CN113945674B - 一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法 - Google Patents

一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113945674B
CN113945674B CN202111559579.1A CN202111559579A CN113945674B CN 113945674 B CN113945674 B CN 113945674B CN 202111559579 A CN202111559579 A CN 202111559579A CN 113945674 B CN113945674 B CN 113945674B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phase
processed
rehmannia
uplc
internal standard
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111559579.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113945674A (zh
Inventor
吴毅
朱徐东
黄丽萍
刘绪平
严斐霞
付小梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangxi Institute For Drug Control
Original Assignee
Jiangxi Institute For Drug Control
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangxi Institute For Drug Control filed Critical Jiangxi Institute For Drug Control
Priority to CN202111559579.1A priority Critical patent/CN113945674B/zh
Publication of CN113945674A publication Critical patent/CN113945674A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113945674B publication Critical patent/CN113945674B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds

Abstract

本发明采用UPLC法和质谱法，以升麻素苷为内标构建了一种地黄炮制品的特征图谱，包括地黄苷A、梓醇、腺苷、地黄苷D、密力特苷、5‑羟甲基糠醛、京尼平苷酸、脱咖啡酰基毛蕊糖苷、8‑表番木鳖酸、红景天苷、肉苁蓉苷F、栀子苷、松果菊苷、乙酰梓醇、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、地黄苷C、焦地黄苯乙醇苷B1、连翘酯苷A、异类叶升麻苷、地黄苷、异地黄苷的UPLC‑Q/TOF‑MS数据。本发明还公开了一种地黄炮制品化学成分的分析方法，采用UPLC‑MS技术，以升麻素苷为内标，对地黄炮制品进行半定量分析，并将分析结果与本发明所述地黄炮制品特征图谱进行对比鉴定，实现对地黄炮制品的化学成分进行快速、全面的分析。

Description

一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法
技术领域
本发明属于中药质量分析技术领域，具体涉及基于UPLC-Q/TOF-MS技术的地黄炮制品的特征图谱以及地黄不同炮制品化学成分的分析方法。
背景技术
地黄始载于《神农本草经》，被列为上品，在我国有1000多年的药用历史，地黄为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）的新鲜或干燥块根，熟地黄为地黄的炮制品，汉代著名医家张仲景用地黄配伍其他药物，治疗肾阳不足，妇女干血劳及胎漏下血等。
地黄中含有环烯醚萜苷、糖、紫罗兰酮、黄酮、甾醇、氨基酸、挥发油等多种类型化合物，如梓醇、益母草苷、桃叶珊瑚苷及地黄苷A、B、C、D 和胡萝卜苷等成分。随着地黄炮制方法的不同，熟地黄中的药物成分和药性也各不相同。
地黄炮制中的化学成分变化研究主要包括：环稀醚萜苷类、苯乙醇苷类、糖类、氨基酸和5-羟甲基糠醛及其衍生物。孟祥龙等人发现炮制辅料黄酒对九蒸九晒制备得到的熟地黄的化学成分动态变化具有影响：随蒸晒次数的增加，清蒸法与酒蒸法制得熟地黄中梓醇及益母草苷、毛蕊花糖苷、水苏糖、蔗糖、棉子糖均减少；地黄苷A及地黄苷D略为增加；5-羟甲基糠醛、果糖、葡萄糖、甘露三糖均增加(孟祥龙,马俊楠,张朔生等.熟地黄炮制(九蒸九晒)过程中药效化学成分量变化及炮制辅料对其影响研究[J]. 中草药, 2016, 47(5):752-759.)。
因此需要建立一种能够涵盖各种地黄炮制品化学成分的特征图谱并针对特征图谱中的各种成分进行快速分析方法。
