CN109374786A - 杭菊药材的uplc特征图谱的构建方法、质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法、质量检测方法。该构建方法包括：供试品溶液制备：取杭菊药材，粉碎，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；参照物溶液制备：取绿原酸、3,5‑O‑二咖啡酰奎宁酸、4,5‑O‑二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；超高效液相色谱检测：吸取供试品溶液、参照物溶液，注入液相色谱仪，检测，获得杭菊药材的UPLC特征图谱。该UPLC特征图谱特征峰信息量丰富，能分反映杭菊药材的化学成分，还能有效地表征杭菊饮片及标准汤剂的质量、及鉴别产品的真伪。

Description

杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法、质量检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，特别是涉及一种杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法、质量检测方法。

背景技术

菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序。菊花始载于东汉《神农本草经》，列为上品。谓：“久服利血气、轻身、耐老、延年”，功效能散风清热，平肝明目，清热解毒。用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒。中国药典2015年版一部收载“贡菊”、“滁菊”、“亳菊”、“杭菊”和“怀菊”5种主要的药用菊花。查阅大量文献发现，菊花因品种、产地不同，其主要化学成分的种类和含量有一定的差异，且前期文献研究主要集中于怀菊或者毫菊，而杭菊的研究较少。亳菊作为亳州的道地药材，是药菊中的佳品。但近年来，由于经济利益等因素的驱使，亳菊正面临种植面积严重萎缩的局面，菊花品种中以茶药两用的杭菊、贡菊种植生产最多，且入药用量较以前有所增加。目前，杭菊随着产区生产规模的逐年扩大，有优质价廉，库存庞大，供应充足的优势。故以杭菊为主要研究对象，建立杭菊药材的质量控制标准是非常迫切的。

中药为多成分的复杂体系，多年来一直沿袭化学药物的质量控制模式，即选用1～2个指标成分控制中药质量，这与中药所含化学成分复杂，多成分、多靶点协同作用的特性不甚吻合。中药指纹图谱系指中药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱。根据质量控制目的，可分为指纹图谱和特征图谱。指纹图谱是基于图谱的整体信息，用于中药质量的整体评价，确保其内在质量的均一和稳定。特征图谱是选取图谱中某些重要的特征信息，作为控制中药质量的重要鉴别手段。经过十几年的研究和运用，该项技术已日趋成熟，在中药质量标准控制中得到更广泛应用。美国FDA在1996年颁布的《FDA关于植物制品的指南》和2004年的《植物药产品的行业指南》中，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品以指纹图谱进行质量控制，提出了建设性意见。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。2010版《中国药典》首次建立了HPLC“指纹/特征图谱”方法，以控制部分中药品种的质量，2010版《中国药典》收载HPLC指纹图谱共13项，如三七总皂苷、莪术油和积血草总苷等，收载HPLC特征图谱共7项，包括人参总皂苷、茵陈提取物和满山红油等。2015版《中国药典》中，收载HPLC指纹图谱共22项，收载HPLC特征图谱共38项。指纹图谱的应用，可有效控制中药质量，促进中药现代化。采用“特征图谱”方法控制中药质量，只对主要共有特征峰的相对保留时间做出规定，忽略峰面积较小的峰，更符合中药的特点，也是中药质量控制发展的主要方向。

中国药典2015年版菊花的含量测定项下，收载了绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸3种成分，相比菊花中的化学成分的种类而言，这3种成分显然不足以全面代表菊花整体的质量水平。意识到这一问题，有学者已从多指标控制的角度对不同品种菊花间的内在成分进行了对比评估，但多成分的分析带来信息全面的同时，也造成混乱现象。该现状不能很好的对菊花质量进行很好的反映，更不能反映杭菊的质量。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法。通过该方法构建的UPLC特征图谱能够很好的反映杭菊的质量，以该UPLC特征图谱为参照，不仅能够用于杭菊药材的质量监控，还能将杭菊与其他菊花(例如亳菊)鉴别开来，并且还能反映杭菊标准汤剂的质量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，所述的构建方法包括：

