CN106645450B - 新生化颗粒的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新生化颗粒的质量检测方法，本发明通过UHPLC‑TQ‑MS/MS测定分析，实现对新生化颗粒中的27个化学成分含量进行检测。该方法操作简便，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价新生化颗粒的质量，对控制质量和保证疗效具有重要意义。

Description

新生化颗粒的质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药复方的质量控制方法，具体涉及一种具有治疗产后出血、流产后子宫修复等产后疾病的新生化颗粒的质量检测方法。
背景技术
中药在预防和治疗疾病方面扮演着尤为重要的作用。中药配伍是在中国独特文化下影响而形成的独特的药物使用方式，临床上几味中药通常配伍使用以期达到增效减毒的作用。新生化颗粒来源于清代傅青山的妇科名著《傅青主女科》的“生化汤”，由当归、益母草、川芎、桃仁、干姜、红花和甘草组成，具有活血、止痛、祛瘀的功效，历来被称为“产后第一方”。临床上，新生化颗粒常用来治疗产后出血、流产后子宫修复等产后疾病。
复方中化学成分在配伍前后的定性和定量分析是研究复方药效物质基础的首要环节。新生化颗粒的有效成主要分为以下五类：芳香酸类、苯酞类、生物碱类、黄酮类和姜辣素类，这五类物质与新生化颗粒的活血、养血和止痛功效紧密相连。目前，对新生化颗粒中有效成分的研究，主要在于检测新生化颗粒单味药中有效成分的溶出度，对新生化颗粒中有效成分配伍前后化学成分变化规律的研究涉及较少。通常，新生化颗粒中的有效成分的含量在配伍前后会发生较大变化，这也是发挥其药效的潜在物质基础，由于新生化颗粒中化合物结构的复杂性，常规的分析仪器很难达到较好的分析效果。近来，超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UHPLC-TQ-MS/MS)由于其具有高选择性、高灵敏度的特点，已经被成功的用于对复杂成分的分析。
因此，开发一种简便易行、检测成本低廉，且可同时定量分析多种活性成分的分析方法，对于新生化颗粒的质量控制具有重要意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(UHPLC-TQ-MS/MS)，同时检测新生化颗粒中27种活性成分。该方法简便、快速，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价新生化颗粒制剂的质量，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
1.一种新生化颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定适量的对照品，用甲醇溶解配制成以下对照品溶液：1号样品：葫芦巴碱，2号样品：盐酸水苏碱，3号样品：尿嘧啶，4号样品：原儿茶酸，5号样品：羟基红花黄色素A，6号样品：绿原酸，7号样品：苦杏仁苷，8号样品：咖啡酸，9号样品：盐酸益母草碱，10号样品：芦丁，11号样品：对香豆酸，12号样品：甘草苷，13号样品：阿魏酸，14号样品：山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷，15号样品：姜酮，16号样品：异甘草苷，17号样品：洋川芎内酯I，18号样品：洋川芎内酯H,19号样品：甘草素，20号样品：槲皮素，21号样品：山奈酚，22号样品：甘草酸，23号样品：6-姜辣素，24号样品：洋川芎内酯A，25号样品：藁本内酯，26号样品：正丁烯基苯酞和27号样品：6-姜烯酚的混合对照品贮备液，低温条件下贮藏对照品贮备液，样品进样前，离心，取其上清液，备用；
(2)供试品溶液的制备
取重量比例为80:100:30:8:5:5:5的当归、益母草、川芎、桃仁、红花、炙甘草和姜炭七味药材，粉碎过筛，采用8～15倍量水提取2～3次，每次1～2h，合并水提液，离心，取上清液，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液，备用；
(3)含量测定
取步骤(1)制备得到的混合对照品贮备液，采用逐级稀释法，用体积浓度80～90％的甲醇稀释混合对照品贮备液，制成系列不同浓度的对照品溶液，然后取系列不同浓度的对照品溶液按一定的色谱条件进行UHPLC-TQ-MS/MS测定分析，以系列对照品溶液的浓度作为横坐标x，以测得的相应标准品的峰面积作为纵坐标y，得各对照品的线性回归方程；