发明内容
本发明针对现有技术下不同方法炮制的熟地黄中药物成分存在不同的问题，采用UPLC法和质谱法，以升麻素苷为内标构建了一种地黄炮制品的特征图谱。可依据该特征图谱以及UPLC-Q/TOF-MS技术，以升麻素苷为内标，对地黄不同炮制品的化学成分进行半定量分析，实现快速、全面的分析和鉴定。
本发明具体技术方案如下：
一种地黄炮制品的特征图谱，包括地黄苷A、梓醇、腺苷、地黄苷D、密力特苷、5-羟甲基糠醛、京尼平苷酸、脱咖啡酰基毛蕊糖苷、8-表番木鳖酸、红景天苷、肉苁蓉苷F、栀子苷、松果菊苷、乙酰梓醇、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、地黄苷C、焦地黄苯乙醇苷B1、连翘酯苷A、异类叶升麻苷、地黄苷、异地黄苷的UPLC-Q/TOF-MS数据。所述特征图谱采用UPLC法和Q/TOF-MS质谱法，以升麻素苷为内标构建而成，UPLC法的检测条件为：C18色谱柱；流动相以乙腈为A相，以0.1%甲酸水溶液为B相，A、B相混合梯度洗脱，洗脱条件为：0～1min，5%A相；1～6min，5%～24%A相；6～10min，24%～35%A相。
本发明进一步公开了地黄炮制品化学成分的分析方法，采用UPLC-MS技术，以升麻素苷为内标，采用内标法对地黄炮制品进行半定量分析，并将分析结果与本发明所述地黄炮制品特征图谱进行对比鉴定，所述特征图谱包括：地黄苷A、梓醇、腺苷、地黄苷D、密力特苷、5-羟甲基糠醛、京尼平苷酸、脱咖啡酰基毛蕊糖苷、8-表番木鳖酸、红景天苷、肉苁蓉苷F、栀子苷、松果菊苷、乙酰梓醇、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、地黄苷C、焦地黄苯乙醇苷B1、连翘酯苷A、异类叶升麻苷、地黄苷、异地黄苷的UPLC-Q/TOF-MS数据。
本发明所述的分析方法具体包括如下步骤：
（1）样品处理：取地黄炮制品，使用醇提取，得到提取液，制备加入升麻素苷内标的地黄炮制品供试品溶液；
（2）采用UPLC法和质谱法对步骤（1）的供试品溶液进行半定量分析，UPLC检测条件：C18色谱柱（Waters ACQUITY BEH C18 (2.1×100mm，1.7μm)色谱柱）；流动相以乙腈为A相，以0.1%甲酸水溶液为B相，A、B相混合梯度洗脱，洗脱条件如下：
Figure 191840DEST_PATH_IMAGE001
柱温40℃；流速0.3mL·min-1；进样量：1μL；
（3）将步骤（2）的分析结果与本发明所述地黄炮制品特征图谱进行对比鉴定。
优选的，所述质谱法为Q/TOF-MS。质谱条件为：电喷雾离子源：分别采用正离子模式进行 MSE扫描；离子源电压为 4500 V；离子源温度为100℃；毛细管电压为3.0kV；锥孔电压为40V；低碰撞电压为6 V；高碰撞电压为40～60 V；以氮气为雾化气和锥孔气；锥孔气流量为50L·h-1；雾化气体积流量为800L·h-1；脱溶剂化温度为350℃；扫描范围m/z100～1200，扫描时间为0.3s；亮氨酸脑啡肽实时校准质量数。
UPLC-Q/TOF-MS技术具有高分辨率、高灵敏度的定性能力和强大结构表征能力，可以提供良好的分离效果，能快速、高效地分析复杂化合物。
本发明可联合质谱仪的UNIFI PORTAL软件，在利用UPLC-Q/TOF-MS对样品进行分离分析采集数据后，通过UNIFI PORTAL软件自动进行峰提取和确认等数据处理过程，与地黄炮制品特征图谱数据库中的化合物信息进行匹配，最终通过预设的方法给出所鉴定化合物的详细信息。
本发明优点：
1. 本发明根据地黄炮制品中不同化合物的特点，以升麻素苷为内标，进行方法学考察，在UPLC-Q/TOF-MS技术基础上构建了地黄炮制品中主要的22种化学成分的特征图谱，该图谱适用于不同地黄炮制品的成分分析。
2. 利用本发明构建的地黄炮制品特征图谱，以升麻素苷为内标，使用UPLC-Q/TOF-MS分析方法对地黄炮制品进行半定量分析，能够实现对地黄不同炮制品的化学成分进行快速、全面的分析。
3. 本发明所述方法能够有效研究地黄中主要的活性成分的含量变化差异，研究各类化合物炮制后的含量变化规律，为进一步制定地黄不同炮制品的质量标准提供实验依据。
附图说明
图1为不同UPLC色谱条件下酒蒸地黄的分离TIC图（A为色谱条件1，B为色谱条件2，C为色谱条件3）。
图2为酒蒸地黄中34种化合物及内标的TIC图。
图3为生地黄中22种化合物及内标的TIC图。
图4为酒蒸地黄中22种化合物及内标的TIC图。
图5为九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）中22种化合物及内标的TIC图。
图6为九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）中22种化合物及内标的TIC图。
图7为酒炖地黄中22种化合物及内标的TIC图 。
图8为10个混合对照品及内标TIC图。
图9为地黄不同炮制品中环烯醚萜苷类化合物与内标的峰面积比。
图10为地黄不同炮制品中苯乙醇苷类化合物与内标的峰面积比。
图11 为地黄不同炮制品中其他化合物与内标的峰面积比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
