CN113341031A - 鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法，采用超高效液相色谱分析法同时建立红景天正品、习用品及代用品鉴别的特征图谱；利用化学计量学Chem Pattern分析软件，形成红景天不同品种的共有模式图、多元统计分析中的聚类分析法区分不同品种粉末。本方法抛去传统的粉末鉴定、薄层色谱鉴定的方法来鉴定同属药用植物带来的难以区分化学成分和特征物质的难题，采用红景天的真品、伪品和代用品，通过不同品种特征图谱建立和聚类分析方法可以鉴别它们粉末或无法辨认的原药材。本方法专属性强、准确性高；为红景天药材及其饮片或中成药投料的鉴定、质量评价提供了参考。
Description
技术领域
本发明涉及中药材鉴别技术领域，具体的说是一种利用超高效液相色谱分析法和化学计量学Chem Pattern软件分析，通过聚类分析法，鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法。
背景技术
随着每年高原旅游热的不断升温，红景天作为抗缺氧、抗疲劳、抗衰老等多种保健功能更加被重视。由于红景天生长环境特殊，生长周期长，生态环境脆弱。与此同时，随着中藏药产业的蓬勃发展，无节制地过度采挖和超强度利用，己经使现有红景天野生资源的储量和再生能力明显下降。“中国红景天属植物文献计量研究”文中也指出：2010年版《中国药典》收载的品种是大花红景天，其替代品种的开发研究迫在眉睫。
由于藏药中红景天基源较为混乱，在2015年版《中华人民共和国药典》收载品种为大花红景天R.crenulata(HK. f. et Thoms.) H. Ohba；而在《部颁标准·藏药分册》和地方藏药标准（青海、甘肃、四川、西藏等）的当地使用红景天主要分两类：一类是根粗的，以藏译名“噶都尔曼巴”即狭叶红景天Rhodiola kirilowii(Regel) Maxim.为代表；另一类是根茎粗长，根圆柱状的，以藏译名“索罗玛保”即大花红景天R.crenulata(HK. f. et Thoms.)H. Ohba和唐古红景天R. algida (Ledeb.) Fisch. et Mey. var. tangutica (Maxim.)S. H. Fu为代表。红景天药材市场主流品种以大花红景天和代用品小花红景天为主，由于小花红景天根茎神似大花红景天，误导很多药厂投料和消费者的购买，经考证发现小花红景天其基源掺杂着四裂红景天组下的长鞭红景天R. fastigiata (Hk. f. et Thoms.) S.H. Fu、四裂红景天R. quadrifida (Pall.) Fisch. et Mey.、小丛红景天R. dumulosa(Franch.) S. H. Fu，目前市场上小花红景天商品主要以长鞭红景天为主。这些正品、习用品和代用品都受产地、气候、生态环境等因素影响，其化合物组成、主要药效成分差异都无法做到控制，更达不到药材的稳定质量和疗效。但是上述药材加工成粉末后，依靠肉眼不易进行准确的鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法，通过同时建立红景天正品、习用品及代用品鉴别的特征图谱，采用ChemPattern化学计量学分析软件、化学特征图谱系统及聚类分析法区分正品大花红景天药材正品、伪品及代用品。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法，包括如下步骤：
步骤一、供试品溶液的制备：取待测试品粉末约1g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加体积百分比浓度为50%甲醇100mL，放入功率250W，频率40kHz的超声清洗器内25℃超声处理1h后，室温静置冷却，过滤，将滤液先过孔径为0.45μm的微孔滤膜，再过孔径为0.25μm的微孔滤膜得到续滤液，取续滤液作为供试品溶液；
步骤二、对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品3.55mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使没食子酸对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成没食子酸对照品溶液；精密称取干燥至恒重的红景天苷对照品2.05mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使红景天苷对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成红景天苷对照品溶液；
