CN114235996B - 鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒特征图谱构建及检测方法 - Google Patents

鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒特征图谱构建及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒特征图谱构建和检测方法。本发明选择同时适用于鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的超高效液相色谱条件，以药材、标准汤剂或/和中药配方颗粒为供试品进行检测，从而构建特征图谱，该特征图谱包含8个特征峰，峰1为新绿原酸的峰，峰3为绿原酸的峰，峰6为盐酸益母草碱的峰，峰8为芦丁的峰，不仅能够反映鲜益母草药材的质量，而且还能反映鲜益母草标准汤剂和中药配方颗粒的质量，能同时用于鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的质量检测，为鲜益母草及其现代制剂的质量检测提供了有效的方法，也为鲜益母草及其现代制剂的质量综合评价的研究提供科学的实验依据。

Description

鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒特征图谱构建及 检测方法
技术领域
本发明涉及中药制剂检测方法，特别是涉及一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒特征图谱构建和检测方法。
背景技术
鲜益母草，唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分，鲜品于春季幼苗期至初夏花前期采割，是中医妇科常用药，素有“血家圣药”、“经产良药”之称，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒等功效，常用于月经不调、痛经经闭、恶露不尽、水肿尿少、疮疡肿毒等症，经晒干后的益母草也是八宝坤顺丸、八珍益母丸、女金丸、天紫红女金胶囊等益气养血和活血调经良药的主要原料。
鲜益母草药材及其饮片的质量标准收载于2020年版《中国药典》一部，其鉴别方法包括性状、显微及薄层鉴别。依靠现代设备生产的鲜益母草标准汤剂冻干粉、中药配方颗粒等与药材和饮片相比，已失去固有的形态，因此，依据性状和显微观察进行鉴别已不能直接辨别其真伪与质量。
因此，如何提供一种检测方法，该检测方法不仅能够检测鲜益母草药材，还适用于鲜益母草标准汤剂及其中药配方颗粒等的检测，对鲜益母草现代制剂的质量检测至关重要。
发明内容
基于以上技术问题，本发明的目的之一是提供一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，构建所得特征图谱不仅能够反映鲜益母草药材的质量，而且还能反映鲜益母草标准汤剂和中药配方颗粒的质量，能同时用于鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的质量检测。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
提供参照物溶液，所述参照物溶液包含新绿原酸对照品、绿原酸对照品、盐酸益母草碱对照品和芦丁对照品；
用提取溶剂对鲜益母草供试品进行提取，收集提取液，制备供试品溶液，所述鲜益母草供试品为鲜益母草药材、鲜益母草标准汤剂和/或鲜益母草中药配方颗粒；
采用超高效液相色谱法对所述参照物溶液和所述供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，将所述对照图谱和所述检测图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，制定特征图谱；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为磷酸质量百分比为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，
梯度洗脱程序为：0min～11min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至10％；11min～15min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至11％；15min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至12％；22min～28min，所述流动相A的体积百分比由12％上升至16％；28min～30min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至20％；30min～34min，所述流动相A的体积百分比由20％上升至22％；34min～40min，所述流动相A的体积百分比由22％上升至60％；40min～41min，所述流动相A的体积百分比由60％下降至3％；41min～50min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至97％。
在其中一个实施例中，所述特征图谱包含8个峰，峰1为新绿原酸的峰，峰3为绿原酸的峰，峰6为盐酸益母草碱的峰，峰8为芦丁的峰，
以峰3为参照峰，计算峰2与峰3的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，所述峰2对应的规定值为0.90，
以峰6为参照峰，计算峰4、峰5、峰7与峰6的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，所述的峰4、峰5和峰7对应的规定值分别为0.94、0.97和1.19。
在其中一个实施例中，所述色谱柱的规格为：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm～1.8μm。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.23mL/min～0.27mL/min。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：柱温为28℃～32℃。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为270nm～280nm。