仪器：超高效液相系统包括Waters Acquity高效液相色谱仪、Sample ManagerFTN自动进样器、Binary Solvent Manager二元泵，WAT-S4LV1467柱温箱（美国Waters公司）；Xevo G2-XS Q/TOF质谱仪：配有Masslynx V4.2分析软件、UNIFI Portal软件、TCMChinese数据库（美国Waters公司）KQ-500E型数控超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；MS205DU 型万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。
试剂及药材：乙腈为质谱纯（德国Merck公司）；甲酸为质谱纯（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；纯净水（杭州哇哈哈饮用水有限公司）；生地黄购自江西省樟树市药材市场，经江西中医药大学药学院中药鉴定教研室付小梅教授鉴定为玄参科地黄属植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根，标本保留在江西省药品检验检测研究院科研室。
地黄化合物质谱数据库：以文献公开的所有已知地黄中的化学成分的质谱数据结合UNIFI Portal软件的Traditionl TCM数据库构建地黄化合物数据库，供结构鉴定使用。
炮制品的制备：酒蒸地黄、酒炖地黄、九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）、九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁），以上地黄炮制品均委托江西古汉精致中药饮片有限公司分别按照《中国药典》一部2010年版“地黄”及“熟地黄”项下有关规定和《江西省中药饮片炮制规范》2008年版“地黄”项下有关方法进行炮制。
加标供试品溶液的制备：分别取生地黄、酒蒸地黄（药典法）、酒炖地黄（药典法）、九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）、九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）药材，60℃干燥10h，粉碎。取本品药材约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液0.6mL置2mL容量瓶中，精密加入40μL内标溶液，加水至刻度，摇匀，12000r·min-1离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，即得。
实施例1 本发明所述分析方法的建立
1. 酒蒸地黄炮制品UPLC色谱条件的筛选
酒蒸地黄炮制品的制备：酒蒸地黄委托江西古汉精致中药饮片有限公司按照《中国药典》一部2010年版 “熟地黄”项下有关规定方法进行炮制。
供试品溶液的制备：取酒蒸地黄（药典法）药材，60℃干燥10h，粉碎。取本品药材约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液0.6mL置2mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，12000r·min-1离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，即得。
色谱方法1：
UPLC条件：Waters ACQUITY BEH C18 (2.1×100mm，1.7μm)色谱柱；流动相以乙腈为A相，以0.1%甲酸水溶液为B相，A、B相混合梯度洗脱，洗脱条件为：0～1min，5%A相；1～6min，5%A相～24%A相；6～10min，24%A相～35%A相。柱温40℃；流速0.3mL·min-1；进样量：1μL。
色谱方法2：
UPLC条件：Waters ACQUITY BEH C18 (2.1×100mm，1.7μm)色谱柱；流动相以乙腈为A相，以0.1%甲酸水溶液为B相，A、B相混合梯度洗脱，洗脱条件为：0～5min，5%A相；5～10min，5%A相～20%A相；10～25min，20%A相～60%A相。柱温40℃；流速0.3mL·min-1；进样量：1μL。
色谱方法3：
UPLC条件：Waters ACQUITY BEH C18 (2.1×100mm，1.7μm)色谱柱；流动相以甲醇为A相，以0.1%甲酸水溶液为B相，A、B相混合梯度洗脱，洗脱条件为：0～1min，5%A相；1～6min，5%A相～24%A相；6～15min，24%A相～48%A相；15～30min，48%A相～78%A相。柱温40℃；流速0.3mL·min-1；进样量：1μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)：分别采用正离子模式进行 MSE扫描；离子源电压为 4500 V；离子源温度为100℃；毛细管电压为3.0kV；锥孔电压为40V；低碰撞电压为6 V；高碰撞电压为40～60 V；以氮气为雾化气和锥孔气；锥孔气流量为50L·h-1；雾化气体积流量为800L·h-1；脱溶剂化温度为350℃；扫描范围m/z100～1200，扫描时间为0.3s；亮氨酸脑啡肽实时校准质量数。