步骤三、超高效液相色谱检测：分别精密吸取步骤二制备的没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液与及步骤一制备的供试品溶液各5μL注入液相色谱仪，记录没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液和供试品溶液的50min内全色谱图；
步骤四、红景天正品特征图谱数据库的建立：将多批次红景天正品分别按照步骤二、步骤三所述的方法制备50min内全色谱图，并将色谱图采用Chem Pattern化学计量学软件进行数据分析处理，形成红景天正品的共有模式特征图谱数据库；
步骤五、不同品系红景天试品特征图谱数据库的建立：将采购于不同产地、市场的多个不同品种不同批次红景天药材分别按照步骤一、步骤三所述的方法制备红景天试品50min内全色谱图，并将色谱图釆用Chem Pattern化学计量学软件进行数据分析处理，形成红景天不同品种的共有模式特征图谱数据库；
步骤六、红景天试品的鉴别：将待鉴别药材按照步骤一、步骤三和步骤五所述的方法，生成待鉴别药材的特征图谱导入步骤五形成红景天不同品种的共有模式特征图谱数据库中，系统采用多元统计分析中的聚类分析法，通过相似度分析得出红景天聚类分析图；观察不同品种归类结果即可鉴别出待鉴别药材的类别。
优选的，所述步骤三中超高效液相色谱的色谱条件为：
采用WATERS Acquity-uplc，色谱柱为PhenomenexkromasicC18柱(5μm，250mm ×460mm)；流动相A为0.1%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱程序：0-15min(96%A-4%B)，15-20min(90%A-10%B)，20-25min(85%A-15%B)，25-30min(80%A-20%B)，30-35min(78%A-22%B)，35-40min(85%A-15%B)，40-50min(96%A-4%B)；柱温30℃；体积流量0.4mL/min，检测波长275nm，进样量5μL；取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，生成供试品溶液的50min内全色谱图。
中药特征图谱指中药材经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱。目的在于反映中药多成分的作用特点，整体控制中药质量，确保其内在质量的均一性和稳定性。特征图谱的建立应满足整体性、专属性和重现性。整体性最大限度地表征药效相关成分或特征成分，专属性具有专属性或唯一性，重现性是根据重现性要求选用合适的分析方法。中药特征图谱的作用有：中药质量标准的组成部分；药材栽培、加工技术建立的质量评价；企业产品质量的内控标准；企业药品生产的过程控制；企业产品创优或打假。特征图谱方法的建立包括样品的收集、供试品的制备、参照物的选择、色谱条件的优化、检测方法的选择、波长的选择和流动性的选择。
Chem Pattern化学计量学软件是一款免费公开使用的化学计量学软件，主要用于化学特征图谱分析、代谢组学分析、快速无损分析、肽图分析、非目标分析等，实现了仪器分析和化学计量学解析两项技术的融合，广泛应用在临床医学、食品安全、石油化工、环境监测等领域。软件的整体构架包括一站式的跨多种仪器方法的分析化学信号共平台处理系统和与之紧密相关的通用化学计量学数据分析系统等在内的多个分析化学核心功能子系统。软件通过通用数据接口技术提供各类常用色谱法、质谱法和光谱法所获得的高维高辨海量数据的高通量前处理以及多组分同步含量测定功能，并在高性能并行数值计算和大规模数据可视化功能基础上，全面提供对包括多元校正、模式识别、回归建模、多元统计分析、数据挖掘、人工智能等在内的丰富的化学计量学与化学特征图谱分析应用支持。
ChemPattern化学计量学分析软件与化学特征图谱系统解决方案首次实现了仪器分析与化学计量学解析两大分析化学应用系统的紧密衔接与构架融合。Chem Pattern化学计量学软件中的聚类分析支持单向凝聚方式的系统聚类分析，及双向系统聚类分析（聚类热图）。其中聚类热图可同时对样品及对自变量进行双向聚类并以热图显示。在化学计量学工具栏的多元统计面板，选择聚类分析或聚类热图，并设置相应参数，包括距离函数和连接方法等，即可获得对应的聚类结果。在聚类图或聚类热图的任意树节点（水平分支的中点）上单击鼠标右键，该节点将以高亮显示。此时选择交换左右树，可对指定节点的左右两侧树进行翻转对调。聚类热图的聚类树显示大小，以及样本及变量显示空间，均可通过视图工具栏中的X轴和Y轴间距调节面板进行调整。热图所使用的色彩图可在可视化选项中的色彩图（热图）中进行设定。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）本发明所述的方法抛去传统的粉末鉴定、薄层色谱鉴定的方法来鉴定同属药用植物带来的难以区分化学成分和特征物质的难题；将红景天的真伪品和代用品通过不同品种特征图谱建立和聚类分析方法可以鉴别它们粉末或无法辨认的原药材；本方法专属性强、准确性高；为红景天药材及其饮片或中成药投料的鉴定、质量评价提供了参考；
（2）本发明所述的方法建立起正品红景天的特征图谱，正品平均相似度大于0.9，标定了12个特征峰，由于试品属于全野生资源，差异性很大，所以将相似度设定为正品平均相似度；为红景天药材的质量全面、有效的控制提供了理论和实践基础；本发明建立的超高效液相色谱特征图谱方法专属性强、准确性高、重现性好，同时此方法可快速、准确的鉴别红景天药材的真伪优劣。
附图说明
图1是对照品混合溶液的超高效液相色谱图；
图2是7批红景天正品超高效液相色谱图；
图3是红景天正品的共有模式特征图谱；
图4是红景天代用品（狭叶红景天、唐古红景天）、伪品（小花红景天）超高效液相色谱特征图；
图5是红景天正品、习用品及代用品相似度分析图；
图6是红景天药材聚类分析图。
具体实施方式
以下结合附图实例，对本发明作进一步详细的说明。
本实验收集不同产地、不同品种正品（大花红景天）、习用品（唐古红景天、狭叶红景天）、伪品（小花红景天）共29批，主要考察了红景天中两个含量较高的有效成分红景天苷和没食子酸作为主要评判标准，有必要建立起包含不同品种红景天药材的特征图谱，釆用Chem Pattern软件，通过聚类分析的方法建立起一个区分正品大花红景天、代用品唐古红景天和狭叶红景天和伪品小花红景天方法，为红景天的品种鉴别和质量评价提供了科学的依据。
以下实施例为对29批来自不同产区的自采药材和市售药材饮片的特征图谱的建立方法和化学计量学软件Chem Pattern分析方法得到的结果应用：
仪器、试剂与材料
仪器设备：美国WATERS（Acquity-uplc）超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；ACE Excei 2 C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2um）；梅特勒 AE200 电子天平；梅特勒XS105DU分析天平；科桥超声清洗器。
试剂：乙腈（色谱纯，Merck公司）；50%甲醇（自配）；磷酸（分析纯）；超纯水(Millipore公司)。没食子酸（批号 110831-201805）；红景天苷（批号 110818-201804）购自中国食品药品检定研究院。
药材：大花红景天、狭叶红景天、唐古红景天、长鞭红景天的药材经青海省中医院中药基础研究所赵国福主任鉴定其基源准确。具体试品信息见表1。
表1
实验方法
供试品溶液的制备条件的选择
提取溶液的选择
根据实验，分别选用蒸馏水、乙醇、甲醇作为溶剂提取红景天中的化合物，红景天自然生在中体内存在大量的多糖物质，用蒸馏水和乙醇提结果比较粘稠，不宜过分子膜，且进样后各个峰之间分离度不好，杂峰较多。最终选择甲醇作为红景天药材制备的溶液。在此基础上对同一条件下体积百分比浓度分别为30%、50%、70%、100%的甲醇作为考察对象溶液，结果发现体积百分比浓度为50%甲醇溶液下出峰较多，且峰形较好；最终确定以体积百分比浓度50%甲醇为溶剂制备红景天药材试品溶液。
制备方法与优化：
超声提取法和加热回流法的提取工艺中，加热回流法提取费时费力，提取的有效成分含量比超声提取法低；超声条件为室温25℃，超声1小时效果较好。
色谱条件的筛选与优化
根据实验得知，不同的流动相系统如药典甲醇-水、乙腈-水，发现乙腈-水系统梯度调整效果好；同时红景天的主要有效成分红景天苷和主要成分没食子酸均为酚类化合物，显酸性，故在流动相中加入一定量的酸以抑制酚轻基离子化，结果表明分离效果明显提高。在酸的种类的选择上，比较了甲酸、磷酸和冰醋酸溶液，分离效果甲酸>磷酸>冰醋酸；但是甲酸作为有机酸，酸性明显强于磷酸，使用时间长容易腐蚀色谱柱，故选择流动相A为0.1%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液。同时也考察了在超纯水中加入体积百分比浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%的磷酸、柱温分别为30、35、40℃以及流速分别为0.3、0.4、0.5ml/min，最终结果表明，流动相A为0.1%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液、流速为0.4mL/min，柱温30℃时对红景天药材经行梯度洗脱，基线平稳、各化合物之间分离度高且峰形较好，整个方法简单，便于操作和控制成本。