供试品溶液制备：取杭菊药材，粉碎，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

参照物溶液制备：取绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述供试品溶液、参照物溶液，注入液相色谱仪，检测，获得杭菊药材的UPLC特征图谱。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.8％～0.12％磷酸溶液，采用梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：Acquity UPLC HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％磷酸溶液，采用梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：柱温为20℃～43℃，流速为0.3mL/min～0.5mL/min，检测波长为220nm～380nm。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：柱温为43℃，流速为0.3mL·min^-1，检测波长为348nm。

在其中一些实施例中，供试品溶液制备中，所述提取采用的溶剂为体积分数为0％～100％的甲醇溶液；所述提取的方式为加热回流或者超声；参照物溶液制备中，所述溶解采用的溶剂为体积分数为50％～100％的甲醇溶液。

在其中一些实施例中，供试品溶液制备中，所述提取采用的溶剂为体积分数为70％的甲醇溶液；所述提取的方式为超声；参照物溶液制备中，所述溶解采用的溶剂为体积分数为甲醇。

在其中一些实施例中，所述的杭菊药材的UPLC特征图谱包含有11个特征峰，其特征在于，所述的杭菊药材的UPLC特征图谱包含有11个特征峰，其中峰2、峰4、峰7、峰9、峰10应与相应参照物峰保留时间相同；与3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％范围之内；规定值为：峰1：0.17，峰3：0.33，峰5：0.84，峰6：0.95，峰8：1.05，峰11：1.80。

本发明的另一目的是提供一种杭菊药材的质量检测方法，所述的质量检测方法包括如下步骤：

供试品溶液制备：取待测杭菊药材，粉碎，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

参照物溶液制备：取绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述供试品溶液、参照物溶液，注入液相色谱仪，检测，获得待测杭菊药材的UPLC图谱；比较所述待测杭菊药材的UPLC图谱与上述构建方法构建的杭菊药材的UPLC特征图谱。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.8％～0.12％磷酸溶液，采用梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：Acquity UPLC HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明以绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷为对照品，配合合适的色谱条件，构建获得杭菊药材的UPLC特征图谱。该UPLC特征图谱包含有11个特征峰，特征峰信息量丰富，可充分展示杭菊药材的化学成分的特征。特别是，以该UPLC特征图谱为参考，还能有效地表征杭菊饮片及标准汤剂的质量、有利于全面监控饮片及标准汤剂产品质量，及鉴别产品的真伪，极大的方便了药材采收、采购、工业生产中的质量控制及相应制剂的质量控制。本发明所构建的特征图谱注重各个构成特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定杭菊药材、饮片及标准汤剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

附图说明

图1、杭菊药材对照特征图谱。

图2、杭菊药材特征波长选择色谱图。

图3、杭菊药材梯度洗脱程序1图。

图4、杭菊药材梯度洗脱程序2图。

图5、杭菊药材特征图谱专属性考察。

图6、21批杭菊药材特征图谱共有模式图。

图7、杭菊药材共有峰指认结果。

图8、毫菊药材鉴别图。

图9、杭菊标准汤剂特征图谱共有峰模式图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1：杭菊药材特征图谱的构建

1、仪器、试剂、试药与评价软件

1.1仪器

Thermo超高效液相色谱仪(Vanquish(DAD)，赛默飞公司)；Waters HSS-T₃柱(100×2.1mm，1.8μm)；Agilent超高效液相色谱仪(1290Infinity，安捷伦公司)；Mettler XP26百万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ5500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，型号：HWS28型)；Milli-Q超纯水净化系统(美国Millipore公司)。

1.2试剂

乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；乙腈(默克股份有限公司，色谱纯)；水为超纯水。

1.3试药

3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(批号：111782-201706)、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸(批号：111894-201102)、木犀草苷(批号：111720-201609)、蒙花苷(批号：111528-201509)、绿原酸(批号：110753-201415)由中国食品药品检定研究院提供；29批菊花药材及饮片详细信息见表1。