取步骤(2)得到的供试品溶液，按一定的色谱条件进行UHPLC-TQ-MS/MS测定分析，并根据各对照品的线性回归方程计算供试品溶液中各化合物的含量。
作为优选方案，以上所述的新生化颗粒的质量检测方法，步骤(1)对照品溶液的制备方法为：
分别精密称定适量的对照品，用甲醇溶解配制成以下对照品溶液：1号样品：18.360μg/mL葫芦巴碱，2号样品：116.560μg/mL盐酸水苏碱，3号样品：1.295μg/mL尿嘧啶，4号样品：2.280μg/mL原儿茶酸,5号样品：56.958μg/mL羟基红花黄色素A，6号样品：7.056μg/mL绿原酸，7号样品：28.162μg/mL苦杏仁苷，8号样品：13.80μg/mL咖啡酸，9号样品：23.49μg/mL盐酸益母草碱，10号样品：4.561μg/mL芦丁，11号样品：4.245μg/mL对香豆酸,12号样品：7.056μg/mL甘草苷，13号样品：22.169μg/mL阿魏酸,14号样品：2.192μg/mL山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷,15号样品：3.720μg/mL姜酮,16号样品：0.391μg/mL异甘草苷，17号样品：13.056μg/mL洋川芎内酯I，18号样品：13.362μg/mL洋川芎内酯H,19号样品：1.216μg/mL甘草素，20号样品：1.537μg/mL槲皮素,21号样品：1.090μg/mL山奈酚，22号样品：24.584μg/mL甘草酸，23号样品：7.622μg/mL 6-姜辣素,24号样品：15.19μg/mL洋川芎内酯A，25号样品：17.45μg/mL藁本内酯,26号样品：1.1025μg/mL丁烯基苯酞和27号样品：0.333μg/mL 6-姜烯酚的混合对照品贮备液，4℃条件下贮藏对照品溶液，样品进样前，13000r/min离心10min，取其上清液，备用。
作为优选方案，以上所述的新生化颗粒的质量检测方法，步骤(2)供试品溶液的制备方法为：
取重量比例为80:100:30:8:5:5:5的当归、益母草、川芎、桃仁、红花、炙甘草和姜炭七味药材，粉碎过40目筛，采用8倍量水提取3次，第1次2h，后两次各1.5h，合并3次水提液，离心，取上清液，用0.22μm的微孔滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液，备用。
作为优选方案，以上所述的新生化颗粒的质量检测方法，步骤(3)UHPLC-TQ-MS/MS测定分析为：
色谱分析条件为：
色谱柱：规格为100mm×3mm,1.9m的Thermo Scientific Hypersil GOLD，流动相：A相为0.1％甲酸溶液和B为乙腈，流速：0.4～0.8mL/min，梯度洗脱：0～2min，5％～5％B；2～12min，5％～40％B；12～18min，40％～95％B；18～19min，95％～5％B；19～20min，5％～5％B，柱温：30～35℃，进样体积为2μL；
质谱检测条件：
采用多反应检测模式；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：520℃；毛细管电压：3.0kV；锥孔气流量：30L/h；碰撞气流量：0.15mL/min；脱溶剂气流量：1000L/h；取样锥孔电压及碰撞能量见下表；
作为优选方案，以上所述的新生化颗粒的质量检测方法，其特征在于，步骤(3)各对照品的线性回归方程如下表：
供试品提取方法的筛选
新生化颗粒以其七味药的水提物为基础，采用现代制剂工艺优选而制得。由于实验室操作和工业生产存在很大的不同，本实验采用单变量法对样品的提取溶剂用量(8倍量，6倍量，4倍量)、提取次数(1次，2次，3次)和提取时间(2h，1.5h，1h)，进行系统的考察，为找出最佳的提取条件奠定基础。提取溶剂的结果显示：8倍量溶剂提取，提取效率最好；提取3次，才能将样品中的有效成分基本提取完全；提取分别用时2h、1.5h、1.5h，提取效率较高。由此可知，优化的供试品的提取条件为：加水提取，以8倍量水提取3次，提取时间分别为2h、1.5h和1.5h。
色谱条件的优化