通过二级管阵列检测器考察所需物质紫外吸收，没食子酸最大吸收波长在270nm，红景天苷最大吸收波长在275nm，综合考虑选择275nm为检测波长。
方法学考察
特征图谱的精密度试验：
精密称取同一供试品（例如试品5）1g，按步骤一所述的方法制备供试品溶液，按上述的色谱条件连续进样6次，进样量为5μL，以红景天苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及峰面积的RSD值，结果各特征峰的相对保留时间＜1%，单峰面积占总峰面积＞2%的特征峰的相对峰面积＜2%，采用Chem Pattern化学计量学软件进行相似度分析评价，相似度为0.99，结果表明仪器精密度良好。
特征图谱的稳定性实验：
精密称取同一供试品（例如试品5）1g，按步骤一所述的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样5μL，以红景天苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及峰面积的RSD值，结果各特征峰的相对保留时间＜1%，单峰面积占总峰面积＞2%的特征峰的相对峰面积＜2%，采用Chem Pattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99，表明供试品溶液24h内稳定。
特征图谱的重复性实验：
取同一批供试品（例如试品5）1g，按步骤一所述的方法制备供试品溶液各6批供试品溶液，按超高效液相色谱的色谱条件，分别进样测定，记录色谱图；以红景天苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及峰面积的RSD值，结果各特征峰的相对保留时间＜1%，单峰面积占总峰面积＞2%的特征峰的相对峰面积＜4%，采用Chem Pattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99，表明该方法重复性较好。
综上所述，以下实施例是按照如下方法建立不同品种的红景天特征图谱及ChemPattern软件的分析应用：
实施例1
一种鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法，包括如下步骤：
步骤一、供试品溶液的制备：分别取试品1至试品7粉末各1g，精密称定，分别置100mL锥形瓶中，加体积百分比浓度为50%甲醇100mL，放入功率250W，频率40kHz的超声清洗器内25℃超声处理1h后，室温静置冷却，过滤，将滤液先过孔径为0.45μm的微孔滤膜，再过孔径为0.25μm的微孔滤膜得到续滤液，取续滤液作为供试品溶液；
步骤二、对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品3.55mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使没食子酸对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成没食子酸对照品溶液；精密称取干燥至恒重的红景天苷对照品2.05mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使红景天苷对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成红景天苷对照品溶液；对照品溶液的色谱图如图1所示；
步骤三、超高效液相色谱检测：分别精密吸取步骤二制备的没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液与及步骤一制备的供试品溶液各5μL注入液相色谱仪，记录没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液和供试品溶液的50min内全色谱图；
步骤四、红景天正品特征图谱数据库的建立：将试品1至试品7的红景天正品的50min内全色谱图分别采用Chem Pattern化学计量学软件进行数据分析处理，积分相应的色谱峰，按试品对峰面积进行标准化处理，自动校正色谱峰保留时间漂移，实现试品间色谱峰对齐，生成试品1至试品7的7批红景天正品超高效液相色谱图，如图2所示；设定试品1为代表性试品，共有峰筛选选择30%，滤掉不希望出现较弱的共有峰，将其他试品的色谱峰与代表性试品的色谱峰进行自动匹配，生成红景天正品如图3所示的共有模式特征图谱，由计算并导出试品1至试品7中特征峰的相似度分别为0.74、0.91、0.96、0.98、0.90、0.83、0.98，各批次的红景天正品之间平均相似度均大于0.9，说明正品红景天特征图谱相似度良好；
步骤五、不同品系红景天试品特征图谱数据库的建立：将采购于不同产地/市场的多个不同品种不同批次红景天药材分别按照步骤一、步骤三所述的方法制备红景天试品50min内全色谱图，并将色谱图釆用Chem Pattern化学计量学软件进行数据分析处理，形成红景天不同品种的共有模式特征图谱数据库；
步骤六、红景天试品的鉴别：将待鉴别药材按照步骤一、步骤三和步骤五所述的方法，生成待鉴别药材的特征图谱，将待鉴别药品的特征图谱导入步骤五形成红景天不同品种的共有模式特征图谱数据库中，系统采用多元统计分析中的聚类分析法，通过相似度分析得出红景天聚类分析图；观察不同品种归类结果即可鉴别出待鉴别药材的类别。
步骤三中超高效液相色谱的色谱条件为：
采用WATERS Acquity-uplc，色谱柱为PhenomenexkromasicC18柱(5μm，250mm ×460mm)；流动相A为0.1%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱程序：0-15min(96%A-4%B)，15-20min(90%A-10%B)，20-25min(85%A-15%B)，25-30min(80%A-20%B)，30-35min(78%A-22%B)，35-40min(85%A-15%B)，40-50min(96%A-4%B)；柱温30℃；体积流量0.4mL/min，检测波长275nm，进样量5μL；取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，生成供试品溶液的50min内全色谱图。
建立红景天正品的特征图谱
（1）供试品溶液的制备：取不同批次红景天正品（试品1-7）粉末1g，精密称定，置100m L锥形瓶中，加体积百分比浓度为50%甲醇100 m L，放入功率250W，频率40kHz的超声清洗器内25℃超声处理1h后，室温静置冷却，过滤，将滤液先过0.45μm的微孔滤膜，再过孔径为0.25μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
（2）对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品3.55mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使没食子酸对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成没食子酸对照品溶液；精密称取干燥至恒重的红景天苷对照品2.05mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使红景天苷对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成红景天苷对照品溶液；用时各精密量取1ml混合即得对照品溶液。如图1。
（3）进样色谱条件：色谱柱为PhenomenexkromasicC18柱(5μm，250mm × 460mm);流动相A为0.1%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱程序：0-15min(96%A-4%B)，15-20min(90%A-10%B)，20-25min(85%A-15%B)，25-30min(80%A-20%B)，30-35min(78%A-22%B)，35-40min(85%A-15%B)，40-50min(96%A-4%B)；柱温30℃；体积流量 0.4 m L/min，检测波长275 nm，进样量5μL。取不同批次的正品红景天供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，在此条件下各组分得到良好分离，记录50min的超高效液相色谱图。
（4）超高效液相色谱检测：分别精密吸取（2）中制备的没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液与及（1）中制备的供试品1-7批溶液各5μL注入液相色谱仪，记录没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液和供试品溶液的50min内全色谱图；