分别以色谱方法1~3结合质谱，对酒蒸地黄炮制品进行分析，分析结果如图1所示。结果表明，在满足质谱分析的要求下，色谱条件1下酒蒸地黄在10分钟内可以得到快速有效分离，且峰形尖锐，分离度良好，色谱条件3下酒蒸地黄需要在30分钟才能够有效分离；色谱条件2下不能满足质谱分析的要求。确定以色谱条件1作为本发明的UPLC色谱条件。
2. 内标的确定
在色谱条件1下，结合保留时间、对分析峰无干扰、基质干扰小、离子化程度高且稳定、峰面积稳定等多种因素选择合适的化合物作为内标，最终确定升麻素苷为内标。
内标溶液的制备：取升麻素苷对照品1mg置2mL量瓶，加30%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，制成500μg·mL-1的溶液，即得。
内标准确度的考察：色谱条件1下，生地黄、酒蒸地黄、酒炖地黄、九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）、九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）5种地黄加标样品中内标升麻素苷的分子离子峰峰面积分别：1998450、1959206、2012828、1988910、2063541，RSD为：1.91%，说明仪器及方法稳定，符合要求。
实施例2 本发明所述地黄炮制品特征图谱的建立
1. 特征化合物的确定
采用UPLC-Q/TOF-MS方法对酒蒸地黄供试品溶液（加标）进行正离子MSE扫描，获得正离子模式下的质谱总离子流图。利用地黄化合物质谱数据库将质谱数据分析结果，通过化合物裂解规律以及相关化合物质谱数据对化合物进行鉴定，最终共鉴定出34个化合物。34个化合物及内标的总离子流图如图2所示，图中标记的化合物为： 1.毛蕊花糖；2.蔗糖；3.地黄苷A；4.2'-乙酰乙醇苷；5.蜜二糖；6.棉子糖；7.果糖；8.腺苷；9.梓醇；10.水苏糖；11.甘露三糖；12.地黄苷D；13.密力特苷；14.5-羟甲基糠醛；15.京尼平苷酸；16.脱咖啡酰基毛蕊糖苷；17. 8-表番木鳖酸；18.氢化阿魏酸；19.红景天苷；20.肉苁蓉苷F；21.栀子苷；22.松果菊苷；23.乙酰梓醇；24.地黄苦苷或其同分异构体；25.地黄苦苷或其同分异构体；26.升麻素苷（内标）；27.肉苁蓉苷A；28.毛蕊花糖苷；29.地黄苷C；30.焦地黄苯乙醇苷B1；31.连翘酯苷A；32.异类叶升麻苷；33.地黄苷；34.野菰酸；35.异地黄苷。
将34个化合物相应的分子离子峰的峰面积与内标峰面积的比值为横坐标，药材浓度为纵坐标，进行线性拟合，得回归方程，计算r2值。结果见表1。
表1正离子模式下酒蒸地黄中34种化合物及内标的UPLC-Q/TOF-MS定性分析及标准曲线
Figure 903313DEST_PATH_IMAGE002
以酒蒸地黄化合物r2>0.99者，即化合物相应的分子离子峰的峰面积与内标峰面积的比值与药材浓度二者线性关系良好者为地黄特征图谱中的特征峰。共得到22个化合物，分别为：地黄苷A，梓醇，腺苷，地黄苷D，密力特苷，5-羟甲基糠醛，京尼平苷酸，脱咖啡酰基毛蕊糖苷，8-表番木鳖酸，红景天苷，肉苁蓉苷F，栀子苷，松果菊苷，乙酰梓醇，肉苁蓉苷A，毛蕊花糖苷，地黄苷C，焦地黄苯乙醇苷B1，连翘酯苷A，异类叶升麻苷，地黄苷，异地黄苷。22种化合物在药材浓度为0.7617～15.234mg·mL-1范围内，线性关系良好。22种化合物准分子离子及碎片离子信息详见表2。
表2正离子模式下酒蒸地黄中22种化合物及内标的UPLC-Q/TOF-MS定性分析
Figure 126484DEST_PATH_IMAGE003
注：*为通过对照品比对的化合物（对照品：梓醇、毛蕊花糖苷、腺苷、焦地黄苯乙醇苷B1、密力特苷、升麻素苷、异类叶升麻苷、地黄苷D、5-羟甲基糠醛、栀子苷和京尼平苷酸）。
2. 精密度考察
取酒蒸地黄供试品溶液连续进样6次，以22种化合物相应的分子离子峰的峰面积与内标峰面积的比值为考察对象，计算平均值和RSD值。结果见表3。
表3 精密度实验结果
Figure 332337DEST_PATH_IMAGE004
实验显示，22种化合物的RSD%为1.55～8.32，精密度符合要求。
3. 稳定性考察
酒蒸地黄供试品溶液分别于0、4、8、12、16、24h进样6次，以22种化合物相应的分子离子峰的峰面积与内标峰面积的比值为考察对象，计算平均值和RSD值，结果见表4。
表4 稳定性实验结果
Figure 324564DEST_PATH_IMAGE005
实验显示，22种化合物的RSD%为1.98～7.92，说明22种化合物在24h内稳定性良好。
地黄炮制品特征图谱的确立：将地黄苷A、梓醇、腺苷、地黄苷D、密力特苷、5-羟甲基糠醛、京尼平苷酸、脱咖啡酰基毛蕊糖苷、8-表番木鳖酸、红景天苷、肉苁蓉苷F、栀子苷、松果菊苷、乙酰梓醇、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、地黄苷 C、焦地黄苯乙醇苷B1、连翘酯苷A、异类叶升麻苷、地黄苷、异地黄苷中的每一种化合物的UPLC-Q/TOF-MS数据进行集合，获得特征图谱。
