测定对野菊花药材中12种成分含量，方法简单、快速、准确，绿原酸化学性质比较稳定，含量较高，价廉易得，避免对照品短缺或对照品昂贵带来的定量阻碍，借助单一对照品同时测定野菊花药材12种指标成分，同时以绿原酸为内参物，借助相对保留值对其他色谱峰准确定位；本发明中野菊花药材中结构相似、价格昂贵、分离难度大的咖啡酰奎宁酸类化合物分离度好，以绿原酸为内参物，一测多评法可同时测定咖啡酰奎宁酸类化合物成分含量或者总含量。
以下实施例是对21批次不同产地野菊花药材的质量评价。
1所需仪器与试药
1.1仪器
岛津LC-20AT高效液相色谱仪，包括CMA-20A系统、LC-20AT二元高压泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A检测器、LC Soulation色谱工作站；ME204万分之一电子天平(梅特勒·托利多仪器上海有限公司)；AUW 220D十万分之一天平(日本岛津公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司)。
1.2试药
对照品5-咖啡酰奎宁酸(批号12061129，纯度≥98％，成都曼斯特生物科技有限公司)；绿原酸(批号110753-201415，纯度96.2％，中国食品药品检定研究院)；咖啡酸(批号110885-201803，纯度99.7％，中国食品药品检定研究院)；1,3-二咖啡酰奎宁酸(批号1704116，纯度≥98％，成都普菲德生物技术有限公司)；木犀草苷(批号111720-201609，纯度94.9％，中国食品药品检定研究院)；4,5-二咖啡酰奎宁酸(批号wkq16081905，纯度≥98％，四川省维克奇生物科技有限公司)；3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(批号111782-201706，纯度97.3％，中国食品药品检定研究院)；3,4-二咖啡酰奎宁酸(批号wkq16040902，纯度≥98％，四川省维克奇生物科技有限公司)；蒙花苷(批号111528-201710，纯度96.6％，中国食品药品检定研究院)；木犀草素(批号111520-201605，纯度99.6％，中国食品药品检定研究院)；芹菜素(批号111901-201603，纯度99.2％，中国食品药品检定研究院)；金合欢素(批号wkq17091109，纯度≥98％，四川省维克奇生物科技有限公司)。
野菊花药材购自郑州市药材市场，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的干燥头状花序，粉碎过三号筛，置于硅胶干燥器中备用，详细信息见表1；甲醇，乙腈为色谱纯，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；磷酸为分析纯，购自北京化工厂。
表1、样本信息
Figure BDA0002236831110000061
Figure BDA0002236831110000071
2实验方法
一种野菊花药材质量评价方法，包括指纹图谱法和模式识别法，还包括一测多评法，构建野菊花药材的指纹图谱，模式识别法分析不同产地野菊花药材聚类趋势，以绿原酸为内参物，一测多评法明确野菊花药材指纹图谱中12个特征组分位置及含量；所述野菊花药材指纹图谱中12个特征组分为5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素；
构建野菊花药材的指纹图谱，包括以下步骤：
步骤(1)制备混合对照品溶液：分别精密称取5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素适量，加甲醇溶解，制得混合对照品原液，然后精密量取1、2、4、6、8、10mL混合对照品原液于10mL棕色量瓶中，用甲醇水溶液定容至刻度，混合均匀，得到系列浓度混合对照品溶液，4℃避光存储；
在本发明具体实施例中，5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素浓度依次为1.92μg·mL-1、259.18μg·mL-1、0.86μg·mL-1、1.06μg·mL-1、14.45μg·mL-1、2.85μg·mL-1、25.82μg·mL-1、28.7μg·mL-1、64.82μg·mL-1、3.85μg·mL-1、2.88μg·mL-1、1.60μg·mL-1；
步骤(2)制备供试品溶液：取21个不同产地的野菊花药材粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇水溶液100ml，称定重量，水浴回流1～3小时，再称定重量，用甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，置于1.5mL进样小瓶，备测；
