CN109655565B - 益母草膏的指纹图谱检测方法 - Google Patents

益母草膏的指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了益母草膏的指纹图谱检测方法，该方法包括以下步骤：步骤1、益母草膏供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的益母草指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次益母草的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成益母草的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的益母草指纹图谱，能全面，客观地表征益母草的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

益母草膏的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体地说，涉及一种益母草膏的指纹图谱检测方法及其指纹图谱。
背景技术
益母草膏具有活血调经的作用，用于血瘀所致的月经不调、产后恶露不绝，症见月经量少、淋漓不净、产后出血时间过长；产后子宫复旧不全见上述证候者。
中药指纹图谱是国际公认的控制中药质量的一种研究模式和技术平台，它通过分析中药有效成分和无效成分的种类和含量分布信息，使中药的研究方法和质量分析手段由针对一个或者少数几个活性成分的分析，发展为对整个中药化学指纹图谱的综合分析，具有普适性和经济性。中药指纹图谱可反映中药多成分协同作用、多层次复杂性及整体性。
现行药典标准中仅有薄层色谱法相关内容是不够的，采用高效液相色谱法建立一种益母草膏指纹图谱对于准确控制益母草膏的质量具有重要意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，开发一种益母草膏的指纹图谱检测方法，通过本发明的方法可以保证益母草膏的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保益母草膏的安全性和有效性。
技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种益母草膏的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
步骤1、益母草膏供试品溶液的制备：
取益母草膏，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含0.5％体积盐酸的甲醇，密塞，称定质量，超声处理，放冷，用含0.5％体积盐酸的甲醇补足减失的重量，静置，上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
步骤2、混合对照品溶液的制备：
分别取盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、槲皮素和芦丁对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，加甲醇配成混合对照品溶液，置4℃冰箱备用；
步骤3、分别精密吸取步骤1的供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的益母草膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次益母草膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成益母草膏的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
作为优选方案，以上所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，步骤1益母草膏供试品溶液的制备方法为：精密称取益母草膏1.0g，，置150ml具塞锥形瓶中，精密加入含0.5％体积盐酸的甲醇15～50ml，密塞，称定质量，超声处理15～45min，放冷，用含0.5％体积盐酸的甲醇补足减失的重量，静置2h，上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
作为优选方案，以上所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，步骤2对照品溶液的制备方法为：分别取盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、槲皮素和芦丁对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为425μg/ml、387μg/ml、447μg/ml、469μg/ml的对照品储备液，置4℃冰箱备用；然后分别精密吸取上述对照品溶液适量加甲醇定容至10ml，制成每1ml含盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、槲皮素和芦丁为42.5μg、38.7μg、44.7μg、46.9μg的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含0.1％磷酸体积的水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml·min-1，柱温25～40℃，检测波长200～360nm。
作为优选方案，以上所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，梯度洗脱如下表：
Figure BDA0001937255410000021
作为优选方案，以上所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，色谱柱为Purospher STAR LP RP-18endcapped，规格为4.6*250mm，5μm。
作为优选方案，以上所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，得到的益母草膏指纹图谱中有9个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1：20.073min；共有峰2：22.414min；共有峰3：25.407min；共有峰4：27.323min；共有峰5：31.673min；共有峰6：33.207min；共有峰7：35.066；共有峰8：51.014min；共有峰9：62.401min。
作为优选方案，以上所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，其中2号峰为盐酸益母草碱、3号峰为芦丁、6号峰为盐酸水苏碱、8号峰为槲皮素。
指纹图谱检测条件的优化实验：
(1)不同流动相的选择：选择水-乙腈、水-甲醇、0.1％磷酸水-乙腈、0.1％磷酸水-甲醇等流动相系统进行检测，检测结果显示，选择0.1％磷酸水-乙腈系统基线平稳、峰形、各峰分离度情况较好。故选择以含0.1％磷酸体积的水作为流动相A，以乙腈为流动相B进行洗脱。
(2)由于益母草膏含有生物碱、黄酮等性质完全不同的多种有效成分，本发明还通过大量实验筛选出最佳的梯度洗脱程序，最终实现良好的分离度。
(3)不同检测波长的选择：分别在波长为180nm、202nm、254nm下进行检测，检测结果显示在202nm下各特征峰强度较好，故选择202nm作为检测波长。
(4)不同流速的选择：分别在流速为0.5ml·min-1、1.0ml·min-1、1.5ml·min-1下进行检测，检测结果显示流速在1.0ml·min-1下各特征峰分离度较好，故选择流速为1.0ml·min-1。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所建立的益母草膏指纹图谱检测方法，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等的优点。能有效地表征益母草膏的质量，有利于全面监控药物的质量。