实施例3采用本发明所述方法对地黄不同炮制品进行分析
混合对照品溶液的制备：分别精密称定对照品腺苷、梓醇、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、密力特苷、升麻素苷、异类叶升麻苷、地黄苷D、5-羟甲基糠醛、栀子苷和京尼平苷酸各约1mg，置1mL量瓶中，加入甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为1mg·mL-1的对照品溶液。分别精密量取上述对照品溶液各50μL置10mL量瓶中，加30%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，使制成质量浓度各为5μg·mL-1的溶液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
采用实施例1色谱条件1 UPLC-Q/TOF-MS对生地黄、酒蒸地黄（药典法）、酒炖地黄（药典法）、九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）、九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）供试品溶液进行正离子MSE扫描，获得正离子模式下的质谱总离子流图，见图3-8，图3为生地黄中22种化合物及内标的TIC图。图4为酒蒸地黄TIC图。图5为九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）TIC图。图6为九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）TIC图。图7为 酒炖地黄TIC图 。（图3-7中的数字标记代表：1.地黄苷A；2.梓醇；3.腺苷；4.地黄苷D；5.密力特苷；6.5-羟甲基糠醛；7.京尼平苷酸；8.脱咖啡酰基毛蕊糖苷；9.8-表番木鳖酸；10.红景天苷；11.肉苁蓉苷F；12.栀子苷；13.松果菊苷；14.乙酰梓醇；15.升麻素苷（内标）；16.肉苁蓉苷A；17.毛蕊花糖苷；18.地黄苷 C；19.焦地黄苯乙醇苷B1；20.连翘酯苷A；21.异类叶升麻苷；22.地黄苷；23.异地黄苷)。图8为10个混合对照品及内标的TIC图。（图中的数字标记代表：2.梓醇；3.腺苷；4.地黄苷 D；5. 密力特苷；6. 5-羟甲基糠醛；7. 京尼平苷酸； 12.栀子苷；15.升麻素苷（内标）；17.毛蕊花糖苷；19.焦地黄苯乙醇苷B1；21. 异类叶升麻苷）。利用地黄化合物质谱数据库进行筛查，初步得到质谱数据分析结果，通过化合物裂解规律以及相关化合物质谱数据对软件给出的可能存在的化合物列表进行鉴定。结果与表2结果一致。
实施例4本发明所述方法在分析地黄不同炮制品中化合物的含量变化中的应用
1.环烯醚萜苷类化合物含量变化分析
环烯醚萜苷类成分是地黄中数量最多、含量最大的一类化合物，本实施例通过本发明所述特征图谱对地黄不同炮制品中9个环烯醚萜苷类化合物进行含量分析，含量以环烯醚萜苷类化合物分子离子峰的峰面积与内标峰面积的比值表示。结果如图9和表5所示。
表5 地黄不同炮制品中环烯醚萜苷类化合物的含量分析
Figure 994490DEST_PATH_IMAGE006
结果表明，地黄不同炮制品中总环烯醚萜苷类成分差异明显，与生地黄相比，酒蒸地黄环烯醚萜苷类成分含量增加，但其余3种地黄炮制品的含量减少。其中，九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）该类成分约为生地黄的65.9%，酒炖地黄该类成分含量约为生地黄的47.8%，而九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）中该类成分含量约为生地黄的27%。提示环烯醚萜苷类成分受到炮制温度、炮制次数、炮制时间和是否添加其他辅料等因素的影响，温度高、时间长、次数多都使得该类成分含量减少，经过酒蒸炮制可以使得生地黄中其他成分转化成环烯醚萜苷类成分，且酒蒸地黄是各种炮制品中该类成分最高的。地黄苷D是含量最高的环烯醚萜苷，其在酒蒸地黄与生地黄中含量基本相同，但其他3个地黄炮制品中含量下降，其中九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）中含量最低，约为生地黄的9.1%。
2.苯乙醇苷类化合物分析
苯乙醇苷类化合物是一类含有羟基或甲氧基取代的苯乙基和羟基或甲氧基取代的肉桂酰基，通常以β-葡萄糖为母核，通过酯键及氧苷键形成的糖苷类天然产物。本实施例通过本发明所述特征图谱对地黄不同炮制品中11个苯乙醇苷类化合物进行含量分析，含量以苯乙醇苷类化合物分子离子峰的峰面积与内标峰面积的比值表示。结果如图10和表6所示。
表6 地黄不同炮制品中苯乙醇苷类化合物的含量分析
Figure 704957DEST_PATH_IMAGE007