本发明对色谱柱、流动相、梯度洗脱程序、柱温、流速进行了优化，以期27个分析物在短时间内得到较好的分离和峰形。首先，比较了Thermo Scientific Hypersil GOLD(100mm×3mm,1.9μm)色谱柱与ACQUITY HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱，结果表明前者对目标化合物的分离效能较好。接着对流动相体系进行了大量考察，考察对象为不同浓度的甲酸水溶液(0.1％，0.2％和0.5％)和甲醇、乙腈等常用的色谱溶剂。结果表明，乙腈对于新生化颗粒中的分析物的分离能力优于甲醇；然而由于新生化颗粒中存在多种类型的化合物，某些化合物尤其是芳香酸类成分存在拖尾的现象，当于水相中加入0.1％的甲酸时，目标分析物的拖尾现象基本消失。此外，对柱温和流速也进行了相应的考察，表明35℃柱温，流速为0.4mL/min时，分离效果最佳。
质谱条件的优化
本发明采用全扫模式(正离子模式和负离子模式)优化27个化合物的质谱参数。结果显示，有机酸类成分和大部分黄酮类成分在负离子模式下得到更好的响应；而生物碱类成分、苯酞类成分和姜辣素类成分在正离子模式下有更好的峰强度和灵敏度。因此，目标分析物通过它们的信号强度和灵敏度选择其检测模式。随后，锥孔电压和毛细管电压由Intellistart软件自动优化。尽管洋川芎内酯I和洋川芎内酯H能够产生相同的m/z离子对，它们可以根据极性差异于色谱图上达到基线分离。对大多数的姜辣素类成分而言(6-姜辣素、6-姜烯酚和姜酮)，m/z 137的碎片离子可以检测到。
有益效果：本发明提供的新生化颗粒的质量检测方法和现有技术相比具有以下优点：
本发明根据新生化颗粒中活性成分的结构性质特点，通过大量实验优选出最佳的提取方法，UHPLC-TQ-MS/MS的色谱分析条件和质谱检测条件，经方法学验证本发明提供的检测方法，精密度好，准确性高，稳定性好，具有简便、快速、稳定性好，可以客观、全面、准确地评价新生化颗粒的质量，对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
1.一种新生化颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定适量的对照品，用甲醇溶解配制成以下对照品溶液：1号样品：18.360μg/mL葫芦巴碱，2号样品：116.560μg/mL盐酸水苏碱，3号样品：1.295μg/mL尿嘧啶，4号样品：2.280μg/mL原儿茶酸,5号样品：56.958μg/mL羟基红花黄色素A，6号样品：7.056μg/mL绿原酸，7号样品：28.162μg/mL苦杏仁苷，8号样品：13.80μg/mL咖啡酸，9号样品：23.49μg/mL盐酸益母草碱，10号样品：4.561μg/mL芦丁，11号样品：4.245μg/mL对香豆酸,12号样品：7.056μg/mL甘草苷，13号样品：22.169μg/mL阿魏酸,14号样品：2.192μg/mL山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷,15号样品：3.720μg/mL姜酮,16号样品：0.391μg/mL异甘草苷，17号样品：13.056μg/mL洋川芎内酯I，18号样品：13.362μg/mL洋川芎内酯H,19号样品：1.216μg/mL甘草素，20号样品：1.537μg/mL槲皮素,21号样品：1.090μg/mL山奈酚，22号样品：24.584μg/mL甘草酸，23号样品：7.622μg/mL 6-姜辣素,24号样品：15.19μg/mL洋川芎内酯A，25号样品：17.45μg/mL藁本内酯,26号样品：1.1025μg/mL丁烯基苯酞和27号样品：0.333μg/mL 6-姜烯酚的混合对照品贮备液，4℃条件下贮藏对照品溶液，样品进样前，13000r/min离心10min，取其上清液，备用；
(2)供试品溶液的制备
称取699g重量比例为80:100:30:8:5:5:5的当归、益母草、川芎、桃仁、红花、炙甘草和姜炭的七味药材，粉碎过40目筛，采用8倍量水提取3次，第1次2h，后两次各1.5h，合并3次水提液，离心，取上清液，用0.22μm的微孔滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液，备用。
(3)含量测定
取步骤(1)制备得到的混合对照品贮备液，采用逐级稀释法(每次稀释10倍，一共稀释5个浓度)，用体积浓度80～90％的甲醇稀释混合对照品贮备液，制成系列不同浓度的对照品溶液，然后取系列不同浓度的对照品溶液按一定的色谱条件进行UHPLC-TQ-MS/MS测定分析，以系列对照品溶液的浓度作为横坐标x，以测得的相应标准品的峰面积作为纵坐标y，得各对照品的线性回归方程；
取步骤(2)得到的供试品溶液，按一定的色谱条件进行UHPLC-TQ-MS/MS测定分析，并根据各对照品的线性回归方程计算供试品溶液中各化合物的含量。
步骤(3)UHPLC-TQ-MS/MS测定分析为：
色谱分析条件为：