步骤(3)采用高效液相色谱对所述混合对照品溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
在本发明具体实施例中，所述供试品溶液的指纹图谱中共标定了17个共有峰，将其中12个共有峰指认为5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素。
步骤(4)建立对照指纹图谱：将所述步骤(3)中供试品溶液的指纹图谱数据加载到中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，以开始时间为0，结束时间为55对指纹图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.01，中位数法生成对照指纹图谱，经多点校正，峰匹配，生成对照指纹图谱；
在本发明具体实施例中，步骤(3)中高效液相色谱检测条件是采用C18为填充剂，流动相为有机相～水相，进行梯度洗脱，检测波长334nm，柱温35℃，进样量10μL，本实验采用二极管阵列检测器，分别在190～800nm全波长条件下对混合对照品溶液和供试品溶液的待测成分进行了全波长扫描，结果12种成分中有机酸类成分在324nm有最大吸收，黄酮类成分在237nm有最大吸收，在334nm有次吸收，为减少数据统计和计算工作量，选择334nm作为野菊花药材含量测定的检测波长。
所述梯度洗脱的程序为：0～5min，5～30min，30～32min，32～42min，42～45min，45～45.01min，45.01～50min，50～50.01min，50.01～58min，有机相的体积百分比分别为5～18％，18～21％，21～38％，38～45％，45～60％，60～80％，80～85％，85～5％，保持5％；
所述流动相的流速为1.0mL.min-1，所述流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液。
模式识别法包括相似度分析、主成分分析及聚类分析法，具体操作步骤为：
步骤a、相似度分析为计算不同产地野菊花药材指纹图谱之间的相似度以及与对照指纹图谱的相似度；
在本发明具体实施例中，不同产地野菊花药材指纹图谱的相似度差异较大，提出合格野菊花药材标准为蒙花苷含量大于8.0mg·g-1，且与对照指纹图谱相似度大于0.90。
步骤b、主成分分析为对不同产地野菊花药材指纹图谱进行主成分分析，两个主成分累计贡献达到80.92％，包含了大部分信息，其中第1主成分贡献率为71.66％，第2主成分特征值为9.26％，以第1、2主成分进行投影，得到主成分投影图。
步骤c、聚类分析为对不同产地野菊花药材的指纹图谱数据进行聚类分析。
一测多评法为取上述步骤(1)中混合对照品原液1、5、10、15、20、25μL进样注入高效液相色谱仪，分别记录不同进样体积时12个特征组份的峰面积，绿原酸化学性质比较稳定，含量较高，价廉易得，将其作为内参物相对校正因子及相对保留值较稳定，能体现一测多评法操作简便、成本低、效率高的特点，故选择以绿原酸(B)为内参物，按公式fs/i＝fs/fi＝(Wi×As)/(Ws×Ai)(式中As为内参物峰面积，Ws为内参物的量，Ai为组分i的峰面积；Wi为组分i的量)，分别计算5-咖啡酰奎宁酸(A)、咖啡酸(C)、1,3-二咖啡酰奎宁酸(D)、木犀草苷(E)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(F)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(G)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(H)、蒙花苷(I)、木犀草素(J)、芹菜素(K)、金合欢素(L)的相对校正因子，用校正因子及目标色谱峰峰面积计算12个组份的含量。
在本发明具体实施例中，一测多评法计算出5-咖啡酰奎宁酸(A)、咖啡酸(C)、1,3-二咖啡酰奎宁酸(D)、木犀草苷(E)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(F)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(G)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(H)、蒙花苷(I)、木犀草素(J)、芹菜素(K)、金合欢素(L)的相对校正因子分别为0.0892、0.0574、0.1185、0.1177、0.0661、0.1180、0.2047、0.1015、0.0529、0.0256、0.0982。