(2)本发明建立的指纹图谱，可同时检测9个共有峰，并且可标定盐酸益母草碱、芦丁、盐酸水苏碱和槲皮素，注重整体面貌特征，可避免因测定个别化学成分而判定益母草膏质量的片面性。
附图说明
图1为本发明混合标准品色图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种益母草膏的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
步骤1、益母草膏供试品溶液的制备：
分别取180501～180510的10批待测益母草膏，精密称定1.0g，置150ml具塞锥形瓶中，精密加入含0.5％体积盐酸的甲醇50ml，密塞，称定质量，在250w，40KHz的条件下超声处理30min，放冷，用含0.5％体积盐酸的甲醇补足减失的重量，静置2h，上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得10批供试品溶液；
步骤2、混合对照品溶液的制备
对照品溶液的制备：分别取盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、槲皮素和芦丁对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为425μg/ml、387μg/ml、447μg/ml、469μg/ml的对照品储备液，置4℃冰箱备用；分别精密吸取上述对照品溶液适量加甲醇定容至10ml，制成每1ml含盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、槲皮素和芦丁为42.5μg、38.7μg、44.7μg、46.9μg的混合对照品溶液。
步骤3、分别精密吸取步骤1的10批供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的10批益母草膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次益母草膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成益母草膏的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
步骤3的色谱条件为：
色谱柱：Purospher STAR LP RP-18endcapped，4.6*250mm，5μm。
流动相：A相：含0.1％体积磷酸的水；B相：乙腈；检测波长：202nm；流速：1.0ml·min-1，柱温：30℃；
梯度洗脱程序为：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
15 81 19
42 72 28
47 67 33
53 66 34
66 53 47
70 0 100
液相色谱仪为日本岛津公司Shimadze LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和柱温箱CTO-20A。
获得的指纹图谱共有9个共有峰，通过对对照品溶液和供试品溶液同时检测，鉴别出其中2号峰为盐酸益母草碱、3号峰为芦丁、6号峰为盐酸水苏碱、8号峰为槲皮素。见图1。
指纹图谱检测的方法学研究：
1、精密度考察
取批号为180503的益母草膏，按照上述供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，测得盐酸益母草碱峰面积RSD为0.11％，芦丁峰面积RSD为0.20％，盐酸水苏碱峰面积RSD为0.11％，槲皮素峰面积RSD为0.25％，结果表明本试验仪器精密度良好。
2、稳定性考察
取批号为180503的益母草膏，按照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例中的色谱条件分别于0,2,4,8,12,24h进样，记录四个成分的峰面积积峰值，结果显示盐酸益母草碱RSD为0.29％，芦丁RSD为0.24％，盐酸水苏碱RSD为0.16％，槲皮素RSD为0.25％。结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3、重复性考察
取批号为180503的益母草膏样品6份，按照上述供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，测得盐酸益母草碱峰面积RSD为0.24％，芦丁峰面积RSD为0.29％，盐酸水苏碱峰面积RSD为0.26％，槲皮素峰面积RSD为0.14％，结果表明本试验方法重复性良好。
以上实验结果表明，本发明提供的益母草指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价益母草的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种益母草膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、益母草膏供试品溶液的制备：
精密称取益母草膏1.0g，置150ml具塞锥形瓶中，精密加入含0.5%体积盐酸的甲醇15～50ml，密塞，称定质量，超声处理15～45min，放冷，用含0.5%体积盐酸的甲醇补足减失的重量，静置2h，上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
步骤2、混合对照品溶液的制备：
分别取盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、槲皮素和芦丁对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为425μg/ml、387μg/ml、447μg/ml、469μg/ml的对照品储备液，置4℃冰箱备用；然后分别精密吸取上述对照品储备液 适量加甲醇定容至10ml，制成每1ml含盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、槲皮素和芦丁为42.5μg、38.7μg、44.7μg、46.9μg的混合对照品溶液；
步骤3、分别精密吸取步骤1的供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4、将步骤3中获得的益母草膏供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次益母草膏的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成益母草膏的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分;
所述的步骤3中高效液相色谱仪检测的色谱条件为：色谱柱为Purospher STAR LP RP-18 endcapped，以含0.1%磷酸体积的水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5～1 .5ml·min-1，柱温25～40℃，检测波长200～360nm;
梯度洗脱如下表：
时间/min 流动相A/体积% 流动相B/体积% 0 95 5 15 81 19 42 72 28 47 67 33 53 66 34 66 53 47 70 0 100
。
2.据权利要求1所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，得到的益母草膏指纹图谱中有 9个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1：20.073min；共有峰2：22.414min；共有峰3：25.407min；共有峰4：27.323min；共有峰5：31.673min；共有峰6：33.207min；共有峰7：35.066；共有峰8：51.014min；共有峰9：62.401min。
3.据权利要求2所述的一种益母草膏的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中共有峰2为盐酸益母草碱、共有峰3为芦丁、共有峰6为盐酸水苏碱、共有峰8为槲皮素。
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