表1、菊花药材及饮片来源信息表

批号	品种	产地
			S1	杭菊药材	江苏省
S2	杭菊药材	江苏省
			S3	杭菊药材	江苏省
S4	杭菊药材	江苏省
			S5	杭菊药材	江苏省
S6	杭菊药材	江苏省
			S7	杭菊药材	江苏省
S8	杭菊药材	江苏省
			S9	杭菊药材	浙江省
S10	杭菊药材	浙江省
			S11	杭菊药材	湖北省
S12	杭菊药材	江苏省
			S13	杭菊药材	江苏省
S14	杭菊药材	江苏省
			S15	杭菊药材	江苏省
S16	杭菊药材	湖北省
			S17	杭菊药材	湖北省
S18	杭菊药材	湖北省
			S19	杭菊药材	江苏省
S20	杭菊药材	江苏省
			S21	杭菊药材	江苏省
S22	杭菊药材	江苏省
			S23	杭菊药材	江苏省
S24	杭菊药材	江苏省
			S25	杭菊饮片	江苏省
S26	杭菊饮片	江苏省
			S27	杭菊饮片	江苏省
S28	毫菊	安徽省
			S29	毫菊	安徽省

1.4评价软件

“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012.0版本(国家药典委员会)。本发明采用国家药典委提供的2012.0版本中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所检测的特征图谱进行辨认，操作简单、方便、快捷；且经该软件分析的相似度结果用于质量评估，结论较为客观、准确。

2、色谱条件与供试品溶液的制备

2.1供试品溶液的制备

取杭菊药材适量，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)甲醇溶液25mL，称重，加热回流40min，取出，放冷，再称定重量，70％(v/v)甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2参照物溶液的制备

分别取绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的混合溶液，摇匀，即得。

2.3色谱条件

Acquity UPLC HSST₃C₁₈色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，0.1％(v/v)磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温43℃；流速0.3mL·min^-1；检测波长为348nm。理论板数按3,5-O-二咖啡酰奎宁酸峰计算应不低于50000。

表2、梯度洗脱表

时间/min	A	B
			0～11	8→16	92→84
11～26	16→20	84→80
			26～45	20→43	80→57

2.4测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入超高液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立杭菊药材对照特征图谱，见图1。图1中，峰2：绿原酸；峰4：木犀草苷；峰7：3,5-O-二咖啡酰奎宁酸；峰9：4,5-O-二咖啡酰奎宁酸；峰10：蒙花苷。检测采用色谱仪为Thermo超高效液相色谱仪，色谱柱为Waters Acquity UPLCHSS T₃C₁₈色谱柱。

3、供试品溶液制备方法考察

3.1提取溶媒考察

取杭菊药材粉末(批号：S2，过1号筛)适量，研细，取约0.4g，精密称定，平行5份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、30％(v/v)甲醇溶液、50％(v/v)甲醇溶液、70％(v/v)甲醇溶液、甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)40min，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照“2.3”项下色谱条件进样测定，计算总特征峰面积/称样量。结果如下所示：

表3、菊花特征图谱峰结果(不同提取溶剂考察)

溶剂种类	称样量(g)	总特征峰面积/称样量
			水	0.4030	88.013
30％(v/v)甲醇溶液	0.4006	126.518
			50％(v/v)甲醇溶液	0.4030	140.917
70％(v/v)甲醇溶液	0.4067	145.952
			甲醇	0.4023	87.375

结果表明，70％(v/v)甲醇溶液的提取效果较甲醇、50％(v/v)甲醇溶液好，结合5种溶剂对总特征峰与称样量比值、色谱峰分离效果结果来看，最终选取70％(v/v)甲醇溶液作为提取溶剂。

3.2提取方式考察

分别考察不同提取方式对杭菊药材特征图谱的影响，甲本醇研究选取超声提取和水浴回流两种提取方式进行对比。

超声提取：取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适甲量，醇研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)甲醇溶液25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)40min，放冷，再称定重量，用70％(v/v)甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

回流提取：取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)甲醇溶液25mL，称定重量，水浴回流40min，放冷，再称定重量，用70％(v/v)甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别按“2.3”项下色谱条件进样分析，计算总特征峰面积/称样量。