在本发明具体实施例中，一测多评法中所述高效液相色谱采用不同的高效液相色谱系统和不同的色谱柱，所述不同的高效液相色谱系统为岛津LC-20AT、岛津LC-20AD或安捷伦1260型高效液相色谱系统中的一种；所述不同的色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(Z1)，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm、Agilent Extend-C18色谱柱(Z2)，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm或NUCLEODUR-C18色谱柱(Z3)，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm中的一种。
所述不同的高效液相色谱系统和不同的色谱柱条件下测得各成分相对校正因子的RSD值在0.68％～4.08％之间；各成分相对保留值波动较小，RSD在1.67％～4.99％之间，相对保留值作为野菊花药材一测多评目标色谱峰的定位指标，同时结合各色谱峰的紫外特征吸收进一步确定目标峰的位置。
一种野菊花药材质量评价方法应用于鉴别不同产地野菊花药材的分类趋势，测定野菊花药材中的中咖啡酰奎宁酸类化合物、有机酸、黄酮类化合物的含量。
实施例1
对照指纹图谱建立
按照步骤(3)采集21个不同产地野菊花药材的高效液相色谱指纹图谱，见图1，将AIA格式的指纹图谱数据加载到中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，以开始时间为0，结束时间为55对指纹图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.01，中位数法生成对照指纹图谱，经多点校正，峰匹配，生成对照指纹图谱，见图2；
特征色谱峰指认
21批野菊花指纹图谱色谱峰匹配出17个共有色谱峰，参照对照品的保留时间和光谱信息，混合对照品和供试品溶液的色谱图见图3、图4，将共有色谱峰中的1、2、3、4、5、6、9、10、13、14、15及17号色谱峰依次指认为5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素和金合欢素，共有峰峰面积占总峰面积比例大于85.0％，指认的12个色谱峰占总峰面积比例大于80.3％。
实施例2
相似度评价
21批野菊花药材相似度计算结果见表2，S1～S21号野菊花药材之间相似度差异较大，在0.590～0.997之间，说明市场野菊花质量良莠不齐。S2、S3、S4、S5、S8、S15、S17号野菊花蒙花苷含量低于8.0mg·g-1，指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.90，但S17除外；S6蒙花苷含量大于8.0mg·g-1，其指纹图谱与对照指纹图谱相似度结果只有0.772，远远小于0.90。可见单一指标成分含量测定难以整体把控野菊花药材质量，提出合格野菊花药材标准为蒙花苷含量大于8.0mg·g-1，且与对照指纹图谱相似度大于0.90。
表2、指纹图谱相似度报表
Figure BDA0002236831110000101
Figure BDA0002236831110000111
Figure BDA0002236831110000121
主成分分析，对21批次野菊花药材指纹图谱进行主成分分析，两个主成分累计贡献可以达到80.92％，包含了大部分信息，其中第1主成分贡献率为71.66％，第2主成分特征值为9.26％，以第1、2主成分进行投影，得到主成分投影图，见图5。第一类为S1～S16，属于河南、安徽产地野菊花，其中S13号湖北野菊花归为第一类，可能是由于其产地地理位置与河南接近，自然环境相似的缘故，第二类为湖北野菊花S17～S21，第一类类别内差别小，第二类类别内差别显著。
聚类分析，采用TCMYS指纹图谱软件对预处理后的21批野菊花药材指纹图谱数据进行聚类分析，聚类分析树状图见图6，结果大致归为两类，S1～S17归为一类，S18～S21归为一类，该结果与主成分分析结果基本一致，S17与S1～S16归为一类可能是由于其生长地理环境与河南、安徽差异不大，导致其与其他湖北样品差异显著。
实施例3
线性范围考察，取混合对照品溶液1、2、4、6、8、10μL进样分析，以对照品进样浓度为横坐标(x,ng)，峰面积为纵坐标(Y)线性回归，12种成分回归方程及相关系数见表3。
表3、12种成分回归方程及线性范围
Figure BDA0002236831110000122
Figure BDA0002236831110000131