结果表明，地黄不同炮制品中总苯乙醇苷类成分差异明显，与生地黄相比九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）总苯乙醇苷类成分含量增加，但其余3种地黄炮制品的含量减少，其中，酒炖地黄总苯乙醇苷类成分约为九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）的33%。提示苯乙醇苷类成分受到炮制温度影响较大，酒炖地黄中该类成分约为酒蒸地黄的46.8%。典型代表为异类叶升麻苷。异类叶升麻苷是地黄中含量最高的苯乙醇苷类化合物，其在九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）中含量最高，酒炖地黄中含量最低，九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）>九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）>酒蒸地黄>生地黄>酒炖地黄。
3. 其它化合物分析
本实施例通过本发明所述特征图谱对地黄不同炮制品中的5-羟甲基糠醛和腺苷进行了含量分析，含量以5-羟甲基糠醛和腺苷分子离子峰的峰面积与内标峰面积的比值表示，见图11和表7。
表7地黄不同炮制品中其他化合物的含量分析
Figure 448922DEST_PATH_IMAGE008
结果表明，5-羟甲基糠醛在生地黄中含量非常低，但经过炮制以后，其含量显著增加，并随受热时间的增加而增加，在九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）中含量最高，其变化规律为：九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）>酒蒸地黄>九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）>酒炖地黄>生地黄。腺苷在酒蒸地黄中含量最高，九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）中含量最低，其变化规律为：酒蒸地黄>生地黄>九蒸九晒地黄（不加陈皮、砂仁）>酒炖地黄>九蒸九晒地黄（加陈皮、砂仁）。
以上研究结果表明本发明所述方法能够有效地区分地黄的不同炮制品，并能有效研究地黄中主要的活性成分的含量变化差异，研究各类化合物炮制后的含量变化规律，为进一步制定地黄不同炮制品的质量标准提供实验依据。

Claims (1)

1.一种地黄炮制品化学成分的分析方法，其特征在于采用UPLC-MS技术，以升麻素苷为内标，采用内标法对地黄炮制品进行半定量分析，具体包括如下步骤：
（1）样品处理：取地黄炮制品，使用醇提取，得到提取液，制备加入升麻素苷内标的地黄炮制品供试品溶液；
（2）采用UPLC法和质谱法对步骤（1）的供试品溶液进行半定量分析，UPLC检测条件：C18色谱柱；流动相以乙腈为A相，以0.1%甲酸水溶液为B相，A、B相混合梯度洗脱，洗脱条件为：0～1min，5%A相；1～6min，5%～24%A相；6～10min，24%～35%A相；所述质谱法为Q/TOF-MS，条件为：电喷雾离子源，采用正离子模式进行MSE扫描；离子源电压为 4500 V；离子源温度为100℃；毛细管电压为3.0kV；锥孔电压为40 V；低碰撞电压为6 V；高碰撞电压为40～60V；以氮气为雾化气和锥孔气；锥孔气流量为50L·h-1；雾化气体积流量为800L·h-1；脱溶剂化温度为350℃；扫描范围m/z100～1200，扫描时间为0.3s；亮氨酸脑啡肽实时校准质量数；
（3）将步骤（2）的分析结果与地黄炮制品特征图谱进行对比鉴定，所述地黄炮制品的特征图谱包括地黄苷A、梓醇、腺苷、地黄苷D、密力特苷、5-羟甲基糠醛、京尼平苷酸、脱咖啡酰基毛蕊糖苷、8-表番木鳖酸、红景天苷、肉苁蓉苷F、栀子苷、松果菊苷、乙酰梓醇、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、地黄苷C、焦地黄苯乙醇苷B1、连翘酯苷A、异类叶升麻苷、地黄苷、异地黄苷的UPLC-Q/TOF-MS数据，所述特征图谱采用UPLC法和Q/TOF-MS质谱法，以升麻素苷为内标构建而成，UPLC法的检测条件为：C18色谱柱；流动相以乙腈为A相，以0.1%甲酸水溶液为B相，A、B相混合梯度洗脱，洗脱条件为：0～1min，5%A相；1～6min，5%～24%A相；6～10min，24%～35%A相。
CN202111559579.1A 2021-12-20 2021-12-20 一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法 Active CN113945674B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111559579.1A CN113945674B (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111559579.1A CN113945674B (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113945674A CN113945674A (zh) 2022-01-18