表4、菊花特征图谱峰结果(不同提取方式考察)

提取方式	称样量(g)	总特征峰面积/称样量
			超声处理	0.4032	150.730
加热回流	0.4010	162.577

实验显示，超声处理和回流提取各色谱峰峰型无明显差别，回流提取较超声提取效率较高，确定提取方式选择为加热回流。

3.3提取时间考察

取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，取约0.4g，精密称定，平行3份，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)甲醇溶液25mL，称定重量，分别加热回流20min、40min、60min，放冷，再称定重量，用70％(v/v)甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照“2.3”项下色谱条件进样测定，计算总特征峰面积/称样量，结果如下所示：

表5菊花特征图谱峰结果(不同提取时间考察)

提取时间(min)	称样量(g)	总特征峰面积/称样量
			20	0.4057	160.912
40	0.4019	162.525
			60	0.4077	161.579

实验结果：不同提取时间总峰面积/称样量值相差较小，峰型无明显差异，当提取时间为40min时，对各成分的提取率已达到最高。故选择提取时间为40min。

4、色谱条件优化

4.1检测波长的确定

取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)甲醇溶液25mL，称定重量，加热回流40min，放冷，用70％(v/v)甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照“2.3”项下色谱条件进样测定，记录190～380nm范围内的吸收光谱。

由实验结果可知，在300nm、325nm绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4-5-二-O-咖啡酰基奎宁酸的色谱峰响应值较高，但其他特征峰的响应值均较348nm波长下的响应值低，在348nm波长下，菊花有机酸和黄酮类均有较好的吸收，由于菊花有机酸和黄酮类成分具有抗菌、抗炎、抗氧化、舒血管、降血脂、抗肿瘤等药理作用，这与菊花散风清热，平肝明目，清热解毒的功效相一致，故选择348nm作为检测波长，结果见图2。

4.2色谱柱的优化

取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，取约0.4g，按“2.1”项方法制备成供试品溶液，分别选择常用色谱柱Waters BEH(100mm×2.1mm，1.7μm)、Waters CotersT₃(100mm×2.1mm，1.6μm)、ACQUITY UPLC HSST₃(100mm×2.1mm，1.8μm)和Agilent SB(100mm×2.1mm，1.8μm)，按“2.3”项下的的色谱条件，进样测定，比较不同色谱柱的分离效果。

实验结果表明，ACQUITY UPLC HSST₃对样品分离效果较好，基线平稳，分离效果最佳，最终选择ACQUITY UPLC HSST₃柱为杭菊药材特征图谱使用柱。

4.3流动相的优化

取同一批供试品溶液(批号：S2)，分别考察流动项乙腈-水、乙腈-0.1％(v/v)磷酸、乙腈-0.1％(v/v)乙酸、甲醇-水、甲醇-0.1％(v/v)磷酸、甲醇-0.1％(v/v)乙酸的洗脱效果，按上述优选的色谱条件进样分析。

实验结果表明，乙腈-0.1％(v/v)磷酸梯度洗脱效果较好，峰信息量相对较多，各个峰的分离效果较好，各成分峰形佳。最终选择乙腈-0.1％(v/v)磷酸作为流动相。

4.4色谱条件梯度优化

在上述优选的色谱条件下，主要色谱峰分离度较差，故对上述色谱方法进行梯度优化。

色谱条件1：Thermo超高效液相色谱仪；色谱柱：Acquity UPLC HSS-T₃(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；流动相：乙腈-0.1％(v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱，见表6：柱温：43℃；检测器：DAD；检测波长：348nm；流速：0.3mL/min；进样体积：1μL。

表6、梯度洗脱程序1

时间(min)	乙腈(％)	0.1％磷酸(％)
			0～10	10→15	90→85
10～35	15→35	85→65
			35～45	35→45	65→55

色谱条件2：色谱仪：Thermo超高效液相色谱仪；色谱柱：Acquity UPLC HSS-T₃(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；流动相：乙腈-0.1％(v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱见表7：柱温：43℃；检测波长：348nm；流速：0.3mL·min^-1；进样体积：1μL。