在其中一个实施例中，每1mL所述参照物溶液包含12μg～18μg所述新绿原酸对照品、25μg～35μg所述绿原酸对照品、25μg～35μg所述盐酸益母草碱对照品和140μg～160μg所述芦丁对照品。
在其中一个实施例中，所述参照物溶液中的溶解溶剂包含乙醇体积百分比为65％～75％的乙醇水溶液。
在其中一个实施例中，所述鲜益母草供试品为鲜益母草药材，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为回流提取，回流提取的时长为60min～120min。
在其中一个实施例中，所述鲜益母草供试品为鲜益母草标准汤剂，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz。
在其中一个实施例中，所述鲜益母草供试品为鲜益母草中药配方颗粒，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为50％～70％的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz。
一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
用提取溶剂对待测样品进行提取，收集提取液，制备待测品溶液；
采用超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与上述构建方法构建的特征图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为磷酸质量百分比为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，
梯度洗脱程序为：0min～11min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至10％；11min～15min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至11％；15min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至12％；22min～28min，所述流动相A的体积百分比由12％上升至16％；28min～30min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至20％；30min～34min，所述流动相A的体积百分比由20％上升至22％；34min～40min，所述流动相A的体积百分比由22％上升至60％；40min～41min，所述流动相A的体积百分比由60％下降至3％；41min～50min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至97％。
在其中一个实施例中，所述色谱柱的规格为：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm～1.8μm。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.23mL/min～0.27mL/min。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：柱温为28℃～32℃。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为270nm～280nm。
在其中一个实施例中，所述待测样品为鲜益母草药材，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为回流提取，回流提取的时长为60min～120min。
在其中一个实施例中，所述待测样品为鲜益母草标准汤剂，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz。
在其中一个实施例中，所述待测样品为鲜益母草中药配方颗粒，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为50％～70％的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz。
与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明选择同时适用于鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的超高效液相色谱条件，以药材、标准汤剂或/和中药配方颗粒为供试品进行检测，从而构建特征图谱，该特征图谱包含8个特征峰(峰1为新绿原酸的峰，峰3为绿原酸的峰，峰6为盐酸益母草碱的峰，峰8为芦丁的峰)，不仅能够反映鲜益母草药材的质量，而且还能反映鲜益母草标准汤剂和中药配方颗粒的质量，能同时用于鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的质量检测，为鲜益母草及其现代制剂的质量检测提供了有效的方法，也为鲜益母草及其现代制剂的质量综合评价的研究提供科学的实验依据。
采用该特征图谱对鲜益母草药材、标准汤剂和中药配方颗粒进行检测，简单高效，结果客观，精密可靠，专属性强，灵敏度高，稳定性和耐受性好。
本发明首次将超高效液相色谱法应用鲜益母草药材及其现代制剂的质量检测，弥补了鲜益母草药材及现代制剂质量检测的空白，从内在质量上实现了鲜益母草从药材到中药配方颗粒上的质量把控及专属性鉴别，既能解决因原材料外观的缺失而造成标准汤剂、中药配方颗粒鉴别困难的问题，也能从源头至终端产品上削减混伪品给中药市场带来的不良影响，从而确保鲜益母草药材、标准汤剂、配方颗粒的质量，有利于保障临床用药的有效性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为鲜益母草对照品特征图谱；
图2为鲜益母草29批药材叠加特征图谱；
图3为鲜益母草29批标准汤剂叠加特征图谱；
图4为鲜益母草3批配方颗粒叠加特征图谱；
图5为鲜益母草药材对照特征图谱；
图6为鲜益母草标准汤剂对照特征图谱；
图7为鲜益母草配方颗粒对照特征图谱；
图8为鲜益母草药材1、标准汤剂1、配方颗粒1叠加特征图谱；
图9为鲜益母草药材2、标准汤剂2、配方颗粒2叠加特征图谱；
图10为鲜益母草药材3、标准汤剂3、配方颗粒3叠加特征图谱；
图11为鲜益母草花期(花部位)特征图谱；
图12为鲜益母草花期(茎部位)特征图谱；
图13为鲜益母草花期(叶部位)特征图谱；
图14为鲜益母草不同柱温考察(从上到下依次为28℃、30℃、32℃)特征图谱；
图15为鲜益母草不同流速考察(从上到下依次为0.23mL/min、0.25mL/min、0.27mL/min)特征图谱；
图16为鲜益母草不同编号色谱柱考察(从上到下依次为SPZ2018006、BH242、BH258)特征图谱；
图17为鲜益母草待测药材与对照药材特征图谱；
图18为鲜益母草待测标准汤剂与对照标准汤剂特征图谱；
图19为鲜益母草待测配方颗粒与对照中药配方颗粒特征图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明提供一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
提供参照物溶液，所述参照物溶液包含新绿原酸对照品、绿原酸对照品、盐酸益母草碱对照品和芦丁对照品；
用提取溶剂对鲜益母草供试品进行提取，收集提取液，制备供试品溶液，所述鲜益母草供试品为鲜益母草药材、鲜益母草标准汤剂和/或鲜益母草中药配方颗粒；
采用超高效液相色谱法对所述参照物溶液和所述供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，将所述对照图谱和所述检测图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，制定特征图谱；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为磷酸质量百分比为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，
梯度洗脱程序为：0min～11min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至10％；11min～15min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至11％；15min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至12％；22min～28min，所述流动相A的体积百分比由12％上升至16％；28min～30min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至20％；30min～34min，所述流动相A的体积百分比由20％上升至22％；34min～40min，所述流动相A的体积百分比由22％上升至60％；40min～41min，所述流动相A的体积百分比由60％下降至3％；41min～50min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至97％。
在其中一个示例中，所述特征图谱包含8个峰，峰1为新绿原酸的峰，峰3为绿原酸的峰，峰6为盐酸益母草碱的峰，峰8为芦丁的峰，
以峰3为参照峰，计算峰2与峰3的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，所述峰2对应的规定值为0.90，
以峰6为参照峰，计算峰4、峰5、峰7与峰6的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，所述的峰4、峰5和峰7对应的规定值分别为0.94、0.97和1.19。
在其中一个示例中，所述色谱柱的规格为：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm～1.8μm(例如粒径为1.6μm、1.7μm、1.8μm)。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.23mL/min～0.27mL/min。本发明流速例如为0.23mL/min、0.24mL/min、0.25mL/min、0.26mL/min、0.27mL/min。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：柱温为28℃～32℃。本发明的柱温例如为28℃、29℃、30℃、31℃、32℃。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为270nm～280nm。本发明的检测波长例如为270nm、273nm、275nm、277nm、280nm。
在其中一个示例中，每1mL所述参照物溶液包含12μg～18μg所述新绿原酸对照品、25μg～35μg所述绿原酸对照品、25μg～35μg所述盐酸益母草碱对照品和140μg～160μg所述芦丁对照品。例如每1mL所述参照物溶液包含12μg、14μg、16μg、18μg所述新绿原酸对照品，25μg、27μg、29μg、31μg、33μg、35μg所述绿原酸对照品，25μg、27μg、29μg、31μg、33μg、35μg所述盐酸益母草碱对照品，140μg、145μg、150μg、155μg、160μg所述芦丁对照品。
在其中一个示例中，所述参照物溶液中的溶解溶剂包含乙醇体积百分比为65％～75％的乙醇水溶液，例如为乙醇体积百分比为65％、67％、69％、73％、75％的乙醇水溶液。
在其中一个示例中，所述鲜益母草供试品为鲜益母草药材，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％(例如50％、55％、60％、65％、70％)的乙醇水溶液，提取的方式为回流提取，回流提取的时长为60min～120min(例如为60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min)。
在其中一个示例中，所述鲜益母草供试品为鲜益母草标准汤剂，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％(例如为50％、55％、60％、65％、70％)的乙醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min(例如为30min、40min、50min、60min)、功率为250W～300W(例如为250W、260W、270W、280W、290W、300W)、频率为35kHz～45kHz(例如为35kHz、38kHz、40kHz、42kHz、45kHz)。
在其中一个示例中，所述鲜益母草供试品为鲜益母草中药配方颗粒，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为50％～70％(例如为50％、55％、60％、65％、70％)的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min(例如为30min、40min、50min、60min)、功率为250W～300W(例如为250W、260W、270W、280W、290W、300W)、频率为35kHz～45kHz(例如为35kHz、38kHz、40kHz、42kHz、45kHz)。
第二方面，本发明提供一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
用提取溶剂对待测样品进行提取，收集提取液，制备待测品溶液；
采用超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与上述方法构建的特征图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为磷酸质量百分比为0.08％～0.12％(例如为0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％)的磷酸水溶液，
梯度洗脱程序为：0min～11min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至10％；11min～15min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至11％；15min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至12％；22min～28min，所述流动相A的体积百分比由12％上升至16％；28min～30min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至20％；30min～34min，所述流动相A的体积百分比由20％上升至22％；34min～40min，所述流动相A的体积百分比由22％上升至60％；40min～41min，所述流动相A的体积百分比由60％下降至3％；41min～50min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至97％。
在其中一个示例中，所述色谱柱的规格为：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm～1.8μm(例如粒径为1.6μm、1.7μm、1.8μm)。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.23mL/min～0.27mL/min。本发明流速例如为0.23mL/min、0.24mL/min、0.25mL/min、0.26mL/min、0.27mL/min。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：柱温为28℃～32℃。本发明的柱温例如为28℃、29℃、30℃、31℃、32℃。
在其中一个示例中，所述超高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为270nm～280nm。本发明的检测波长例如为270nm、273nm、275nm、277nm、280nm。
在其中一个示例中，所述待测样品为鲜益母草药材，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％(例如50％、55％、60％、65％、70％)的乙醇水溶液，提取的方式为回流提取，回流提取的时长为60min～120min(例如为60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min)。
在其中一个示例中，所述待测样品为鲜益母草标准汤剂，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％(例如为50％、55％、60％、65％、70％)的乙醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min(例如为30min、40min、50min、60min)、功率为250W～300W(例如为250W、260W、270W、280W、290W、300W)、频率为35kHz～45kHz(例如为35kHz、38kHz、40kHz、42kHz、45kHz)。
在其中一个示例中，所述待测样品为鲜益母草中药配方颗粒，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为50％～70％(例如为50％、55％、60％、65％、70％)的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min(例如为30min、40min、50min、60min)、功率为250W～300W(例如为250W、260W、270W、280W、290W、300W)、频率为35kHz～45kHz(例如为35kHz、38kHz、40kHz、42kHz、45kHz)。
实施例1：鲜益母草药材、标准汤剂、中药配方颗粒特征图谱的建立
1.仪器与试药
1.1仪器
Waters ACQUITY型超高效液相色谱系统(包括真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、TUV检测器、Empower数据处理系统，美国Waters公司)；Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)，万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)，数控超声清洗器(KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(HWS28，上海一恒科技有限公司)。
1.2试剂
甲醇为分析纯(西陇科学股份有限公司)，液相用乙腈为色谱纯(默克股份有限公司)，磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为超纯水(取自实验室Milli-Q超纯水系统，默克股份有限公司)。
1.3试药
29批鲜益母草药材主要来源为广西壮族自治区桂林市、河南省驻马店市、江苏省淮安市，河南省南阳市、湖北省随州市、河南省信阳市、山东省临沂市。
29批鲜益母草标准汤剂根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中“研究表征标准汤剂用汤剂的制备”项的指导原则由原药材制备而成。
3批鲜益母草配方颗粒样品均为公司中试生产制备。
对照品：新绿原酸(批号：wkq1803107，含量以98％计，四川维克奇生物科技有限公司)；绿原酸(批号：110753-202018，含量以96.1％计，中国食品药品检定研究院)；盐酸益母草碱(批号：111823-201704，含量以94.3％计，中国食品药品检定研究院)；芦丁(批号：100080-201811，含量以91.7％计，中国食品药品检定研究院)。
2.方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)；
柱温：30℃；
进样量：1μL；
检测波长：277nm；
以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表中规定的梯度进行洗脱，流速为0.25mL/min。
表1、流动相梯度洗脱条件
Figure BDA0003394461490000101
Figure BDA0003394461490000111
2.2供试品溶液制备
药材：取鲜益母草药材适量，切碎，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％(v/v)乙醇水溶液50mL，密塞，称定重量，回流提取60min，放冷，再称定重量，用70％(v/v)乙醇水溶液补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
标准汤剂：取鲜益母草药材经前处理、煎煮、低温浓缩、冷冻干燥制成的鲜益母草标准汤剂的冻干粉适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇体积浓度为70％乙醇水溶液，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙醇体积浓度为70％的乙醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
中药配方颗粒：取鲜益母草药材经前处理、提取、浓缩、喷雾干燥、制粒干压包装所得的中药配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇体积浓度为70％甲醇水溶液，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3参照物溶液制备
分别取新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁对照品适量，精密称定，加乙醇体积浓度为70％乙醇水溶液制成每1mL含新绿原酸15μg、绿原酸30μg、盐酸益母草碱30μg、芦丁150μg的混合溶液，即得参照物溶液。
2.4测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得鲜益母草药材、标准汤剂、中药配方颗粒特征图谱。
2.5色谱峰指认
采用新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁等对照品进行定位，结果表明：峰1：新绿原酸；峰3：绿原酸；峰6：盐酸益母草碱；峰8：芦丁，见图1。图1为鲜益母草对照品特征图谱。
2.6参照峰和共有峰的选择
测定29批不同产地鲜益母草药材所得色谱图，确定了8个共有峰，见图2。图2为鲜益母草29批药材叠加特征图谱。
测定29批自生产鲜益母草标准汤剂所得色谱图，确定了8个共有峰，见图3。图3为鲜益母草29批标准汤剂叠加特征图谱。
测定3批中试生产的鲜益母草配方颗粒所得色谱图，确定了8个共有峰，见图4。图4为鲜益母草3批中药配方颗粒叠加特征图谱。
2.7对照特征图谱的建立和相似度评价
将29批鲜益母草药材、29批鲜益母草标准汤剂、3批鲜益母草配方颗粒色谱图各导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用中位数法生成各自的叠加特征图谱(见图2、图3、图4)和对照特征图谱(见图5、图6、图7)，29批鲜益母草药材、标准汤剂相似度均在0.8以上，3批鲜益母草配方颗粒相似度均在0.9以上。
2.8鲜益母草药材、标准汤剂、中药配方颗粒的一致性分析
将3批中试生产的鲜益母草药材、对应的标准汤剂及中药配方颗粒色谱图各导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用中位数法生成各自的叠加特征图谱，以试三批中试药材作为参照图谱，进行相似度比较，比较结果如下表2，三批药材、标准汤剂、中药配方颗粒的叠加图谱见图8、图9、图10。
表2、三批中试药材、标准汤剂、配方颗粒相似度一致性分析
编号 相似度 编号 相似度 编号 相似度
药材1 1.000 药材2 1.000 药材3 1.000
标准汤剂1 0.965 标准汤剂2 0.956 标准汤剂3 0.974
中药配方颗粒1 0.978 中药配方颗粒2 0.953 中药配方颗粒3 0.980
根据表2可知，鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的图谱相似度极高，这说明以药材为供试品构建的特征图谱不仅能反映药材的质量从而可用于药材的检测，同样也反映标准汤剂和中药配方颗粒的质量从而可用于标准汤剂和中药配方颗粒的检测，反之，亦然。
2.9鲜益母草药材质量鉴别及应用对比例
鲜益母草为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分。鲜品于春季幼苗期至初夏花前期采割。此处取已处于花期，即非鲜益母草的采收期，可作为伪品进行质量控制与鉴别分析。为了更全面体现该样品的差异，将其地上部分分为花、叶、茎三个部位进行测定。按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液1μL，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，结果见图11、图12、图13。
试验结果显示，与正品鲜益母草药材所规定采收时间的色谱图比较，处于花期的鲜益母草花中峰7、8的含量极低，由茎叶分离测定可知鲜益母草的芦丁含量主要集中在叶部位，但是花期之后，随着花的开放增多，鲜益母草的叶的比例明显下降，处于花期的鲜益母草茎干变大，植株较高，叶子逐渐分化脱落，花的比例逐渐增加。因此，处于花期的鲜益母草即为混淆品，与规定采收期的鲜益母草药材对比，由于少了叶子中芦丁的贡献，且茎中芦丁含量极低，故最终花期整体呈现的芦丁的含量较春季幼苗期至初夏花前期采割的鲜益母草明显下降，即指认的芦丁的色谱峰可作为鲜益母草混淆品的鉴别分析，且鲜益母草标准汤剂、中药配方颗粒与其对应药材的相似度极高，三者色谱图的一致性较强，因此，芦丁色谱峰的特点同时也可作为鲜益母草非规定采收期制备的标准汤剂、配方颗粒的鉴别点。
3.方法学考察
3.1精密度试验
取鲜益母草药材(YGX2103004)、标准汤剂(GT2103004)、中药配方颗粒(CG2105095)样品各1份，按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取同一供试品溶液1μL，连续进样6次，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，其中新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；与绿原酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算特征峰2与S1峰的相对保留时间、相对峰面积，与盐酸益母草碱参照物峰相对应的峰为S2峰，计算特征峰4、峰5、峰7与S2峰的相对保留时间、相对峰面积。
精密度试验结果显示，鲜益母草药材各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.11％，相对峰面积RSD值均小于1.25％；鲜益母草标准汤剂各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.08％，相对峰面积RSD值均小于3.26％；鲜益母草中药配方颗粒各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.05％，相对保留时间RSD值均小于2.13％；表明仪器精密度良好。
3.2重复性试验
取鲜益母草药材(YGX2103004)、标准汤剂(GT2103004)、中药配方颗粒(CG2105095)样品各6份，按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液1μL，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，其中新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；与绿原酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算特征峰2与S1峰的相对保留时间、相对峰面积，与盐酸益母草碱参照物峰相对应的峰为S2峰，计算特征峰4、峰5、峰7与S2峰的相对保留时间、相对峰面积。
鲜益母草药材各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.54％，相对峰面积RSD值均小于3.55％；鲜益母草标准汤剂各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.17％，相对峰面积RSD值均小于1.54％；鲜益母草配方颗粒各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.06％，相对峰面RSD值均小于1.87％；表明该方法重复性良好。
3.3稳定性试验
取鲜益母草药材(YGX2103004)、标准汤剂(GT2103004)、中药配方颗粒(CG2105095)样品各1份，按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别于0，2，4，6，8，12，24h进样，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，其中新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；与绿原酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算特征峰2与S1峰的相对保留时间、相对峰面积，与盐酸益母草碱参照物峰相对应的峰为S2峰，计算特征峰4、峰5、峰7与S2峰的相对保留时间、相对峰面积。稳定性试验结果显示，鲜益母草药材各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.12％，相对峰面积RSD值均小于1.46％；鲜益母草标准汤剂各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.21％，相对峰面积RSD值均小于2.50％；鲜益母草配方颗粒各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.12％，相对峰面积RSD值均小于2.12％；表明该方法稳定性良好。
3.4耐用性
柱温考察：比较了28℃、30℃、32℃的色谱图，结果显示30℃的色谱峰峰形最佳，分离度最好，见图14。
流速考察：比较了0.23mL/min、0.25mL/min、0.27mL/min的色谱图，结果显示0.25mL/min的色谱峰峰形最佳，分离度最好，见图15。
色谱柱考察：比较了同型号三根不同编号色谱柱的色谱图，三根色谱柱色谱峰峰形均佳，分离度均较好，见图16。
实施例2：一种鲜益母草药材的检测方法
(1)供试品溶液的制备
取待测鲜益母草药材，切碎，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇水溶液50mL，密塞，称定重量，回流提取60min，放冷，再称定重量，用70％乙醇水溶液补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)检测
精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，所述超高效液相色谱仪的条件同实施例1中“2.1色谱条件”项。待测药材的检测图谱如图17所示。
通过与图5比较，可知，该待测样品的检测图谱能检出8个特征峰，与鲜益母草对照药材对照特征图谱的相似度为0.936，其中新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；其中，特征峰2与S1峰相对保留时间为0.904，符合规定值为：0.90(峰2)±10％之内；特征峰4、峰5、峰7与S2峰的相对保留时间分别为0.938、0.972、1.187，符合规定值0.94(峰4)±10％之内、0.97(峰5)±10％之内、1.19(峰7)±10％之内。可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格药材。
实施例3：一种鲜益母草标准汤剂的检测方法
(1)供试品溶液的制备
取鲜益母草待测标准汤剂的冻干粉适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇体积浓度为70％乙醇水溶液，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％的乙醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)检测
精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，所述超高效液相色谱仪的条件同实施例1中“2.1色谱条件”项。待测标准汤剂的检测图谱如图18所示。
通过与图6比较，可知，该待测样品的检测图谱能检出8个特征峰，与鲜益母草标准汤剂对照特征图谱的相似度为0.969，其中新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；其中，特征峰2与S1峰相对保留时间为0.903，符合规定值为：0.90(峰2)±10％之内；特征峰4、峰5、峰7与S2峰的相对保留时间分别为0.939、0.973、1.189，符合规定值0.94(峰4)±10％之内、0.97(峰5)±10％之内、1.19(峰7)±10％之内。可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格标准汤剂。
实施例4：一种鲜益母草中药配方颗粒的检测方法
(1)供试品溶液的制备
取鲜益母草待测中药配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇体积浓度为70％甲醇水溶液，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)检测
精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，所述超高效液相色谱仪的条件同实施例1中“2.1色谱条件”项。待测中药配方颗粒的检测图谱如图19所示。
通过与图7比较，可知，该待测样品的检测图谱能检出8个特征峰，与鲜益母草中药配方颗粒对照特征图谱的相似度为0.904，其中新绿原酸、绿原酸、盐酸益母草碱、芦丁4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应；其中，特征峰2与S1峰相对保留时间为0.970，符合规定值为：0.90(峰2)±10％之内；特征峰4、峰5、峰7与S2峰的相对保留时间分别为0.940、0.975、1.191，符合规定值0.94(峰4)±10％之内、0.97(峰5)±10％之内、1.19(峰7)±10％之内。可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格中药配方颗粒。
综上，本发明针对鲜益母草药材、标准汤剂、中药配方颗粒存在的质量控制局限的技术问题，提供一种鲜益母草药材、标准汤剂、中药配方颗粒特征图谱的构建方法，该构建方法根据鲜益母草药材、标准汤剂、中药配方颗粒的特点，合理控制超高效液相色谱条件，构建得到鲜益母草药材、标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱，该特征图谱可用于鲜益母草药材、标准汤剂和中药配方颗粒的质量检测，弥补鲜益母草药材、标准汤剂和中药配方颗粒质量检测上的空白，为鲜益母草现代制剂的鉴别提供有效的方法，也为其质量综合评价的研究提供科学的实验依据。本发明能够从内在质量上实现鲜益母草从药材到中药配方颗粒上的质量把控及专属性鉴别，既能够弥补原材料外观的缺陷而造成标准汤剂、中药配方颗粒鉴别困难的问题，也能从源头及终端产品上削减混伪品给中药市场带来的不良影响，确保鲜益母草药材、标准汤剂、配方颗粒的质量。本发明建立了一种简单、可靠、实用的鲜益母草药材、标准汤剂、配方颗粒的检测方法，所建立的超高效液相方法简单高效，结果客观，精密可靠。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
提供参照物溶液，所述参照物溶液包含新绿原酸对照品、绿原酸对照品、盐酸益母草碱对照品和芦丁对照品；
用提取溶剂对鲜益母草供试品进行提取，收集提取液，制备供试品溶液，其中：所述鲜益母草供试品为鲜益母草药材，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为回流提取，回流提取的时长为60min～120min，或所述鲜益母草供试品为鲜益母草标准汤剂，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz，或所述鲜益母草供试品为鲜益母草中药配方颗粒，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为50％～70％的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz；
采用超高效液相色谱法对所述参照物溶液和所述供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，将所述对照图谱和所述检测图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，制定特征图谱；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为磷酸质量百分比为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，
梯度洗脱程序为：0min～11min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至10％；11min～15min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至11％；15min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至12％；22min～28min，所述流动相A的体积百分比由12％上升至16％；28min～30min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至20％；30min～34min，所述流动相A的体积百分比由20％上升至22％；34min～40min，所述流动相A的体积百分比由22％上升至60％；40min～41min，所述流动相A的体积百分比由60％下降至3％；41min～50min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至97％，
流速为0.23mL/min～0.27mL/min；
所述特征图谱包含8个峰，峰1为新绿原酸的峰，峰3为绿原酸的峰，峰6为盐酸益母草碱的峰，峰8为芦丁的峰，
以峰3为参照峰，计算峰2与峰3的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，所述峰2对应的规定值为0.90，
以峰6为参照峰，计算峰4、峰5、峰7与峰6的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，所述的峰4、峰5和峰7对应的规定值分别为0.94、0.97和1.19。
2.根据权利要求1所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm～1.8μm。
3.根据权利要求1所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法的柱温为28℃～32℃。
4.根据权利要求1所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法的检测波长为270nm～280nm。
5.根据权利要求1至4任一项所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，其特征在于，每1mL所述参照物溶液包含12μg～18μg所述新绿原酸对照品、25μg～35μg所述绿原酸对照品、25μg～35μg所述盐酸益母草碱对照品和140μg～160μg所述芦丁对照品。
6.根据权利要求1至4任一项所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述参照物溶液中的溶解溶剂包含乙醇体积百分比为65％～75％的乙醇水溶液。
7.一种鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
用提取溶剂对待测样品进行提取，收集提取液，制备待测品溶液，其中，所述待测样品为鲜益母草药材，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为回流提取，回流提取的时长为60min～120min，或所述待测样品为鲜益母草标准汤剂，所述提取溶剂为乙醇体积百分比为50％～70％的乙醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz，或所述待测样品为鲜益母草中药配方颗粒，所述提取溶剂为甲醇体积百分比为50％～70％的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，超声提取的时长为30min～60min、功率为250W～300W、频率为35kHz～45kHz；
采用超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测所得检测图谱与权利要求1至6任一项构建方法构建的特征图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为磷酸质量百分比为0.08％～0.12％的磷酸水溶液，
梯度洗脱程序为：0min～11min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至10％；11min～15min，所述流动相A的体积百分比由10％上升至11％；15min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至12％；22min～28min，所述流动相A的体积百分比由12％上升至16％；28min～30min，所述流动相A的体积百分比由16％上升至20％；30min～34min，所述流动相A的体积百分比由20％上升至22％；34min～40min，所述流动相A的体积百分比由22％上升至60％；40min～41min，所述流动相A的体积百分比由60％下降至3％；41min～50min，所述流动相A的体积百分比由3％上升至97％，
流速为0.23mL/min～0.27mL/min。
8.根据权利要求7所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm～1.8μm。
9.根据权利要求7所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法的柱温为28℃～32℃。
10.根据权利要求7所述的鲜益母草药材及其标准汤剂和中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法的检测波长为270nm～280nm。
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