CN113945674B true CN113945674B (zh) 2023-01-13

Family

ID=79339356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111559579.1A Active CN113945674B (zh) 2021-12-20 2021-12-20 一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113945674B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116773703A (zh) * 2023-06-29 2023-09-19 广东一方制药有限公司 生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法以及鉴别方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011154258A1 (en) * 2010-06-09 2011-12-15 Galderma Research & Development Method for analysis of sebum samples
WO2014067478A1 (zh) * 2012-11-02 2014-05-08 丽珠集团利民制药厂 一种参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法
CN107449849A (zh) * 2017-10-11 2017-12-08 天津中医药大学 一种中药鉴别方法
CN113777183A (zh) * 2021-08-09 2021-12-10 广东一方制药有限公司 女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法、多指标成分含量检测方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5337144B2 (ja) * 2008-04-03 2013-11-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置を用いた定量分析方法
TWI426266B (zh) * 2011-06-29 2014-02-11 Univ Kaohsiung Medical 用於檢測醌類、二苯乙烯類、黃酮類及生物鹼類組合物之化學圖資分析
CN104914199B (zh) * 2014-03-10 2017-11-17 河北以岭医药研究院有限公司 一种中药组合物制剂中十二种成分的含量测定方法
CN107153098B (zh) * 2016-03-03 2021-05-04 石家庄以岭药业股份有限公司 一种中药组合物的指纹图谱的测定方法
CN108226313B (zh) * 2016-12-15 2021-07-30 上海医药工业研究院 地黄中苷类成分的同时测定及指纹图谱构建方法
CN106596800B (zh) * 2017-02-09 2019-09-20 重庆市中药研究院 一种基于uplc/q-tof的淫羊藿多种黄酮成分快速测定方法
CN107727763B (zh) * 2017-09-30 2022-05-24 宁夏医科大学 肉苁蓉药材中七种苯乙醇苷成分快速定性与定量检测方法
CN109115912A (zh) * 2018-09-29 2019-01-01 山东省中医药研究院 一种银黄颗粒外加内标指纹图谱测定方法
CN113495102B (zh) * 2020-04-03 2022-10-25 国药集团同济堂（贵州）制药有限公司 一种基于uplc-q-tof-ms技术鉴定淫羊藿的方法
CN112285221B (zh) * 2020-09-22 2022-08-05 成都华神科技集团股份有限公司 一种百合地黄汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法
CN112505221A (zh) * 2020-11-19 2021-03-16 上海长征医院 基于uhplc-q-tof/ms识别消痰通腑方化学成分的分析方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011154258A1 (en) * 2010-06-09 2011-12-15 Galderma Research & Development Method for analysis of sebum samples
WO2014067478A1 (zh) * 2012-11-02 2014-05-08 丽珠集团利民制药厂 一种参芪扶正注射液指纹图谱的建立方法
CN107449849A (zh) * 2017-10-11 2017-12-08 天津中医药大学 一种中药鉴别方法
