CN105021724A - 一种丹红注射液uplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丹红注射液UPLC指纹图谱检测方法，其中色谱条件为：色谱柱：HSS？T3column；流动相以0.1％甲酸水为流动相A：乙睛为流动相B，其体积配比为流动相A占97％～3％，流动相B占3～97％，进行梯度洗脱；检测波长：286nm，254nm；柱温：30～50℃，流速：0.3～0.5mL·min^-1，进样量：2μL；依照该方法生成丹红注射液的标准指纹图谱有特征指纹峰24个。本发明检测方法具有精密度高、稳定、重现性好、方法简便的特点，能快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

Description

一种丹红注射液UPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及中药质量控制研究领域，尤其涉及一种丹红注射液UPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

指纹图谱是针对中药化学成分的多样性与复杂性而提出的有效控制中药材或中成药质量的一种质量控制方法。中药指纹图谱作为中药复方制剂中化学物质的整体表征，综合多指标成分定量测定的局部特征来表达中药复方整体性，具有整体性、全面性、层次性、关联性和动态性等特点，特别适用于中药复杂体系研究的需要。鉴于中药注射液“安全、有效、质量可控”，对其质量控制方法也日趋达成共识。指纹图谱质控技术需要科研、教育单位与生产结合起来，才能逐步建立起符合中药特色的指纹图谱质控技术体系。

截至目前，在中药的生产和流通中，还没有一种质量控制手段能够全面、综合地反应中药产品质量的差异，并有效地进行全过程的质量控制。近年来，中药注射剂的不良反应事件不断增多，涉及的品种也较多；中药注射液的质量不能仅测定单一成分进行评价，因此建立一种综合评价中药质量的方法具有非常重要的意义。

丹红注射液由山东丹红制药有限公司独家生产，现行质量标准：WS-11220(ZD-1220)-2002，其国家药品批准文号为：国药准字Z20026866，由丹参、红花2味中药制备而成，具有活血化瘀，通脉舒络的功效。用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，证见：胸痛，胸闷，心悸，口眼歪斜，言语蹇涩，肢体麻木，活动不利等症，其在治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、瘀血型肺心病、缺血性脑病、脑血栓方面具有突出的疗效。对于目前丹红注射液，我们先前申请公开号CN103926364A的专利，该专利公开其指纹图谱测定方法，其中指纹图谱样品的测定时间需76min，且仅对丹红注射液中10个指标成分进行控制。因此上述方法存在耗时较长，且检测的指标成分有限的缺陷。因此，我们开展丹红注射液UPLC指纹图谱检测方法研究，由于丹红注射液中化学成分众多，结构比较复杂，其中含有紫外吸收好的酚酸类和黄酮类化合物。而UPLC具有分离效率高、分离速度快、检测灵敏度高、重现性好、应用范围广等特点，适合在实际生产中作为质量控制技术手段，也是目前在中药指纹图谱研究中应用最多的方法，并且UPLC对酚酸类化合物具有非常好的检测效果。

本发明建立的丹红注射液UPLC指纹图谱，为丹红注射液质量控制研究提供实验依据，为全面、科学评价丹红注射液及产品质量提供了检测方法，对提高丹红注射液质量控制标准具有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种丹红注射液UPLC指纹图谱检测方法，该方法具有全面、快速、可靠的优点。通过该方法获得比较全面的多种成分的指纹图谱信息，从而能为丹红注射液内在质量全面控制提供参考依据。该方法具有检测灵敏度高、快速、准确、获得的指纹图谱具有特征峰多、重现性好等特点。

本发明所述丹红注射液，均是指由山东丹红制药有限公司生产的中药注射液。

具体的制备方法如下：取丹参750g、红花250g，加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30(65℃)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20～1.30(65℃)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量达80～85％，冷藏，取上清液，加入约为投料量1％的活性炭，搅拌30分钟，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水至配置量，搅匀，加热煮沸40～50分钟，冷藏，滤过，滤液浓缩至配置量的1/3，冷藏，滤过，滤液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，加热煮沸40～50分钟，加入约为药液量0.5％的活性炭，搅匀，药液温度降至50℃，静置，滤过，滤液经超滤后，加入约为药液量0.5％的活性炭，滤过，滤液加注射用水至1000mL，调节pH值至6.5～7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。

