CN107449849B - 一种中药鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种中药鉴别方法，包括以下步骤：获取N个中药标准品以及M个中药样品的色谱图，并确定各色谱图的鉴别目标峰,N≥1，M≥1；用热图绘制软件采集各色谱图中鉴别目标峰的图谱数据，所述图谱数据包括峰面积及保留时间；对所述图谱数据进行标准化处理及聚类分析，生成分析结果图，所述分析结果图中包括热图以及聚类谱图；根据所述分析结果图对中药样品进行鉴别；其中从所述热图中定性分析中药标准品与中药样品的鉴别目标峰对应的化学成分的区别；从所述聚类谱图中推断出中药样品的品种及加工工艺。本发明提供的中药鉴别方法能够同时反映出中药的品种、加工工艺等信息，以及中药的化学成分之间的区别。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量控制领域，特别是涉及一种中药鉴别方法。
背景技术
中药质量控制与评价是中药现代化研究的关键问题之一，是实现中药标准化的重要基础，然而中药本身化学成分复杂，同时基源品种、产地来源、生长环境、采收季节、加工炮制工艺等诸多因素进一步增加了中药质量控制与评价研究的难度。随着现代科学技术特别是仪器分析、计算机科学、化学计量等学科的迅速发展，中药质量控制与评价研究的新思路与新方法不断出现，有效地促进了中药标准化研究。目前中药质量控制与评价研究方法主要包括：单一或几个有效成分的测定、中药指纹图谱技术、一测多评法及其类似方法、有效成分与药效结合、指纹图谱与药效结合、多元统计分析等，然而绝大多数中药质量控制与评价仍局限于少数有效成分的研究上，缺乏整体性和系统性分析。
化学指纹图谱具有整体性、模糊性等特点，能全面反映中药中化学成分的种类与数量，在中药质量研究中具有广泛的应用，其中相似度计算是反映指纹图谱的重要手段，然而化学指纹图谱数据量巨大，如何实现指纹图谱知识化，即如何从大量指纹图谱数据中得到有关的规律和知识，反映质量控制中关键问题，是化学指纹图谱在中药质量控制与评价研究中的关键问题。化学模式识别是化学计量学的重要组成部分，既可对多个指标进行统计分析，又可将整个图谱信息数量化，进而使其可以被计算机识别与处理，可对HPLC、MS、IR、NMR及HPLC-MS等多种现代仪器分析获取的数据进行客观分析，进而实现指纹图谱知识化，有效的将中药指纹图谱检测所获得的大量而庞杂的数据进行区分、整理，从而得到相关规律及关键性差异化学信息，为中药质量评价研究提供更全面且客观的评价技术。
目前化学指纹图谱与化学模式识别相结合的中药质量研究逐渐受到关注，然而多侧重于对单一影响因素进行研究，如产地、炮制或真伪等，缺乏多因素的综合质量评价研究。此外，直观可视化的热图分析在中药质量研究中应用极少，且侧重于反映中药中的几个或多个成分，缺乏整体性、模式识别性研究。
发明内容
为了能够同时反映出中药的品种、加工工艺等信息，以及中药的化学成分之间的区别，本发明提供了一种中药鉴别方法；具体技术方案如下：
本发明提供了一种中药鉴别方法，包括以下步骤：
获取N个中药标准品以及M个中药样品的色谱图，并确定各色谱图的鉴别目标峰,N≥1，M≥1；
用热图绘制软件采集各色谱图中鉴别目标峰的图谱数据，所述图谱数据包括峰面积及保留时间；
对所述图谱数据进行标准化处理及聚类分析，生成分析结果图，所述分析结果图中包括热图以及聚类谱图；
根据所述分析结果图对中药样品进行鉴别；其中从所述热图中定性分析中药标准品与中药样品的鉴别目标峰对应的化学成分的区别；从所述聚类谱图中推断出中药样品的品种及加工工艺。
在本发明中，所说的术语“中药”，也可以称其为中药材；所说的术语“中药标准品”，也可以称为中药材标准品，可以理解为品种及加工工艺已经确定的中药。例如当以何首乌炮制品作为中药标准品时，表示该中药标准品的品种为何首乌，且其通过炮制工艺加工。相应地，所说的术语“中药样品”也可以称其为中药材样品，可以理解为待检测的中药，该中药可能品种和/或加工工艺未知，或者该中药声称与中药材标准品具有相同的品种和/或加工工艺，但需要进一步检测确定。
本发明采用热图绘制软件来实现本发明的技术方案，热图绘制软件其本身是现有技术，能够根据输入的参数绘制出热图(heatmap)，并通过聚类分析获得聚类谱图。该软件本身具有标准化处理及聚类分析功能，因此，当进行标准化处理及聚类分析时，只要选择热图绘制软件自带的标准化处理及聚类分析模式，即可由软件自动实现相应的功能。
本发明中，中药标准品与中药样品的化学成分的区别，可以理解为中药标准品与中药样品的各鉴别目标峰所对应的化学成分，例如具体化合物的种类和/或含量的区别。可见，本发明的技术方案可以通过热图，实现直观可视化地分析中药材的化学组成，进一步地，为实现中药的质量控制提供依据。
在本发明中，所说的术语“品种”用于区别一种中药与另一种中药。例如何首乌为一个中药品种，甘草为另一个中药品种；需要说明的是，一个品种下的中药可以有不同的“加工工艺”。本发明中，所说的术语“加工工艺”可以理解为从自然中获取的原药材形成可以入药的形式的加工过程；例如生用或炮制等工艺。具体地，例如何首乌按加工工艺可以分为生首乌(何首乌生品)和制首乌(何首乌炮制品)；甘草按加工工艺可以分为生甘草(甘草生品)和炙甘草(甘草炮制品)。