（5）采用Chem Pattern化学计量学软件分析：将7批红景天（试品1-7批）色谱仪采集的数据以CDF格式导出，再导入Chempattern化学计量学软件，积分相应的色谱峰，按试品对峰面积进行标准化处理，自动校正色谱峰保留时间漂移，实现试品间色谱峰对齐，生成7批红景天正品超高效液相色谱图，如图2。设定试品1为代表性试品，共有峰筛选选择30%，滤掉不希望出现较弱的共有峰。将其他试品的色谱峰与代表性试品的色谱峰进行自动匹配，生成红景天正品的共有模式特征图谱（如图3），由计算并导出试品1至试品7中特征峰的相似度，分别为0.74、0.91、0.96、0.98、0.90、0.83、0.98，各批次的红景天正品之间平均相似度大于0.9，说明正品红景天特征图谱相似度良好。
（6）红景天正品特征峰的标定：根据7批红景天正品的特征图谱检测结果，共标定12个特征峰，经过与对照品比对并结合光谱图PDA光谱，可知1号峰为没食子酸，3号峰为红景天苷。
红景天正品与习用品、代用品特征图谱比较
（1）供试品溶液的制备：取不同批次的红景天习用品、代用品（试品8-29批）粉末各1g，精密称定，置100m L锥形瓶中，加体积百分比浓度为50%甲醇100 m L，放入功率250W，频率40kHz的超声清洗器内25℃超声处理1h后，室温静置冷却，过滤，将滤液先过0.45μm的微孔滤膜，再过孔径为0.25μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
（2）进样色谱条件：色谱柱为PhenomenexkromasicC18柱(5μm，250mm × 460mm);流动相A为0.1%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱程序：0-15min(96%A-4%B)，15-20min(90%A-10%B)，20-25min(85%A-15%B)，25-30min(80%A-20%B)，30-35min(78%A-22%B)，35-40min(85%A-15%B)，40-50min(96%A-4%B)；柱温30℃；体积流量 0.4 m L/min，检测波长275 nm，进样量5μL。取不同批次的伪品、代用品的红景天供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，在此条件下各组分得到良好分离，记录50min的超高效液相色谱图。
（3）超高效液相色谱检测：精密吸取（1）中制备的供试品8-29批溶液各5μL注入液相色谱仪，记录没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液和供试品溶液的50min内全色谱图；
（4）采用Chem Pattern化学计量学软件分析：将红景天习用品、代用品（试品9-29批）色谱仪采集的数据以CDF 格式导出，再导入Chem pattern化学计量学软件，积分相应的色谱峰，按试品对峰面积进行标准化处理，自动校正色谱峰保留时间漂移，实现试品间色谱峰对齐，按试品对峰面积进行标准化处理，生成红景天习用品（狭叶红景天、唐古红景天）、代用品（小花红景天）超高效液相色谱图，如图4。系统计算这供试品1-29批红景天药材进行相似度分析，相似度分析的方法选择夹角余弦，结果见表2，红景天正品、习用品及代用品相似度分析图如图5所示。由于表2结果是以红景天正品的共有模式特征峰为基础模板进行统计分析的，所以供试品1-7批正品大花红景天的相似度最高，在0.87-0.97之间。狭叶红景天共有峰对比共有模式相似度在0.8左右，RSD值＜5，说明狭叶红景天主要以根入药，含量较于其他种稳定。唐古特红景天共有峰对比共有模式相似度在0.7左右，RSD值却高于5，分析原因在于唐古红景天一般生长在河边及山坡石缝中，河边的容易采集到它的根，而石缝中很难挖到根，一般以根茎入药较多，根与根茎的成分含量差异明显导致数据偏差，其化学成分含量差异明显受产地影响大。小花红景天共有峰对比共有模式相似度在0.77左右，RSD值＜5，说明小花红景天一般以粗壮的根茎入药，化学成分较稳定，受产地影响小。
表2 红景天药材相似度分析结果
化学计量学分析（聚类分析）：在化学计量学工具栏的多元统计面板中选取聚类分析方法，并设置相应参数，包括距离函数选取欧氏距离方法、连接函数选取误差平方和法，可获得相应方法的红景天聚类分析图6。由图6可以划分为四个聚类：试品1-8号相似度高，可以聚为一类，为青海和西藏产的大花红景天，同时8号红景天粉末也聚在了一起，可以证明为大花红景天。试品17-24可以聚为一类，同时试品17批红景天粉末也聚在了一起，为青海产的唐古红景天。试品9-16批可以聚为一类，为青海产的狭叶红景天，试品9批红景天粉证实为狭叶红景天。前三种可聚为一大类，剩余小花红景天（试品25-29批）可以单独聚为一类，同时25号红景天粉末也聚在了一起。说明了三者红景天成分含量的相似性，区别于小花红景天的成分含量。通过聚类分析的方法，待测红景天粉末的鉴别结果也与实际情况相符，建立模式方法可以用于红景天药材和粉末区分和鉴别。