表7梯度洗脱程序2

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～11	8→16	92→84
11～26	16→20	84→80
			26～45	20→43	80→57

比较两种色谱条件发现，色谱条件2的分离情况较条件1好，色谱峰分布均匀，确定为杭菊药材特征图谱分析条件，结果见图3、图4。

4.5色谱条件的确定

根据上述实验结果，可确定杭菊药材优化后的色谱条件为：选择Acquity UPLCHSS-T₃(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；柱温：43℃；检测波长：348nm；进样体积1μL；以乙腈-0.1％(v/v)磷酸溶液为流动相；流速：0.3mL·min^-1；按表7规定进行梯度洗脱。

5、方法学考察

5.1专属性考察

取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，按“2.1”及“2.2”项下制备成供试品溶液、空白溶剂(70％甲醇)、参照物溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图。结果图5所示。

实验结果：杭菊药材特征图谱5个特征色谱峰不受阴性空白溶剂的干扰，其中药材中特征图谱绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷与参照物溶液的保留时间一致，本方法具有良好的专属性。

5.2精密度考察

取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，按“2.1”项下制备成供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样测定，连续进样6次进行测定，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。结果表明各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2％，结果表明，精密度良好。

5.3重复性考察

取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，按“2.1”项下制备成供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样测定，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。各特征峰的相对保留时间的RSD均小于2％，相对峰面积的RSD<3％，表明该特征图谱方法重复性良好。

5.4稳定性考察

取杭菊药材粉末(批号：S2，过一号筛)适量，研细，按“2.1”项下制备成供试品溶液，按“2.3”项下的的色谱条件进样测定，于室温下放置，在0、2、4、6、8、12、24h进样测定，以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间以及相对峰面积，并计算RSD值。结果表明该特征方法下供试品溶液在24h内稳定。

6、杭菊药材特征图谱的构建

6.1杭菊药材特征图谱的测定

取杭菊药材21批(批号：S1～S21)，按“2.1”项下制备成供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样测定，测定结果见表8、表9所示。

表8、21批菊花药材特征图谱相对峰面积

表9、21批菊花药材特征图谱相对保留时间

结果：21批杭菊药材特征图谱的11个特征峰相对保留时间RSD值在0.08％～1.33％，均小于3.0％，符合菊花药材特征图谱的标准要求；21批杭菊药材特征图谱的11个特征峰相对峰面积的RSD在18.53％～121.33％，表明不同批次特征成分含量有较大差异。

6.2杭菊药材特征图谱的建立

将21批杭菊药材特征图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统》匹配，生成对照图谱，结果见图6及图1。

确定杭菊药材的特征图谱中应呈现11个特征峰，其中峰2、4、7、9、10应与相应参照物峰保留时间相同；以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸参照峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内；规定值为：0.17(峰1)，0.33(峰3)，0.84(峰5)，0.95(峰6)，1.05(峰8)，1.80(峰11)；

7、限度的制订

所测的21批样品，相似度均在0.86以上，考虑目前仅仅收集到21批样品，代表性有所欠缺，初拟定限度为0.85，按照中药指纹相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.85。建议今后根据生产情况考察更多批次的样品，考察限度的合理性。

8、共有峰的指认

采用对照品指认的方法对菊花标汤的特征图谱进行分析研究。具体研究内容如下：

8.1仪器、试剂与试药

仪器：同“1.1仪器”项下。

试剂：同“1.2试剂”项下。

试药：同“1.3试药”项下。

8.2供试品溶液的制备：同“2.1供试品溶液的制备”项下。

8.3参照物溶液的制备：同“2.2参照物溶液的制备”项下。

8.4色谱条件：同“2.3色谱条件”项下。

8.5测定法：同“2.4测定法”项下。

8.6测定结果：

在杭菊药材特征图谱中能找到与绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷保留时间相一致的特征峰，其中绿原酸为杭菊药材特征图谱2号共有特征峰，木犀草苷为杭菊药材特征图谱4号共有特征峰，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸为杭菊药材特征图谱7号共有特征峰，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸为杭菊药材特征图谱9号共有特征峰，蒙花苷为杭菊药材特征图谱10号共有特征峰，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸因该色谱峰分离效果好、含量高、出峰稳定且保留时间适中，选定为参照峰，结果见图7。图7中，峰2：绿原酸；峰4：木犀草苷；峰7：3,5-O-二咖啡酰奎宁酸；峰9：4,5-O-二咖啡酰奎宁酸；峰10：蒙花苷；未知：咖啡酸。