CN113777183A (zh) * 2021-08-09 2021-12-10 广东一方制药有限公司 女贞子药材及其炮制品的特征图谱构建方法、多指标成分含量检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113945674A (zh) 2022-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cai et al. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of Chinese medicinal herbs
CN105738546B (zh) 毛郁金药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
Xia et al. Accumulation of saponins in Panax notoginseng during its growing seasons
Peng-Peng et al. Metabolomics analysis and rapid identification of changes in chemical ingredients in crude and processed Astragali Radix by UPLC-QTOF-MS combined with novel informatics UNIFI platform
Roopashree et al. Advanced method of secondary metabolite extraction and quality analysis
CN108508107A (zh) 一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法
CN109490437B (zh) 白芍的指纹图谱检测方法
CN103123344A (zh) 一种药物组合物的指纹图谱的测定方法
CN113945674B (zh) 一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法
Sotenjwa et al. Chemotypic variation of non-volatile constituents of Artemisia afra (African wormwood) from South Africa
Qi et al. HPLC fingerprint and LC-TOF-MS analysis on extract from roots of Gentiana macrophylla
CN109444290B (zh) 车前草药材uplc特征图谱的构建方法和检测方法
CN110887927A (zh) 一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法
Yang et al. Colour, chemical compounds, and antioxidant capacity of Astragali Radix based on untargeted metabolomics and targeted quantification
Yau et al. Quality control and quality assurance of phytomedicines: Key considerations, methods, and analytical challenges
CN110487925A (zh) 一种快速识别百合地黄汤中化学成分的方法
Mukherjee et al. Hyphenated analytical techniques for validation of herbal medicine
CN112147249B (zh) 一种杨梅酒中31种有效成分的UPC2-PDA-Q-Tof/MS检测方法
CN110243967B (zh) 一种菟丝子拟雌激素作用质量标志物的筛选方法及其特征图谱的构建与应用
CN106918670B (zh) 一种药物组合物的质量检测方法
Duan et al. Qualitative analysis and the profiling of isoflavonoids in various tissues of Pueraria Lobata roots by ultra performance liquid chromatography quadrupole/time-of-flight-mass spectrometry and high performance liquid chromatography separation and ultraviole
CN110441443B (zh) 一种有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的uplc特征图谱构建方法及其鉴别方法
CN1951417A (zh) 一种药物组合物的质量控制方法
CN113820420A (zh) 一种采用uplc-q-tof-ms对益智酒中化学成分的测定方法
CN106526043A (zh) 一种检测三叶青叶中多种化学成分的rrlc‑q‑tof‑ms方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant