CN110554100B

CN110554100B - 一种杏贝止咳颗粒指纹图谱建立及其成分检测方法

Info

Publication number: CN110554100B
Application number: CN201810557332.8A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 张宁; 周宇; 高霞; 黄文哲; 王振中
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: CN110554100A

Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种杏贝止咳颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法包括：取杏贝止咳颗粒供试品和标准品进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇为流动相A、0.08％甲酸(含0.1％甲酸铵)为流动相B，梯度洗脱；根据HPLC检测结果，获得杏贝止咳颗粒成分及其含量。本发明检测方法测得的图谱能较全面的反映杏贝止咳颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测杏贝止咳颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。

Description

一种杏贝止咳颗粒指纹图谱建立及其成分检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种杏贝止咳颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法。

背景技术

随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。影响中药制剂质量的因素主要包括：(1)原药材的质量，中药材的质量好坏是直接影响中药制剂临床疗效的关键原因之一，由于目前中药材的来源较为复杂，且品种繁多，许多药材市场常常以次充好从中取得大量的经济利益。此外，现今我国药材市场对野生药材的供应相对缺乏再加上受到国家对野生自然资源采集的限制许多地方采取用种植的药材来代替这种家种的药材会严重影响药剂的质量，使药材的质量下降，特别是过量使用化肥，大幅度提升家中药材的产量，从而导致这与野生药材的气味发生了改变，从而影响了中药的疗效。(2)生产过程，在中药制剂的每一个环节中从投料到制剂的制备都需要投料人员认真仔细的按照工艺中的处方核查所投的药味及数量，如果少投或者多投都会影响到产品的整体质量。此外，还要注意中药制剂的粉碎、浓缩、干燥、精制和提取等方面的工序，这对中药成品的成分含量具有较大的影响作用。因此，在工艺设计时应根据药材的性质进行综合性的思考，选择最优的制备条件和最佳工艺，并做好工序中的质量监督工作，从而保障中药制剂的质量。(3)工艺用水、洁净区环境、工艺卫生，在制剂时，工艺用水也是重要的一个步骤，如果工艺卫生和洁净区环境存在不合格的情况，那将会直接引发微生物的滋生和污染，从而导致生产的制剂出现不合格的产品。(4)包装材料及现代包装技术，现今制剂的包装材料也是影响制剂质量的关键，例如塑料具有透气性和吸附性，它既能保证液体药物的溶媒挥发，也会使其含挥发成分的药物性能改变，加速药物的分解，使用劣质的保障袋，也会使有害的物质渗入制剂当中，此外，由于中药制剂具有剂型多、品种繁杂和生产量小等特点，因此，就会出现因包装袋质量差而导致液体剂外漏、液体发生霉变、药液与包装之间发生反应、固体制剂因为受潮变质等问题的出现，这严重影响制剂的质量。

中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

杏贝止咳颗粒由麻黄、苦杏仁、前胡、浙贝母、百部、桔梗、北沙参、木蝴蝶和甘草九味中药组成，具有清宣肺气、止咳化痰之功效。为了更好地对药品质量进行控制，保证其临床疗效，需建立全面评价该制剂质量的方法。杏贝止咳颗粒为复方制剂，化学成分复杂，有效成分包括生物碱类、黄酮类、香豆素类及皂苷类等。中药化学成分解析是中药药效物质阐明及质量控制的关键问题之一，目前针对杏贝止咳颗粒全面的化学成分解析还未见报道。

发明内容

本发明提供一种杏贝止咳颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映杏贝止咳颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测九味熄风颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种杏贝止咳颗粒指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取杏贝止咳颗粒，研细，用甲醇配制25mg/ml的供试品；取杏贝止咳颗粒供试品和对照品进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇为流动相A、含有缓冲溶液的水相为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，流动相为3％～30％A；20～45min，流动相为30％～55％A；45～75min，流动相为55％～100％A；75～85min，流动相为100％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；根据HPLC检测结果，获得杏贝止咳颗粒成分信息，或成分及其含量信息。

在本发明一个优选的实施方案中，所述HPLC检测的流速为1.0mL/min，柱温为30℃。

在本发明一个优选的实施方案中，所述HPLC的检测波长为210nm。

在本发明一个优选的实施方案中，所述缓冲溶液选自弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种；优选三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、邻苯二甲酸和盐酸；更优选0.08％甲酸和0.1％甲酸铵。

在本发明一个优选的实施方案中，所述C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱、Thermo syncronis C₁₈色谱柱、Agilent 5TC-C₁₈色谱柱、Kromasil100-5C₁₈色谱柱、Waters symmetry C₁₈色谱柱或Phenomenex Luna C₁₈色谱柱。

在本发明一个优选的实施方案中，所述对照品为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、黄芩苷、木蝴蝶苷B、黄芩素、甘草苷、甘草酸铵、白花前胡甲素、白花前胡乙素、桔梗皂苷D、甘草次酸、贝母素甲、贝母素乙、东莨菪内酯、绿原酸、芒柄花素、木蝴蝶苷A、对叶百部碱、新斯替宁碱、白花前胡丙素、刺芒柄花苷、异甘草素标准品中的一种或多种。利用上述检测条件建立一种或多种对照品的标准曲线，根据供试品检测结果计算有效成分的含量。

在本发明一个优选的实施方案中，其特征在于，建立杏贝止咳颗粒图谱后，按相同的方法测定待测杏贝止咳颗粒样品的图谱，然后将其与上述杏贝止咳颗粒的图谱比较，相似度不低于0.90。

本发明还提供一种杏贝止咳颗粒指纹图谱构建方法，其特征在于，

供试品溶液的制备：取杏贝止咳颗粒，研细，用甲醇配制25mg/ml的供试品；

对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、黄芩苷、木蝴蝶苷B、黄芩素、甘草苷、甘草酸铵、白花前胡甲素、白花前胡乙素、桔梗皂苷D、甘草次酸、贝母素甲、贝母素乙、东莨菪内酯、绿原酸、芒柄花素、木蝴蝶苷A、对叶百部碱、新斯替宁碱、白花前胡丙素、刺芒柄花苷和异甘草素，加甲醇制成含各成分浓度为15～30μg·mL^-1的混合对照品溶液。

HPLC检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇为流动相，梯度洗脱程序为：0～20min，流动相为3％～30％A；20～45min，流动相为30％～55％A；45～75min，流动相为55％～100％A；75～85min，流动相为100％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；

根据HPLC检测结果，获得杏贝止咳颗粒指纹图谱。

在本发明一个优选的实施方案中，所述流缓冲溶液选自弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种；优选三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、邻苯二甲酸和盐酸；更优选0.08％甲酸和0.1％甲酸铵。

本发明的有益效果：

本发明检测方法测得的图谱能较全面的反映杏贝止咳颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测杏贝止咳颗粒的成分含量，获得的指纹图谱能够客观评估样品的质量。本发明共鉴定和推测出87个化合物，包括生物碱类、黄酮类、香豆素类及皂苷类等，其中23个化合物经对照品验证。该结果为阐明杏贝止咳颗粒的药效物质基础奠定了基础，并为质量控制提供参考。

附图说明

图1是杏贝止咳颗粒样品的TIC图。

具体实施方式

本发明公开了一种杏贝止咳颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

如没有特别指明，本发明提供的杏贝止咳颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法中所用药品、试剂、仪器均可由市场购得：

1仪器与试药

Agilent 1290infinity超高效液相色谱仪，美国Agilent公司；

Agilent 6538Q-TOF质谱仪，美国Agilent公司；

Mettler Toledo ME303E型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；

Mettler Toledo XS205型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；

Pacific TⅡ7超纯水仪，美国赛默飞公司；

KH-250B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；

ST16R型高速冷冻离心机，美国赛默飞公司。

对照品盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、黄芩苷、木蝴蝶苷B、黄芩素、甘草苷、甘草酸铵、白花前胡甲素、白花前胡乙素、桔梗皂苷D、甘草次酸、贝母素甲、贝母素乙、东莨菪内酯、绿原酸、芒柄花素均购自中国食品药品检定研究院；木蝴蝶苷A、对叶百部碱、刺芒柄花苷均购自上海源叶生物科技有限公司；新斯替宁碱购自云南西力生物技术有限公司；白花前胡丙素购自上海诗丹德生物技术有限公司；异甘草素成都曼思特生物科技有限公司。

甲醇、甲酸铵、甲酸均为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

药品来源：本发明所用杏贝止咳颗粒由江苏康缘药业股份有限公司生产。

2方法与结果

2.1检测条件

(1)色谱条件色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为甲醇(A)-0.08％甲酸(含0.1％甲酸铵)(B)，梯度洗脱(0～20min，3％～30％A；20～45min，30％～55％A；45～75min，55％～100％A；75～85min，100％A)，柱温30℃，流速1mL·min^-1，检测波长210nm，进样量10～15μL。

(2)质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式，毛细管电压分别为4000、3500V；扫描范围m/z 100～3000；干燥气体积流量8L·min^-1；干燥气温度350℃；雾化气压力40psi；裂解电压100V；锥孔电压65V；碰撞能量分别采用10、20、30、40、50eV。

2.2对照品溶液配制

分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、黄芩苷、木蝴蝶苷B、黄芩素、甘草苷、甘草酸铵、白花前胡甲素、白花前胡乙素、桔梗皂苷D、甘草次酸、贝母素甲、贝母素乙、东莨菪内酯、绿原酸、芒柄花素、木蝴蝶苷A、对叶百部碱、新斯替宁碱、白花前胡丙素、刺芒柄花苷、异甘草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含各成分15～30μg·mL^-1的对照品溶液。

2.3供试品溶液制备

取本品四袋，研细，取约250mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入适量50％甲醇，超声10min，放冷，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，14000r·min^-1离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液即得。

2.3化合物的鉴定与解析

采用UPLC-Q-TQF-MS，按“2.1”项下条件检测供试品溶液和对照品溶液，并对杏贝止咳颗粒中化学成分进行分析，得到的正负离子模式的总离子流图(TIC)，具体参见说明书附图1(A为负离子模式；B为正离子模式)。

收集麻黄、苦杏仁、前胡、浙贝母、百部、桔梗、北沙参、木蝴蝶和甘草九味药材的化学成分信息，建立化合物数据库，包括名称、分子式、精确相对分子质量、所属类型等。通过对杏贝止咳颗粒样品进行一级质谱分析，利用MassHunter软件生成化合物分子式，选择误差在5ppm以内的分子式进行数据库自动匹配，快速指认可能的化合物；进而选择目标化合物进行二级质谱扫描，得到化合物的碎片离子信息，结合对照品裂解规律以及文献资料对目标化合物进行鉴定和推测。共鉴定和推测出87个化合物，其中23个化合物经对照品比对得到鉴定，见表1。

表1杏贝止咳颗粒化合物的UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定

注:*通过对照品比对确认的成分；rha，glu，xyl，Api分别表示鼠李糖，葡萄糖，木糖，芹糖；gluA表示葡萄糖醛酸。

按以上条件测定杏贝止咳颗粒的图谱后，按相同的方法测定待测杏贝颗粒样品的图谱，然后将其与上述杏贝颗粒的图谱经国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算比较，相似度不低于0.90。根据不同对照品，按本发明的方法建立的条件检测，获得相应曲线，建立了相应的含量检测方法。

2.4实验结果

本发明首次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对杏贝止咳颗粒化学成分进行了研究，共鉴定和推测出杏贝止咳颗粒中化学成分87个，其中黄酮类20个，香豆素类20个，生物碱类35个以及三萜皂苷类7个，同时采用对照品确定了其中23个成分。

同一对照品溶液以及样品溶液按本发明的检测条件连续进样，计算相对保留时间及相对峰面积，RSD＜0.5％，指纹图谱相似度大于0.9，表明本方法精密度良好，分别于0h、2h、6h、10h、14h、18h和24h按本发明条件检测，对照品溶液以及样品溶液室温24小时内稳定性良好，同样方法制备不同批次溶液，检测结果表明该方法重复性良好，具有良好的回收率。

本发明运用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，对杏贝止咳颗粒的化学成分进行了全面系统地解析，并研究总结了黄酮类、香豆素类、生物碱类和皂苷类化合物在质谱中的裂解规律，为杏贝止咳颗粒的质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。

Claims

1.一种杏贝止咳颗粒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取杏贝止咳颗粒，研细，用甲醇配制25 mg/ml的供试品；取杏贝止咳颗粒供试品和对照品进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇为流动相A、含有缓冲溶液的水相为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20 min，3%~30%流动相A；20~45 min，30%~55%流动相A；45~75 min，55%~100%流动相A；75~85 min，100%流动相A；流速为0.8～1.2 mL/min；柱温为25～40℃；缓冲溶液为0.08%甲酸和0.1%甲酸铵；检测波长为210nm；其中所述对照品为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、黄芩苷、木蝴蝶苷B、黄芩素、甘草苷、甘草酸铵、白花前胡甲素、白花前胡乙素、桔梗皂苷D、甘草次酸、贝母素甲、贝母素乙、东莨菪内酯、绿原酸、芒柄花素、木蝴蝶苷A、对叶百部碱、新斯替宁碱、白花前胡丙素、刺芒柄花苷和异甘草素标准品；

根据HPLC检测结果，获得杏贝止咳颗粒的成分信息，或成分及其含量信息。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC检测的流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱、Thermo syncronis C₁₈色谱柱、Agilent 5TC-C₁₈色谱柱、Kromasil 100-5C₁₈色谱柱、Waters symmetry C₁₈色谱柱或Phenomenex Luna C₁₈色谱柱。

4.一种杏贝止咳颗粒指纹图谱构建方法，其特征在于，

供试品溶液的制备：取杏贝止咳颗粒，研细，用甲醇配制25 mg/ml的供试品；

对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、黄芩苷、木蝴蝶苷B、黄芩素、甘草苷、甘草酸铵、白花前胡甲素、白花前胡乙素、桔梗皂苷D、甘草次酸、贝母素甲、贝母素乙、东莨菪内酯、绿原酸、芒柄花素、木蝴蝶苷A、对叶百部碱、新斯替宁碱、白花前胡丙素、刺芒柄花苷和异甘草素，加甲醇制成含各成分浓度为15~30 µg·mL^-1的混合对照品溶液；

HPLC检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇为流动相A，含有缓冲溶液的水相为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20 min，3%~30%流动相A；20~45 min，30%~55%流动相A；45~75min，55%~100%流动相A；75~85 min，100%流动相A；流速为0.8～1.2 mL/min；柱温为25～40℃；缓冲溶液为0.08%甲酸和0.1%甲酸铵；检测波长为210 nm；根据HPLC检测结果，获得杏贝止咳颗粒指纹图谱。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述HPLC检测的流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱、Thermo syncronis C₁₈色谱柱、Agilent 5TC-C₁₈色谱柱、Kromasil 100-5C₁₈色谱柱、Waters symmetry C₁₈色谱柱或Phenomenex Luna C₁₈色谱柱。