Claims (2)
1.一种鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、供试品溶液的制备：取待测试品粉末约1g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加体积百分比浓度为50%甲醇100mL，放入功率250W，频率40kHz的超声清洗器内25℃超声处理1h后，室温静置冷却，过滤，将滤液先过孔径为0.45μm的微孔滤膜，再过孔径为0.25μm的微孔滤膜得到续滤液，取续滤液作为供试品溶液；
步骤二、对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品3.55mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使没食子酸对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成没食子酸对照品溶液；精密称取干燥至恒重的红景天苷对照品2.05mg置于25ml容量瓶中，加入甲醇使红景天苷对照品溶解后，继续添加甲醇至标准刻度线定容，摇匀，制备成红景天苷对照品溶液；
步骤三、超高效液相色谱检测：分别精密吸取步骤二制备的没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液与及步骤一制备的供试品溶液各5μL注入液相色谱仪，记录没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液和供试品溶液的50min内全色谱图；
步骤四、红景天正品特征图谱数据库的建立：将多批次红景天正品分别按照步骤二、步骤三所述的方法制备50min内全色谱图，并将色谱图采用Chem Pattern化学计量学软件进行数据分析处理，形成红景天正品的共有模式特征图谱数据库；
步骤五、不同品系红景天试品特征图谱数据库的建立：将采购于不同产地、市场的多个不同品种不同批次红景天药材分别按照步骤一、步骤三所述的方法制备红景天试品50min内全色谱图，并将色谱图釆用Chem Pattern化学计量学软件进行数据分析处理，形成红景天不同品种的共有模式特征图谱数据库；
步骤六、红景天试品的鉴别：将待鉴别药材按照步骤一、步骤三和步骤五所述的方法，生成待鉴别药材的特征图谱，将待鉴别药品的特征图谱导入步骤五形成的红景天不同品种的共有模式特征图谱数据库中，系统采用多元统计分析中的聚类分析法，通过相似度分析得出红景天聚类分析图；分析不同品种归类结果，即可鉴别出待鉴别药材的类别。
2.根据权利要求1所述的鉴别红景天药材正品、伪品及代用品的方法，其特征在于：所述步骤三中超高效液相色谱的色谱条件为：
采用WATERS Acquity-uplc，色谱柱为PhenomenexkromasicC18柱(5μm，250mm ×460mm)；流动相A为0.1%的磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度洗脱程序：
0-15min(96%A-4%B)，15-20min(90%A-10%B)，20-25min(85%A-15%B)，25-30min(80%A-20%B)，30-35min(78%A-22%B)，35-40min(85%A-15%B)，40-50min(96%A-4%B)；柱温30℃；体积流量0.4mL/min，检测波长275nm，进样量5μL；取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，生成供试品溶液的50min内全色谱图。
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| CN114062541A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-02-18 | 深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心） | 一种红景天真伪鉴别方法及其应用 |
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