色谱柱：规格为100mm×3mm,1.9m的Thermo Scientific Hypersil GOLD，流动相：A相为0.1％甲酸溶液和B为乙腈，流速：0.4～0.8mL/min，梯度洗脱：0～2min，5％～5％B；2～12min，5％～40％B；12～18min，40％～95％B；18～19min，95％～5％B；19～20min，5％～5％B，柱温：30～35℃，进样体积为2μL；
质谱检测条件：
采用多反应检测模式；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：520℃；毛细管电压：3.0kV；锥孔气流量：30L/h；碰撞气流量：0.15mL/min；脱溶剂气流量：1000L/h；取样锥孔电压及碰撞能量见下表1；
表1
步骤(3)各对照品的线性回归方程如下表2：
表2
新生化颗粒中27个有效成分的含量测定结果如表3所示：
表3新生化颗粒中27个有效成分的含量测定结果
实施例2方法学考察
1、精密度、重复性和稳定性试验
精密度考查：按实施例1的色谱条件下，取同一份对照品溶液分别于同一天内重复进样6次和3日内连续重复进样3次测定27个标准品的峰面积，用各标准品下峰面积的相对标准偏差(RSD)评价日内、日间精密度。
重复性考查：按实施例1步骤2供试品溶液的制备方法，取七味药材粉末，平行制备6份供试品溶液，按以上实施例1的色谱条件，经UHPLC-TQ-MS/MS分析，以供试样品中各指标成分含量的RSD值来评价其重复性。
稳定性考查：取供试溶液，在0、2、4、8、16和24h时，分别注入UHPLC-TQ-MS/MS，按以上实施例1的色谱条件分析，以27个分析物中峰面积的RSD值来评价所有样品溶液的稳定性。
2、回收率试验
在已知27个成分含量的新生化颗粒供试品溶液中，分别按已知相应分析物含量的80％，100％，120％的3个水平加入相应对照品，供试品溶液按实施例1步骤2的方法制备，并经UHPLC-TQ-MS/MS分析(按以上实施例1的色谱条件分析)，所有供试品均用以上实施例1线性回归方程测定，计算其回收率。
3、统计学分析
所有结果均采用平均值±标准差(mean±SD)表示。SPSS 19.0软件被用来分析样品中的含量变化，采用ANOVA中的Dunnett法进行统计学差异分析，，P<0.05表示差异具有统计学意义。
4、实验结果
实验通过测定线性关系、LOD、LOQ、重复性、日内精密度、日间精密度、稳定性及加样回收率，对本发明建立的UHPLC-TQ-MS/MS方法进行了验证。结果如表2和表3。新生化颗粒中27个成分的回归方程的相关系数均大于0.9954，表明目标分析物的线性较好，相应对照品的LOD和LOQ分别在0.53-10.98ng/mL和1.93-31.85ng/mL的范围内。日内、日间精密度的RSD范围分别为0.98％-3.07％和1.24％-4.06％；重复性和稳定性的RSD范围分别为1.64％-4.32％和1.59％-4.26％；27个化合物的加样回收率结果在94.87％-100.06％，相应的RSD范围为1.49％-4.96％。以上方法学的考察结果如表4表明，本发明建立的UHPLC-TQ-MS/MS实验方法可以用于新生化颗粒及其单味药中的27个成分的测定。
表4新生化颗粒中27个成分的精密度、重复性、稳定性、回收率和基质效应测定结果
以上实验结果表明，本发明提供的新生化颗粒的质量检测方法简便、快速、稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确地评价新生化颗粒的质量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种新生化颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
分别精密称定适量的对照品，用甲醇溶解配制成以下对照品溶液：1号样品：葫芦巴碱，2号样品：盐酸水苏碱，3号样品：尿嘧啶，4号样品：原儿茶酸，5号样品：羟基红花黄色素A，6号样品：绿原酸，7号样品：苦杏仁苷，8号样品：咖啡酸，9号样品：盐酸益母草碱，10号样品：芦丁，11号样品：对香豆酸，12号样品：甘草苷，13号样品：阿魏酸，14号样品：山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷，15号样品：姜酮，16号样品：异甘草苷，17号样品：洋川芎内酯I，18号样品：洋川芎内酯H,19号样品：甘草素，20号样品：槲皮素，21号样品：山奈酚，22号样品：甘草酸，23号样品：6-姜辣素，24号样品：洋川芎内酯A，25号样品：藁本内酯，26号样品：正丁烯基苯酞和27号样品：6-姜烯酚的混合对照品贮备液，低温条件下贮藏对照品贮备液，样品进样前，离心，取其上清液，备用；
(2)供试品溶液的制备
取重量比例为80:100:30:8:5:5:5的当归、益母草、川芎、桃仁、红花、炙甘草和姜炭七味药材，粉碎过筛，采用8～15倍量水提取2～3次，每次1～2h，合并水提液，离心，取上清液，经0.22μm的微孔滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液，备用；
(3)含量测定
取步骤(1)制备得到的混合对照品贮备液，采用逐级稀释法，用体积浓度80～90％的甲醇稀释混合对照品贮备液，制成系列不同浓度的对照品溶液，然后取系列不同浓度的对照品溶液按一定的色谱条件进行UHPLC-TQ-MS/MS测定分析，以系列对照品溶液的浓度作为横坐标x，以测得的相应标准品的峰面积作为纵坐标y，得各对照品的线性回归方程；
取步骤(2)得到的供试品溶液，按一定的色谱条件进行UHPLC-TQ-MS/MS测定分析，并根据各对照品的线性回归方程计算供试品溶液中各化合物的含量；
所述的UHPLC-TQ-MS/MS测定分析的色谱分析条件为：
色谱柱：规格为100mm×3mm,1.9m的Thermo Scientific Hypersil GOLD，流动相：A相为0.1％甲酸溶液和B为乙腈，流速：0.4～0.8mL/min，梯度洗脱：0～2min，5％～5％B；2～12min，5％～40％B；12～18min，40％～95％B；18～19min，95％～5％B；19～20min，5％～5％B，柱温：30～35℃，进样体积为2μL；
质谱检测条件：
采用多反应检测模式；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：520℃；毛细管电压：3.0kV；锥孔气流量：30L/h；碰撞气流量：0.15mL/min；脱溶剂气流量：1000L/h；取样锥孔电压及碰撞能量见下表；
2.根据权利要求1所述的新生化颗粒的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)对照品溶液的制备方法为：
分别精密称定适量的对照品，用甲醇溶解配制成以下对照品溶液：1号样品：18.360μg/mL葫芦巴碱，2号样品：116.560μg/mL盐酸水苏碱，3号样品：1.295μg/mL尿嘧啶，4号样品：2.280μg/mL原儿茶酸,5号样品：56.958μg/mL羟基红花黄色素A，6号样品：7.056μg/mL绿原酸，7号样品：28.162μg/mL苦杏仁苷，8号样品：13.80μg/mL咖啡酸，9号样品：23.49μg/mL盐酸益母草碱，10号样品：4.561μg/mL芦丁，11号样品：4.245μg/mL对香豆酸,12号样品：7.056μg/mL甘草苷，13号样品：22.169μg/mL阿魏酸,14号样品：2.192μg/mL山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷,15号样品：3.720μg/mL姜酮,16号样品：0.391μg/mL异甘草苷，17号样品：13.056μg/mL洋川芎内酯I，18号样品：13.362μg/mL洋川芎内酯H,19号样品：1.216μg/mL甘草素，20号样品：1.537μg/mL槲皮素,21号样品：1.090μg/mL山奈酚，22号样品：24.584μg/mL甘草酸，23号样品：7.622μg/mL 6-姜辣素,24号样品：15.19μg/mL洋川芎内酯A，25号样品：17.45μg/mL藁本内酯,26号样品：1.1025μg/mL正丁烯基苯酞和27号样品：0.333μg/mL 6-姜烯酚的混合对照品贮备液，4℃条件下贮藏对照品溶液，样品进样前，13000r/min离心10min，取其上清液，备用。
3.根据权利要求1所述的新生化颗粒的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)供试品溶液的制备方法为：
取重量比例为80:100:30:8:5:5:5的当归、益母草、川芎、桃仁、红花、炙甘草和姜炭七味药材，粉碎过40目筛，采用8倍量水提取3次，第1次2h，后两次各1.5h，合并3次水提液，离心，取上清液，用0.22μm的微孔滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液，备用。
4.根据权利要求1所述的新生化颗粒的质量检测方法，其特征在于，步骤(3)各对照品的线性回归方程如下表：
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