实施例4
精密度考察，取混合对照品溶液，连续重复进样6次，5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素峰面积RSD分别为0.86％、0.97％、1.25％、1.67％、1.34％、1.87％、1.69％、2.15％、2.33％、1.98％、1.88％、1.62％，表明仪器精密度良好。
实施例5
重复性考察，取同一个野菊花样品，平行制备供试品溶液6份，依次分析测定，外标法测定6份样品中5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素的含量，计算12种指标成分样品中含量的RSD分别为1.12％、1.35％、1.69％、2.35％、2.21％、2.09％、1.86％、2.48％、1.99％、1.64％、1.58％、2.62％，表明该方法重复性良好。
实施例6
稳定性考察，取同一供试品溶液，于0、4、8、12、24h进样分析，5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素峰面积RSD分别为1.05％、1.21％、2.48％、2.15％、2.29％、2.52％、1.94％、1.85％、2.33％、2.04％、2.16％、1.87％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
实施例7
加样回收率，精密称取野菊花供试品9份，每份约0.125g，分别精密加入不同浓度的混合对照品溶液，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算其加样回收率，结果见表4。
表4、12种成分的加样回收率试验结果(n＝9)
Figure BDA0002236831110000141
Figure BDA0002236831110000151
实施例8
校正因子计算，将混合对照品原液进样1、5、10、15、20、25μL，分别记录不同进样体积时12种成分的峰面积，以绿原酸为内参物，按公式fs/i＝fs/fi＝(Wi×As)/(Ws×Ai)(式中As为内参物峰面积，Ws为内参物的量，Ai为组分i的峰面积；Wi为组分i的量)，计算5-咖啡酰奎宁酸(A)、咖啡酸(C)、1,3-二咖啡酰奎宁酸(D)、木犀草苷(E)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(F)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(G)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(H)、蒙花苷(I)、木犀草素(J)、芹菜素(K)、金合欢素(L)的相对校正因子，结果见表5。
表5、12种成分的相对校正因子
Figure BDA0002236831110000152
Figure BDA0002236831110000161
实施例9
不同高效液相色谱系统及色谱柱对相对校正因子的影响，本实验考察了岛津LC-20AT、岛津LC-20AD、安捷伦1260型高效液相色谱系统和Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm,编号Z1)；Agilent Extend-C18柱(4.6mm×250mm,5μm,编号Z2)；NUCLEODURC18Pyramid column柱(4.6mm×250mm,5μm,编号Z3)3种色谱柱的相对校正因子。分别精密吸取混合对照品溶液10μL，在上述色谱条件下，进样测定，计11种成分对绿原酸的相对校正因子，见表6，不同高效液相色谱系统及不同色谱柱所得相对校正因子的RSD值在0.68％～4.08％之间，表明不同高效液相色谱系统和色谱柱对各成分的相对校正因子无显著影响。
表6、不同高效液相色谱系统和不同色谱柱测的相对校正因子
Figure BDA0002236831110000162
Figure BDA0002236831110000171
实施例10
待测组分色谱峰的定位，本试验分别采用各待测成分间的保留时间差值、相对保留值两参数作为定位标准，并在不同品牌高效液相色谱系统和不同色谱柱条件下对两参数进行考察，结果显示不同品牌高效液相色谱系统和不同色谱柱条件下各成分间的保留时间差值波动较大，而成分间相对保留值波动较小，RSD在1.67％～4.99％之间，见表7。故本试验选用相对保留值作为野菊花一测多评目标色谱峰的定位指标，同时结合各色谱峰的紫外特征吸收进一步确定目标峰的位置。
表7、不同品牌高效液相色谱系统和不同色谱柱下目标成分的相对保留值
Figure BDA0002236831110000172