以下是对上述丹红注射液所建立的UPLC指纹图谱测定方法，该方法包括如下的步骤：

(a)对照品溶液的制备：取迷迭香酸对照品，精密称定，加10％甲醇制成每毫升含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；

(b)供试品溶液的制备：精密量取丹红注射液2mL，置于10mL棕色量瓶中，加入10％甲醇至刻度线，摇匀，即可；

(c)色谱条件：色谱柱：BEH C18或HSST3；流动相以0.1％甲酸水为流动相A，乙睛为流动相B，其体积配比为流动相A占97％～3％，流动相B占3～97％，进行梯度洗脱；检测波长：286nm，柱温：30～50℃，流速：0.3～0.5mL·min^-1，进样量：2μL；

(d)将步骤(a)和(b)制备的溶液，依次注入超高效液相色谱仪中，按照步骤(c)的色谱条件进行测定。

优选的，所述检测方法步骤(c)中的色谱条件为，色谱柱的型号为HSS T3；柱温：40℃，流速：0.4mL·min^-1。

优选的，所述检测方法步骤(c)色谱条件中流动相所采用的梯度洗脱条件为：

0min时，流动相A所占的体积比为97％，流动相B占的体积比为3％；

7～13min时，流动相A所占的体积比为81％，流动相B占的体积比为19％；

18min时，流动相A所占的体积比为75％，流动相B占的体积比为25％。

进一步地，按照上述所建立的UPLC指纹图谱测定方法，测定丹红注射液指纹图谱，依照该方法生成的指纹图谱中有24个共有峰，以迷迭香酸为参照峰，其它共有峰的相对保留时间应为规定值的±5％：1号峰：0.089±0.0045；2号峰：0.111±0.0056；3号峰：0.179±0.0090；4号峰：0.226±0.0113；5号峰：0.245±0.0123；6号峰：0.274±0.0137；7号峰：0.322±0.0161；8号峰：0.344±0.0172；9号峰：0.372±0.0186；10号峰：0.407±0.0204；11号峰：0.442±0.0221；12号峰：0.482±0.0241；13号峰：0.505±0.0253；14号峰：0.630±0.0315；15号峰：0.735±0.0368；16号峰：0.764±0.0382；17号峰：0.860±0.0430；18号峰：0.962±0.0481；19号峰：0.977±0.0489；20号峰(S)：1.000；21号峰：1.081±0.0541；22号峰：1.348±0.0674；23号峰：1.384±0.0692；24号峰：1.650±0.0825。

再进一步地，依照该方法生成的UPLC指纹图谱特征峰中，以迷迭香酸为参照峰，得到30批丹红注射液的共有峰(峰面积占总峰面积＞3％)的相对峰面积为：4号峰：1.011±0.287；5号峰：1.595±0.285；9号峰：1.802±0.222；14号峰：0.475±0.054；17号峰：0.478±0.098；20号峰(S)：1.000；22号峰：0.897±0.184；24号峰：1.415±0.309。

更进一步地，依照该方法生成的UPLC指纹图谱中有24个共有峰：1号峰为胞苷、2号峰为尿苷、3号峰未鉴定、4号峰为5-羟甲基糠醛、5号峰为丹参素、6号峰为原儿茶酸、7号峰为绿原酸、8号峰未鉴定、9号峰为原儿茶醛、10号峰为原紫草酸、11号峰为羟基红花黄色素A、12号峰为咖啡酸、13号峰为6-羟基山柰酚-二-O-β-D-葡萄糖苷、14号峰未鉴定、15号峰为丹酚酸I、16号峰为丹酚酸H、17号峰为丹酚酸D、18号峰为丹酚酸E、19号峰为丹酚酸E异构体、20号峰(S)为迷迭香酸、21号峰为异丹酚酸A、22号峰为丹酚酸B、23号峰为异丹酚酸B/E、24号峰为丹酚酸A。

所述指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)评价指纹图谱相似度，286nm检测波长下的相似度均大于0.95。