实施例2：一种杭菊药材及饮片的质量检测方法

供试品溶液的制备：取待测杭菊药材(S22-S27)粉末(过一号筛)0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)甲醇溶液25mL，称重，加热回流40min，取出，放冷，再称定重量，用70％(v/v)甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：同“2.2参照物溶液的制备”项下。

色谱条件与系统适应性试验：同“2.3色谱条件”项下。

测定法：同“2.4测定法”项下。

合格指标的建立及制定图谱、判断方法：供试品色谱中应呈现11个特征峰，其中峰2、4、7、9、10应与相应参照物峰保留时间相同；以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸参照峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，规定值为：0.17(峰1)，0.33(峰3)，0.84(峰5)，0.95(峰6)，1.05(峰8)，1.80(峰11)；各峰相对保留时间应该在规定值的±10％之内。且按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照品指纹图谱的相似度不得低于0.85。结果：随机抽取的6批杭菊药材及饮片均符合质量要求。

实施例3：一种毫菊药材的质量检测方法

供试品溶液的制备：取本品粉末(批号：S28、S29，过一号筛)适量，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称重，加热回流40min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：同“2.2参照物溶液的制备”项下。

色谱条件与系统适应性试验：同“2.3色谱条件”项下。

测定法：同“2.4测定法”项下。

合格指标判断方法：暂定毫菊药材的合格指标为供试品色谱中，应呈现10个特征峰。其中峰2、4、7、9应与相应参照物峰保留时间相同；以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸参照峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10之内；规定值为：0.17(峰1)，0.33(峰3)，0.84(峰5)，0.95(峰6)，1.05(峰8)，1.80(峰11)。峰10(蒙花苷)可作为毫菊与杭菊药材的有效鉴别成分，其中，毫菊药材中不应呈现峰10。结果：随机抽取的两批毫菊药材符合质量要求，结果见图8。

实施例3：一种杭菊标准汤剂的质量检测方法

杭菊标准汤剂研究根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中“标准汤剂制备”项的指导原则，参考杭菊药性及入药部位的性状，并参照卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》的前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等指标和参数并进行相关工艺考察；采用低温浓缩和冷冻干燥，最大限度保留中药有效成分，制成菊花标准汤剂的冻干粉。

杭菊标准汤剂的制备：取杭菊饮片(批号：S1-S21)100g，加水煎煮二次，第一次煎煮加12倍量水，浸泡30min，煎煮20min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次煎煮加10倍量水，煎煮15min，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并两次滤液。将合并后的滤液转移至旋转蒸发仪中浓缩(水浴温度：65℃，转速：90转/分钟，真空度：-0.08～-0.1MPa)，浓缩至150mL流浸膏，分装至10mL西林瓶中，每瓶分装体积为2mL，分装完毕后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。

供试品溶液的制备：取杭菊标准汤剂适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)甲醇溶液25ml，称定重量，加热回流40分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％(v/v)甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：同“2.2参照物溶液的制备”项下。

色谱条件与系统适应性试验：同“2.3色谱条件”项下。

测定法：同“2.4测定法”项下。

合格指标判断方法：供试品色谱中应呈现11个特征峰，其中峰2、4、7、9、10应与相应参照物峰保留时间相同；以3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸参照峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，规定值为：0.17(峰1)，0.33(峰3)，0.84(峰5)，0.95(峰6)，1.05(峰8)，1.80(峰11)；各峰相对保留时间应该在规定值的±10％之内，因中药材在煎煮过程中部分化学成分会发生转变，故相似度不作合格指标要求。结果：21批杭菊标准汤剂符合质量要求，结果见图9。

整体上来讲，本发明的上述技术方案，具有如下有益效果：(1)本发明针对杭菊药材存在的质量控制问题，建立了杭菊药材的UPLC特征图谱，同时采用与对照品比对进行相关物质基础研究的确认，指认了5个特征峰，采用本发明建立的杭菊药材的UPLC特征图谱，可充分展示杭菊药材的化学成分的特征，特征峰信息量丰富，该方法重现性良好，准确可靠。(2)本发明提供的杭菊药材的质量控制方法采用国家药典委提供的2012.0版本中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所检测的特征图谱进行辨认，操作简单、方便、快捷；且经该软件分析的相似度结果用于质量评估，结论较为客观、准确。(3)本发明针对现有技术的缺陷，建立杭菊药材的特征图谱质量检测方法，本研究通过特征图谱特征峰的相对保留时间、相似度综合评价杭菊药材、饮片、标准汤剂的质量，较传统的单指标成分含量测定作为质量控制依据更具科学性和可持续性。(4)采用该方法所获得的特征图谱中有11个特征共有峰，其有效地表征杭菊药材、饮片及标准汤剂的质量，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真伪；特征图谱注重各个构成特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定杭菊药材、饮片及标准汤剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。(5)本发明所述的杭菊药材UPLC指纹图谱的检测方法简单，UPLC的线性梯度洗脱的条件简单，便于操作。相比于其他研究者采用HPLC法测定菊花指纹图谱或特征图谱，本研究建立的特征图谱方法更加省时，且溶剂消耗更少。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：

供试品溶液制备：取杭菊药材，粉碎，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

参照物溶液制备：取绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述供试品溶液、参照物溶液，注入液相色谱仪，检测，获得杭菊药材的UPLC特征图谱。

2.根据权利要求1所述的杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.8％～0.12％磷酸溶液，采用梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。

3.根据权利要求2所述的杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：Acquity UPLC HSS-T₃(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％磷酸溶液，采用梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。

4.根据权利要求1至3任一项所述的杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：柱温为20℃～43℃，流速为0.3mL/min～0.5mL/min，检测波长为220nm～380nm。

5.根据权利要求4所述的杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：柱温为43℃，流速为0.3mL·min^-1，检测波长为348nm。

6.根据权利要求1至3任一项所述的杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，供试品溶液制备中，所述提取采用的溶剂为体积分数为0％～100％的甲醇溶液；所述提取的方式为加热回流或者超声；参照物溶液制备中，所述溶解采用的溶剂为体积分数为50％～100％的甲醇溶液。

7.根据权利要求1至3任一项所述的杭菊药材的UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的杭菊药材的UPLC特征图谱包含有11个特征峰，其中峰2、峰4、峰7、峰9、峰10应与相应参照物峰保留时间相同；与3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％范围之内；规定值为：峰1：0.17，峰3：0.33，峰5：0.84，峰6：0.95，峰8：1.05，峰11：1.80。

8.一种杭菊药材的质量检测方法，其特征在于，所述的质量检测方法包括如下步骤：

供试品溶液制备：取待测杭菊药材，粉碎，加溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

参照物溶液制备：取绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、蒙花苷，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

超高效液相色谱检测：吸取所述供试品溶液、参照物溶液，注入液相色谱仪，检测，获得待测杭菊药材的UPLC图谱；比较所述待测杭菊药材的UPLC图谱与权利要求1至7任一项构建方法构建的杭菊药材的UPLC特征图谱。

9.根据权利要求8所述的杭菊药材的质量检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.8％～0.12％磷酸溶液，采用梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。

10.根据权利要求8或9所述的杭菊药材的质量检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的检测条件包括：

固定相：Acquity UPLC HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱；

洗脱梯度：0min～11min，8％→16％流动相A，92％→84％流动相B；11min～26min，16％→20％流动相A，84％→80％流动相B；26min～45min，20％→43％流动相A，80％→57％流动相B。