在本发明的一种具体实施方式中，所述从聚类谱图中推断出中药样品的品种及加工工艺，包括：
当m个中药样品与N个中药标准品各聚为一类，且经过再一次的聚类彼此不会合并成一类的情况下，此m个中药样品为与中药标准品归属于不同种类的中药；
当m个中药样品与N个中药标准品各聚为一类，且经过再一次的聚类彼此合并成一类的情况下，此m个中药样品与中药标准品归属于同种类的中药，且加工工艺不同；其中，m≤M。
聚类谱图由于其形似树，所以一般也称其为聚类树状图或聚类树，在聚类的过程中，当中药样品与中药标准品在品种或加工工艺至少有一个不同时，由于m个中药样品之间更相似，同理N个中药标准品彼此更相似，因此中药样品与中药标准品先各自聚类，并实现m个中药样品与N个中药标准品各自聚为一类，此时，再进行一次聚类，如果中药样品与中药标准品彼此不会合并成一类，则说明中药样品为与中药标准品归属于不同种类的中药；如果中药样品与中药标准品彼此合并成一类，说明中药样品与中药标准品归属于同种类的中药，但加工工艺不同。
在本发明的一种具体实施方式中，所述色谱图为超高效液相色谱图。本领域技术人员可以理解，超高效液相色谱图可以通过超高效液相色谱来获得。
在本发明的一种具体实施方式中，所述鉴别目标峰为色谱图中分离度R大于1.5的色谱峰。
在本发明的一种具体实施方式中，所述热图绘制软件为Heml-HeatmapIllustrator软件，更具体地，所述热图绘制软件为Heml1.0.3-Heatmap Illustrator软件。
在本发明的一种具体实施方式中，标准化处理选自线性函数转换或对数函数转换。
在本发明的一种具体实施方式中，所述聚类分析选自层次聚类或K-均值聚类。
如前所述，无论是标准化处理的方式还是聚类分析的方式，均是由热图绘制软件自带的可选方式，当热图绘制软件例如通过升级设置有更多标准化处理的方式还是聚类分析的方式时，本领域技术人员也可以根据实际需要选择其它的处理方式来实现本发明的技术方案。
在本发明的一种具体实施方式中，所述中药为何首乌；所述中药标准品为何首乌生品或何首乌炮制品。
在本发明的一种具体实施方式中，所述色谱图为超高效液相色谱图，获得所述超高效液相色谱图的色谱条件包括：
色谱柱为十八烷基键合相硅胶；流动相：乙腈(A)–0.3％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序如下：0-5min，10-35％A；5-20min，35-90％A；柱温：45℃；流速：0.3mL/min；进样量：3μL；检测波长：260nm。
本发明提供的中药鉴别方法，在获得分析结果图后，可以根据所述分析结果图对中药样品进行鉴别；其中从热图中定性分析中药标准品与中药样品的鉴别目标峰对应的化学成分的区别；从聚类谱图中推断出中药样品的品种及加工工艺，基于此，本发明提供的中药鉴别方法能够同时反映出中药的品种、加工工艺等信息，以及中药的化学成分之间的区别。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1中的(a)图、(b)图、(c)图分别为生首乌、制首乌及白首乌的超高效液相色谱图，图中所标的数字表示所确定出的鉴别目标峰的标号。
图2为本发明实施例鉴别何首乌的分析结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以中药何首乌为例，采用本发明技术方案从炮制、真伪两个不同层面对中药何首乌进行鉴别，具体方案如下：
1仪器与试剂
1.1试药
乙腈、甲醇、甲酸均购自赛默飞世尔科技有限公司，其中乙腈、甲醇为色谱级，甲酸为质谱级，水为Milli-Q超纯水系统制备。
共收集生首乌9批，制首乌9批(将每批均按药典方法制备何首乌炮制品)，常见伪品(白首乌)9批；在此实施例中，以生首乌作为中药标准品，制首乌及白首乌均作为中药样品。
1.2仪器
Waters Acquity UPLC(美国Waters公司)，KH 2200B超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，BT125D十万分之一天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)。
1.3分析软件
Heml1.0.3-Heatmap Illustrator(下载地址：http://hemi.biocuckoo.org/ down.php)。
2供试品溶液的制备
将生首乌(何首乌生品)、制首乌(何首乌炮制品)与白首乌(何首乌常见伪品)药材粉碎，过4号药典筛，精密称取0.2g粉末，加入10mL甲醇，超声15min，0.22μm滤膜过滤，取续滤液进行UPLC(超高效液相色谱)分析。
3色谱条件
色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)；流动相：乙腈(A)–0.3％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序如下：0-5min(10-35％A)，5-20min(35-90％A)；柱温：45℃；流速：0.3mL/min；进样量：3μL；检测波长：260nm。在此色谱条件下，生首乌、制首乌、白首乌均具有良好的分离效果，色谱图如图1所示。