本发明所建立的丹红注射液UPLC指纹图谱测定方法，具有重现性好、稳定性可靠的特点，可应用于丹红注射液质量控制。

本发明具体有以下有益效果：

1、本发明建立的丹红注射液UPLC指纹图谱的检测方法，以迷迭香酸为参照峰，建立了30批丹红注射液的UPLC指纹图谱，共24个共有峰。采用了超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-DAD/ESI-Q-TOF-MS)，对丹红注射液的指纹图谱共有峰进行了分析研究，鉴定了丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、羟基红花黄色素A(HYSA)、丹酚酸A、丹酚酸B等成分，鉴定了丹红注射液中的21个共有峰。进一步阐明了丹红注射液的化学物质基础。

上述测定的24个有效成分能较全面表征丹红注射液内在质量。上述测定成分中丹参素、丹酚酸I、丹酚酸H、迷迭香酸、丹酚酸A等成分，现代药理学实验表明，这些有效成分可抑制血小板聚集，具有抗血栓的作用，与丹红注射液具有活血化瘀，通脉舒络的功效相关，能有效的保证成品的质量，对丹红注射液的质量控制具有重要作用。

3、本发明建立的丹红注射液的UPLC指纹图谱测定方法，可用于丹红注射液的质量控制与评价，是全面评价质量的有效手段。首先通过大量实验筛选出最佳的流动相组成及其梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱等分析条件，制定标准指纹图谱。本发明建立的丹红注射液UPLC指纹图谱检测方法，各批次丹红注射液特征峰相对保留时间基本一致，说明该分析方法稳定性较好。实验结果表明，该方法具有精密度高，重现性、稳定性好的特点，说明该检测方法能够测定丹红注射液中的有效成分。

4、本发明采用UPLC-DAD技术，建立了丹红注射液的指纹图谱，选取的峰面积占总峰面积大于3％的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间RSD值均小于3.54％，基本符合指纹图谱方法学研究要求。

5、本发明利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对30批次的丹红注射液进行了UPLC指纹图谱相似度分析，相似度均在0.95以上，说明丹红注射液UPLC指纹图谱方法科学、可行、操作简便、方法可靠，可以科学、有效地评价丹红注射液的质量，并且证实能够应用于实际生产的质量控制中，满足企业对产品质量控制的需求。

附图说明

图1为丹红注射液标准指纹图谱，其中图1中1号峰为胞苷、2号峰为尿苷、3号峰未鉴定、4号峰为5-羟甲基糠醛、5号峰为丹参素、6号峰为原儿茶酸、7号峰为绿原酸、8号峰未鉴定、9号峰为原儿茶醛、10号峰为原紫草酸、11号峰为羟基红花黄色素A、12号峰为咖啡酸、13号峰为6-羟基山柰酚-二-O-β-D-葡萄糖苷、14号峰未鉴定、15号峰为丹酚酸I、16号峰为丹酚酸H、17号峰为丹酚酸D、18号峰为丹酚酸E、19号峰为丹酚酸E异构体、20号峰(S)为迷迭香酸、21号峰为异丹酚酸A、22号峰为丹酚酸B、23号峰为异丹酚酸B/E、24号峰为丹酚酸A。

图2为丹红注射液指纹图谱延迟测试色谱图

图3为30批次丹红注射液的指纹图谱。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。

除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中所述的“UPLC”指的是超高效液相色谱；“丹红注射液”均指的是由山东丹红制药有限公司生产，其处方配比和制备方法在以上的发明内容部分有确切的含义。

实施例1：丹红注射液指纹图谱测定方法的建立

1.1仪器

超高液相色谱仪，(Waters ACQUITY UPLC system，美国Waters公司)，纯/超纯水仪(Milli-Q，美国Millipore公司)，涡旋振荡器(Votex-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，低温高速离心机(J25，美国Thermo Forma公司)，十万分之一天平(METTLER TOLEDO AX205，瑞士METTLER公司)，超声波清洗机(SCIENTZ SB 25-12DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2试药

标准品：腺苷(批号：110879-200202)、尿苷(批号：110887-200202)、苯丙氨酸(批号：140676-200405)、5-羟甲基糠醛(5-HMF，批号：111626-200906)、原儿茶酸(批号：110809-200604)、原儿茶醛(批号：110810-200506)、咖啡酸(批号：110885-200102)、丹酚酸B(批号：111562-201110)、羟基红花黄色素A(HYSA，批号：111637-201106)、购自中国食品药品检定研究院；丹参素、胞苷、紫草酸、丹酚酸A、迷迭香酸、丹酚酸C和紫丁香苷均购自天津中新药业技术中心，纯度均大于98.0％。乙腈(美国Sigma-Aldrich有限公司)，甲酸(天津市大茂化学试剂厂)，纯净水(实验室自制)。