Figure BDA0002236831110000181
注：相对保留值rm/k＝tRm/tRk；tRk为内参物保留时间，tRm为其他成分保留时间。
实施例11
野菊花药材含量测定一测多评法与外标法的结果比较，依次取21批次不同产地的野菊花药材样品供试品溶液，进样分析，记录12种成分峰面积，采用外标法(ESTD)和一测多评法(QAMS)计算5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素含量，见表8、表9；常规的外标法实测含量值与一测多评计算的含量值经t检验比较，无显著性差异(P＞0.05)，说明一测多评法可用于野菊花药材多成分质量评价研究。
表8、ESM和QAMS测定野菊花中12种成分
Figure BDA0002236831110000182
Figure BDA0002236831110000191
表9、ESM和QAMS测定野菊花中12种成分
Figure BDA0002236831110000192
Figure BDA0002236831110000201
本发明建立野菊花药材指纹图谱分析方法，构建对照指纹图谱，分析不同产地野菊药材指纹图谱的相似度，借助主成分分析、聚类分析的模式识别法鉴别不同产地野菊花药材，结合一测多评法，建立一种谱图有参照，成分可明确，含量快测定，产地可预测的野菊花多元整体质控方法；本发明中高效液相色谱法同时测定野菊花药材中12种组份含量，方法可靠，重现性好，实现了野菊花中多指标成分同时定量，12种指标成分分离度良好，为野菊花质量控制奠定理论基础；本发明以绿原酸为内参物，通过一测多评法同时测定对野菊花药材中12种成分含量，方法简单、快速、准确，绿原酸化学性质比较稳定，含量较高，价廉易得，避免对照品短缺或对照品昂贵带来的定量阻碍，借助单一对照品同时测定野菊花药材12种指标成分，同时以绿原酸为内参物，借助相对保留值对其他色谱峰准确定位；本发明中野菊花药材中结构相似、价格昂贵、分离难度大的咖啡酰奎宁酸类化合物分离度好，以绿原酸为内参物，一测多评法可同时测定咖啡酰奎宁酸类化合物成分含量或者总含量。
为了满足简洁的要求，本说明书每个部分重点说明的都是与其他部分的不同之处，各个部分之间相同相似部分可相互参见。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。

Claims (9)

1.一种野菊花药材质量评价方法，包括指纹图谱法和模式识别法，其特征在于：还包括一测多评法，构建野菊花药材的指纹图谱，模式识别法分析不同产地野菊花药材聚类趋势，以绿原酸为内参物，一测多评法明确野菊花药材指纹图谱中12个特征组分位置及含量；所述野菊花药材指纹图谱中12个特征组分为5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素；
所述构建野菊花药材的指纹图谱，包括以下步骤：
步骤（1）制备混合对照品溶液：对12种特征组分分别称取5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素适量，加溶剂溶解，制得混合对照品原液，然后量取1、2、4、6、8、10 mL混合对照品原液于10 mL棕色量瓶中，用上述溶剂定容至刻度，混合均匀，得到系列浓度混合对照品溶液，4 ℃避光存储；
步骤（2）制备供试品溶液：取不同产地的野菊花药材粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂100ml，称定重量，回流1~3小时，再称定重量，用上述溶剂补足减失的重量，摇匀，过0.45μm 滤膜，置于1.5 mL进样小瓶，备测；
步骤（3）采用高效液相色谱对所述混合对照品溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
步骤（4）建立对照指纹图谱：将所述步骤（3）中供试品溶液的指纹图谱数据加载到中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2012年版，以开始时间为0，结束时间为55对指纹图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.01，中位数法生成对照指纹图谱，经多点校正，峰匹配，生成对照指纹图谱；
所述模式识别法包括相似度分析、主成分分析及聚类分析法，具体操作步骤为：
步骤a、相似度分析为计算不同产地野菊花药材指纹图谱之间的相似度以及与对照指纹图谱的相似度；
步骤b、主成分分析为对不同产地野菊花药材指纹图谱进行主成分分析，两个主成分累计贡献达到80.92%，包含了大部分信息，其中第1主成分贡献率为71.66%，第2主成分特征值为 9.26%，以第1、2主成分进行投影，得到主成分投影图；
步骤c、聚类分析为对不同产地野菊花药材的指纹图谱数据进行聚类分析；
所述一测多评法为取上述步骤（1）中混合对照品原液1、5、10、15、20、25 μL进样注入高效液相色谱仪，分别记录不同进样体积时12个特征组份的峰面积，选择步骤（1）中的12个特征组分中的一种为内参物，按公式 fs/i= fs /fi = (Wi×As) / (Ws×Ai) ，式中As为内参物峰面积，Ws为内参物的量，Ai为组分i的峰面积；Wi为组分i的量，分别计算5-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素的相对校正因子，用校正因子计算12个组份的含量；
步骤（3）中所述高效液相色谱的检测条件是采用C18为填充剂，流动相为有机相~水相，进行梯度洗脱，检测波长334 nm，柱温35℃，进样量10µL；
所述梯度洗脱的程序为：0～5min，5～30min，30～32min，32～42min，42～45min，45～45.01min，45.01～50min，50～50.01min，50.01～58min，有机相的体积百分比分别为5～18%，18～21%，21～38%，38～45%，45～60%，60～80%，80～85% ，85～5%，保持5%；
所述流动相的流速为1.0 mL/min，所述流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液。
2.如权利要求1所述的一种野菊花药材质量评价方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）中所述的溶剂为甲醇溶液，步骤（2）中所述的回流为水浴回流。
3.如权利要求1所述的一种野菊花药材质量评价方法，其特征在于：步骤（1）中所述混合对照品原液中5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素的浓度依次为1.92 μg/mL、259.18 μg/mL、0.86 μg/mL、1.06 μg/mL、14.45 μg/mL、2.85 μg/mL、25.82 μg/mL、28.7 μg/mL、64.82 μg/mL、3.85 μg/mL、2.88 μg/mL、1.60 μg/mL。
4.如权利要求1所述的一种野菊花药材质量评价方法，其特征在于：步骤（3）中所述供试品溶液的指纹图谱中共标定了17个共有峰，将其中12个共有峰指认为5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素。
5.如权利要求1所述的一种野菊花药材质量评价方法，其特征在于：提出合格野菊花药材标准为蒙花苷含量大于8.0 mg•g-1，且与对照指纹图谱相似度大于0.90。
6.如权利要求1所述的一种野菊花药材质量评价方法，其特征在于：所述一测多评法中所述内参物为绿原酸，用所述一测多评法计算出5-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素的相对校正因子分别为0.0892、0.0574、0.1185、0.1177、0.0661、0.1180、0.2047、0.1015、0.0529、0.0256、0.0982。
7.如权利要求1所述的一种野菊花药材质量评价方法，其特征在于：所述一测多评法中所述高效液相色谱采用不同的高效液相色谱系统和不同的色谱柱，所述不同的高效液相色谱系统为岛津LC-20AT、岛津LC-20AD或安捷伦1260型高效液相色谱系统中的一种；所述不同的色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，尺寸为4. 6 mm × 250 mm，填料颗粒度为5μm、Agilent Extend-C18色谱柱，尺寸为4. 6mm × 250 mm，填料颗粒度为5 μm或NUCLEODUR-C18色谱柱，尺寸为4. 6mm × 250 mm，填料颗粒度为5 μm中的一种。
8.如权利要求7所述的一种野菊花药材质量评价方法，其特征在于：所述不同的高效液相色谱系统和不同的色谱柱条件下测得各成分相对校正因子的RSD值在0.68%～4.08%之间；各成分相对保留值波动较小，RSD在1.67%～4.99%之间，相对保留值作为野菊花药材一测多评目标色谱峰的定位指标，同时结合各色谱峰的紫外特征吸收进一步确定目标峰的位置。
9.一种如权利要求1~8任一所述的一种野菊花药材质量评价方法的应用，其特征在于：野菊花药材质量评价方法用于鉴别不同产地野菊花药材，测定野菊花药材中的中咖啡酰奎宁酸类化合物、有机酸、黄酮类化合物的含量。
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