4何首乌的鉴别
采用图1中生首乌与制首乌中分离效果良好(分离度R均大于1.5)的16个共有化学成分峰作为鉴别目标峰(标号1-16)，及白首乌中的9个共有化学成分的鉴别目标峰标号1′-9′)，获取其峰面积、保留时间。
采用Heml1.0.3-Heatmap Illustrator软件进行分析，首先将获取的鉴别目标峰的图谱数据(峰面积、保留时间)导入，然后对获取的图谱数据采用“2为底的对数函数转换”的标准化方法进行标准化处理，以及采用“均连接层次聚类法”进行聚类分析；生成的分析结果图如图2所示，图2左侧为热图，图2右侧为聚类谱图；图2中“SH”代表生首乌，“SH”后的数字表示生首乌的样品序号；“PH”代表制首乌，“PH”后的数字表示制首乌的样品序号；“B”代表何首乌的常见伪品白首乌，“B”后的数字表示白首乌的样品序号；“com”代表各鉴别目标峰所对应的化学成分，“com”后的数字从1-16时，表示的为生首乌或制首乌的化学成分(依次对应图1中的峰序号1-16)，“com”后的数字从17-25时，表示的为白首乌的化学成分(依次对应图1中的峰序号1′-9′)。
从图2中的热图分析可直观看出生首乌与制首乌的化学成分含量存在一定的差异性，表明炮制前后何首乌的化学成分含量发生了一定的变化；而何首乌(包括生首乌与制首乌)与白首乌的化学成分种类存在明显不同，直观反映两者不可视为一物混用的化学原因。从图2中的聚类谱图可以看出，以生首乌作为中药标准品时，从9个中药样品白首乌与9个生首乌各聚为一类，且经过再一次的聚类彼此不会合并成一类，可见在此情况下，可以认定中药样品为与中药标准品归属于不同种类的中药；另外，9个中药样品制首乌与9个生首乌各聚为一类，且经过再一次的聚类彼此合并成一类，可见在此情况下，可以认定中药样品与中药标准品归属于同种类的中药，且加工工艺不同。也即何首乌生品聚为一小类，炮制品聚为一小类，且两小类聚为一大类；伪品单独聚为一大类，且与生品、炮制品间无交叉。基于此，本发明提供的技术实现了从炮制、真伪两个层面对何首乌实现鉴别，可实现伪品与正品何首乌(包括生品与炮制品)、生品与炮制品的区分。
以上对本发明所提供的中药鉴别方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
Claims (8)
1.一种中药鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取N个中药标准品以及M个中药样品的色谱图，并确定各色谱图的鉴别目标峰,N≥1，M≥1；
用热图绘制软件采集各色谱图中鉴别目标峰的图谱数据，所述图谱数据包括峰面积及保留时间；
对所述图谱数据进行标准化处理及聚类分析，生成分析结果图，所述分析结果图中包括热图以及聚类谱图；
根据所述分析结果图对中药样品进行鉴别；其中从所述热图中定性分析中药标准品与中药样品的鉴别目标峰对应的化学成分的区别；从所述聚类谱图中推断出中药样品的品种及加工工艺；
所述从聚类谱图中推断出中药样品的品种及加工工艺，包括：
当m个中药样品与N个中药标准品各聚为一类，且经过再一次的聚类彼此不会合并成一类的情况下，此m个中药样品为与中药标准品归属于不同种类的中药；
当m个中药样品与N个中药标准品各聚为一类，且经过再一次的聚类彼此合并成一类的情况下，此m个中药样品与中药标准品归属于同种类的中药，且加工工艺不同；其中，m≤M。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱图为超高效液相色谱图。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴别目标峰为色谱图中分离度R大于1.5的色谱峰。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热图绘制软件为Heml-HeatmapIllustrator软件。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，标准化处理选自线性函数转换或对数函数转换。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚类分析选自层次聚类或K-均值聚类。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中药为何首乌；所述中药标准品为何首乌生品或何首乌炮制品。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述色谱图为超高效液相色谱图，获得所述超高效液相色谱图的色谱条件包括：
色谱柱为十八烷基键合相硅胶；流动相：乙腈-0.3％甲酸水溶液，梯度洗脱程序如下：0-5min，10-35％乙腈；5-20min，35-90％乙腈；柱温：45℃；流速：0.3mL/min；进样量：3μL；检测波长：260nm。
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