样品：丹红注射液批号分别为13011043(批次1)、13011037(批次2)、13011030(批次3)、13011023(批次4)、13011007(批次5)、13011006(批次6)、13010001(批次7)、12121055(批次8)、12121047(批次9)、12121039(批次10)、12111056(批次11)、12111048(批次12)、12111040(批次13)、12111031(批次14)、12111024(批次15)、12091018(批次16)、12091001(批次17)、12081064(批次18)、12081050(批次19)、12081037(批次20)、12071045(批次21)、12071001(批次22)、12061050(批次23)、12061042(批次24)、12061036(批次25)、12061020(批次26)、12061007(批次27)、12051006(批次28)、12051076(批次29)、12051069(批次30)、12031007(方法学研究用)由山东丹红制药有限公司提供。

1.3供试品溶液的制备

精密量取丹红注射液2mL，置于10mL棕色量瓶中，加入10％甲醇至刻度，摇匀，即可。

1.4对照品溶液的制备：

取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每毫升含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。

1.5对照试验

吸取迷迭香酸对照品溶液2μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图和保留时间，即得。

1.6色谱条件：

色谱柱：HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；流动相以0.1％甲酸水为流动相A，以乙睛为流动相B，其体积配比为流动相A占97％～3％，流动相B占3～97％，进行梯度洗脱；具体洗脱体积浓度配制比为：

0min时，流动相A所占的体积比为97％，流动相B占的体积比为3％；

7min～13min时，流动相A所占的体积比为81％，流动相B占的体积比为19％；

18min时，流动相A所占的体积比为75％，流动相B占的体积比为25％。

检测波长：286nm，柱温：40℃，流速：0.4mL·min^-1，精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录18min色谱图，得到丹红注射液指纹图谱。

1.7共有峰的确定

分析30批丹红注射液指纹图谱信息，获得24个共有峰，以20号峰(迷迭香酸)为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积；将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)评价指纹图谱相似度。通过标准品比对，进一步结合UPLC-DAD/ESI-Q-TOF-MS获得的准分子离子信息、二级碎片信息以及参考相关文献，鉴定了21个共有峰。

实验结果显示：供试品指纹图谱中共有24个特征峰，以参照峰迷迭香酸的保留时间和峰面积为1，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，其相对保留时间应为规定值的±5％之内。

依照本发明测定方法生成的指纹图谱中有24个特征峰，以迷迭香酸为参照峰，得到丹红注射液各个峰的相对保留时间，其相对保留时间应为规定值的±5％：1号峰：0.089±0.0045；2号峰：0.111±0.0056；3号峰：0.179±0.0090；4号峰：0.226±0.0113；5号峰：0.245±0.0123；6号峰：0.274±0.0137；7号峰：0.322±0.0161；8号峰：0.344±0.0172；9号峰：0.372±0.0186；10号峰：0.407±0.0204；11号峰：0.442±0.0221；12号峰：0.482±0.0241；13号峰：0.505±0.0253；14号峰：0.630±0.0315；15号峰：0.735±0.0368；16号峰：0.764±0.0382；17号峰：0.860±0.0430；18号峰：0.962±0.0481；19号峰：0.977±0.0489；20号峰(S)：1.000；21号峰：1.081±0.0541；22号峰：1.348±0.0674；23号峰：1.384±0.0692；24号峰：1.650±0.0825。

依照本发明测定方法生成的指纹图谱中有24个特征峰，以迷迭香酸为参照峰，得到丹红注射液的各个峰相对峰面积为：4号峰：1.011±0.287；5号峰：1.595±0.285；9号峰：1.802±0.222；14号峰：0.475±0.054；17号峰：0.478±0.098；20号峰(S)：1.000；22号峰：0.897±0.184；24号峰：1.415±0.309。

丹红注射液指纹图谱中24个共有峰中，经过分析，1号峰为胞苷、2号峰为尿苷、3号峰未鉴定、4号峰为5-羟甲基糠醛、5号峰为丹参素、6号峰为原儿茶酸、7号峰为绿原酸、8号峰未鉴定、9号峰为原儿茶醛、10号峰为原紫草酸、11号峰为羟基红花黄色素A、12号峰为咖啡酸、13号峰为6-羟基山柰酚-二-O-β-D-葡萄糖苷、14号峰未鉴定、15号峰为丹酚酸I、16号峰为丹酚酸H、17号峰为丹酚酸D、18号峰为丹酚酸E、19号峰为丹酚酸E异构体、20号峰(S)为迷迭香酸、21号峰为异丹酚酸A、22号峰为丹酚酸B、23号峰为异丹酚酸B/E、24号峰为丹酚酸A。

1.8方法学研究

1.8.1精密度试验

取同一份供试品溶液，按照“1.6项”下色谱条件进样，连续进样6次，记录色谱图，以20号峰作为参照峰，计算各个峰的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间及相对峰面积结果见表1、表2。

表1丹红注射液指纹图谱研究的精密度考察结果(相对保留时间)

表2丹红注射液指纹图谱研究的精密度考察结果(相对峰面积)

结果表明，峰面积占总峰面积大于3％的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间基本一致(RSD<3％)，表明仪器精密度良好。

1.8.2重现性试验

取同一批次丹红注射液，按照“1.3项”下方法制备供试品溶液6份，按照“1.6项”下色谱条件进样，记录色谱图，以20号峰作为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积。重现性试验色谱峰的相对保留时间和相对峰面积结果见表3、表4。

表3丹红注射液指纹图谱研究的重现性考察结果(相对保留时间)

表4丹红注射液指纹图谱研究的重现性考察结果(相对峰面积)

结果表明，峰面积占总峰面积大于3％的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间基本一致(RSD<3.54％)，表明该方法重复性良好。

1.8.3稳定性试验

取同一份供试品溶液，按照“1.6”项下色谱条件进样，在相同条件下分别于0、2、4、6、8、10、12h进行测定，记录色谱图，以20号峰作为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积结果见表5、表6。

表5丹红注射液指纹图谱研究的稳定性考察结果(相对保留时间)

表6丹红注射液指纹图谱研究的稳定性考察结果(相对峰面积)

结果表明，峰面积占总峰面积大于3％的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间基本一致，表明丹红注射液在12h内稳定性良好。

1.8.4延迟测试

取丹红注射液，按照“1.3项”下方法制备供试品溶液，按照“1.6项”下色谱条件进样，延长测试时间至1h，观察有无滞后峰出现。结果表明：无滞后峰出现。

实施例2：30批次丹红注射液指纹图谱的建立

2.1供试品溶液的制备

精密量取30个不同批次丹红注射液2mL，分别置于10mL棕色量瓶中，加入10％甲醇至刻度线，摇匀，即可。

2.2色谱条件：

色谱柱：ACQUITYHSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；流动相以0.1％甲酸水为流动相A，乙睛为流动相B，其体积配比为流动相A占97％～3％，流动相B占3～97％，进行梯度洗脱；具体洗脱体积浓度配制比为：

0min时，流动相A所占的体积比为97％，流动相B占的体积比为3％；

7min～13min时，流动相A所占的体积比为81％，流动相B占的体积比为19％；

18min时，流动相A所占的体积比为75％，流动相B占的体积比为25％；

检测波长：286nm，柱温：40℃，流速：0.4mL·min^-1，精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录18min色谱图，得到30批次丹红注射液指纹图谱，并记录丹红注射液共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

从表8中可以看出，30批丹红注射液共有峰中峰面积占总峰面积大于3％的有8个共有峰，通过对8个共有峰的相对峰面积的分析，其RSD值的范围为11.449～28.407％。

对30批丹红注射液中各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的比较分析，并建立丹红注射液UPLC指纹图谱，UPLC指纹图谱的建立为丹红注射液的质量控制提供了可靠依据，可应用于丹红注射液的质量控制与评价，提高丹红注射液的质量检测标准。

2.3相似度评价与分析

将30批丹红注射液的色谱图导入国家药典委员会开发的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)，对30批丹红注射液的UPLC指纹图谱进行相似度评价与分析，进而评价丹红注射液的质量。

通过对30批丹红注射液色谱图的相似性评价，由表9结果可知，30批丹红注射液指纹图谱相似度均大于0.95，说明丹红注射液工艺和质量稳定。

表9 30批丹红注射液指纹图谱相似度考察结果

综述上述表明，本发明建立的指纹图谱方法稳定可靠，可作为控制丹红注射液质量的控制方法。该指纹图谱所表征的丹红注射液整体的质量信息，可应用于真伪鉴别及成分检测。

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种丹红注射液UPLC指纹图谱检测方法，所述的丹红注射液是由丹参和红花原料药，以3:1的组份配比，进行提取，纯化制备而成，其特征在于，该检测方法包括如下的步骤：

(a)对照品溶液的制备：取迷迭香酸对照品，精密称定，加10％甲醇制成每毫升含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；

(b)供试品溶液的制备：精密量取丹红注射液2mL，置于10mL棕色量瓶中，加入10％甲醇至刻度线，摇匀，即可；

(c)色谱条件：色谱柱：ACQUITYBEH C18或ACQUITYHSS T3；流动相以0.1％甲酸水为流动相A，乙睛为流动相B，其体积配比为流动相A占97％～3％，流动相B占3～97％，进行梯度洗脱；检测波长：286nm，柱温：30～50℃，流速：0.3～0.5mL·min^-1，进样量：2μL；

(d)将步骤(a)和(b)制备的溶液，注入超高效液相色谱中，按照步骤(c)的色谱条件进行测定。

2.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，所述检测方法步骤(c)的色谱条件中，色谱柱的型号为ACQUITYHSS T3；柱温：40℃，流速：0.4mL·min^-1。

3.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，所述检测方法步骤(c)中的色谱条件中，其流动相所采用的梯度洗脱条件为：

0min时，流动相A所占的体积比为97％，流动相B占的体积比为3％；

7min～13min时，流动相A所占的体积比为81％，流动相B占的体积比为19％；

18min时，流动相A所占的体积比为75％，流动相B占的体积比为25％。

4.如权利要求1-3任一所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，依照该方法生成的指纹图谱中有24个特征峰，并以迷迭香酸为参照峰，得到共有峰的相对保留时间，其相对保留时间应为规定值的±5％：1号峰：0.089±0.0045；2号峰：0.111±0.0056；3号峰：0.179±0.0090；4号峰：0.226±0.0113；5号峰：0.245±0.0123；6号峰：0.274±0.0137；7号峰：0.322±0.0161；8号峰：0.344±0.0172；9号峰：0.372±0.0186；10号峰：0.407±0.0204；11号峰：0.442±0.0221；12号峰：0.482±0.0241；13号峰：0.505±0.0253；14号峰：0.630±0.0315；15号峰：0.735±0.0368；16号峰：0.764±0.0382；17号峰：0.860±0.0430；18号峰：0.962±0.0481；19号峰：0.977±0.0489；20号峰(S)：1.000；21号峰：1.081±0.0541；22号峰：1.348±0.0674；23号峰：1.384±0.0692；24号峰：1.650±0.0825。

5.如权利要求4所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，依照该方法生成的指纹图谱特征峰，相对峰面积为：4号峰：1.011±0.287；5号峰：1.595±0.285；9号峰：1.802±0.222；14号峰：0.475±0.054；17号峰：0.478±0.098；20号峰：1.000；22号峰：0.897±0.184；24号峰：1.415±0.309。

6.如权利要求4或5所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，依照该方法生成的指纹图谱中有24个特征峰为：1号峰为胞苷、2号峰为尿苷、3号峰未鉴定、4号峰为5-羟甲基糠醛、5号峰为丹参素、6号峰为原儿茶酸、7号峰为绿原酸、8号峰未鉴定、9号峰为原儿茶醛、10号峰为原紫草酸、11号峰为羟基红花黄色素A、12号峰为咖啡酸、13号峰为6-羟基山柰酚-二-O-β-D-葡萄糖苷、14号峰未鉴定、15号峰为丹酚酸I、16号峰为丹酚酸H、17号峰为丹酚酸D、18号峰为丹酚酸E、19号峰为丹酚酸E异构体、20号峰为迷迭香酸、21号峰为异丹酚酸A、22号峰为丹酚酸B、23号峰为异丹酚酸B/E、24号峰为丹酚酸A。

7.根据权利要求1-3任一所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版进行评价，286nm检测波长下的相似度均大于0.95。

8.如权利要求1-3任一所述指纹图谱测定方法在丹红注射液成分检测中的应用。