CN110441443B - 一种有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的uplc特征图谱构建方法及其鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱构建方法及其鉴别方法。所述的一种有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱构建方法包含如下步骤:(1)精密称取有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦药材,制备得到有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦供试品溶液;(2)将有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析,得到有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦的UPLC特征图谱,确定共有峰数量。该方法精密度、稳定性和重现性较好,充分展示了有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的化学特征,能更好的鉴别有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦药材。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体公开了一种有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱构建方法及其鉴别方法。
背景技术
2015版《中国药典》上收载的石韦为水龙骨科植物庐山石韦Pyrrosia sheareri(Bak.)Ching、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.)Farwell或有柄石韦Pyrrosia petiolosa(Christ)Ching的干燥叶。全年均可采收,除去根茎和根,晒干或阴干。有柄石韦Pyrrosiapetiolosa (Christ)Ching水龙骨科植物,为中药石韦的三个基源之一。石韦其味甘苦,微寒,归肺、膀胱经,具利尿通淋,清肺止咳,凉血止血功效。石韦始载于《神农本草经》,列为中品,历史悠久。
目前,鉴别方法包括传统方法和与现代科技结合的色谱方法。现阶段,传统的眼看、口尝、鼻闻、手摸等简便方法由于主观性强,在中药材鉴别已非常局限,而色谱方法诸如UV、IR、NIR、TLC中存在大量的假阳性和假阴性问题,容易导致结论的偏差。
近年来,由于中药有效成分多样性及复杂性,过往单一成分含量测定不足以说明中药材的质量,亦缺乏专属性。特征图谱既能全面反映中药个体之间的共性,亦能反映中药种群之间的唯一性。运用特征图谱控制中药质量,比目前沿用的方法提供的信息更为全面、丰富,可以为石韦质量控制提供全面的质量控制手段。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷与不足,提供了一种有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱的构建方法及其鉴别方法,该方法分析速度快、分离度好、所需流动相少、精密度高、稳定性好、重复性好,通过所构建的特征图谱能够对有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦进行全面而有效的鉴别。
本发明所要解决的上述技术问题,通过如下技术方案予以实现:
一种有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱构建方法,其包含如下步骤:
(1)精密称取有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦药材,制备得到有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦供试品溶液;
(2)将有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析,得到有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦的UPLC特征图谱,确定共有峰数量。
作为一种优选方案,所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为0.5~2μl。
作为一种最优选方案,所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.38ml,柱温为30℃,检测波长为326nm,进样量为1μl。
作为一种优选方案,所述梯度洗脱条件为:0~15min,流动相A的体积分数变化为7~15%,流动相B的体积分数变化为93~85%;15~18min,流动相A的体积分数变化为15~20%,流动相B的体积分数变化为85~80%;18~25min,流动相A的体积分数变化为20~25%,流动相B的体积分数变化为80~75%;25~30min,流动相A的体积分数为25%,流动相B的体积分数为75%;30~35min,流动相A的体积分数变化为25~40%,流动相B的体积分数变化为75~60%;35~40min,流动相A的体积分数变化为40~80%,流动相B的体积分数变化为60~20%;40~45min,流动相A的体积分数为80%,流动相B的体积分数为20%。
作为一种优选方案,所述供试品溶液通过如下步骤的方法制备得到:取有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦粉末0.4~0.6g,精密加入有机溶剂20~30ml,称定重量,超声处理26~35分钟,放冷,再称定重量,用有机溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
作为一种最优选方案,所述供试品溶液通过如下步骤的方法制备得到:取有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦粉末0.5g,精密加入有机溶剂25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用有机溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
作为一种优选方案,所述有机溶剂为50%甲醇。
本发明还提供了有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的鉴别方法,包括如下步骤:
(1)精密称取待鉴别有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦药材,制备得到待鉴别有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦样品溶液;
(2)精密吸取待鉴别有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦样品溶液,注入超高效液相色谱仪,测定,即得;
(3)将测得的UPLC特征图谱与构建出的有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱进行比较比对,若共有峰数量与有柄石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为有柄石韦;若共有峰数量与石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为石韦;若共有峰数量与庐山石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为庐山石韦;若共有峰数量与华北石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为华北石韦。
作为一种优选方案,所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为0.5~2μl。
作为一种最优选方案,所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.38ml,柱温为30℃,检测波长为326nm,进样量为1μl。
作为一种优选方案,所述梯度洗脱条件为:0~15min,流动相A的体积分数变化为7~15%,流动相B的体积分数变化为93~85%;15~18min,流动相A的体积分数变化为15~20%,流动相B的体积分数变化为85~80%;18~25min,流动相A的体积分数变化为20~25%,流动相B的体积分数变化为80~75%;25~30min,流动相A的体积分数为25%,流动相B的体积分数为75%;30~35min,流动相A的体积分数变化为25~40%,流动相B的体积分数变化为75~60%;35~40min,流动相A的体积分数变化为40~80%,流动相B的体积分数变化为60~20%;40~45min,流动相A的体积分数为80%,流动相B的体积分数为20%。
作为一种优选方案,所述待鉴别样品溶液通过如下步骤的方法制备得到:取待鉴别有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦样品粉末0.4~0.6g,精密加入有机溶剂20~30ml,称定重量,超声处理26~35分钟,放冷,再称定重量,用有机溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
作为一种最优选方案,所述待鉴别样品溶液通过如下步骤的方法制备得到:取待鉴别有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦样品粉末0.5g,精密加入有机溶剂25ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用有机溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
作为一种优选方案,所述有机溶剂为50%甲醇。
有益效果:(1)本发明首次构建了有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦的UPLC特征图谱;(2)本发明构建的有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦的UPLC特征图谱,充分展示了有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦的化学成分特征;(3)本发明构建的特征图谱全面的反应样品的特征峰信息,且方法稳定,精密度高,重现性较好;(4)本发明所述的有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦的鉴别方法,更加快速,准确度更高。
附图说明
图1为有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦UPLC对照特征图谱。
图2为待鉴别5批庐山石韦药材特征图谱。
图3为待鉴别3批华北石韦药材特征图谱。
图4为待鉴别1批石韦药材特征图谱。
图5为待鉴别20批有柄石韦药材特征图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱的构建
(1)精密称取有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦药材,制备得到有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦供试品溶液;
(2)将有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析,得到有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦的UPLC特征图谱,确定共有峰数量。
29批实验样品来源自全国各大药房,并经过相关权威机构检测合格,详见表1。
表1 29批基原石韦的批号
有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦供试品的配制:取有柄石韦、石韦、庐山石韦、华北石韦粉末0.5g,精密称量,置具塞锥形瓶中,精密加入有机溶剂25ml,称定重量,在功率300W,频率40kHz条件下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为1μl。
表2 梯度洗脱流动相配比
数据处理
利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件和SPSS20.0对数据进行处理分析。
有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦UPLC特征图谱的建立
精密度试验
取供试品溶液,连续进样6次,记录色谱图,以4号峰为参照峰,计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%,相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明仪器精密度良好。
稳定性试验
取供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、18、24h进样,记录色谱图,以4号峰为参照峰,各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%,相对峰面积的RSD均小于3.0%,结果表明供试品溶液在24h内稳定。
重复性试验
取样品粉末6份,分别进样,记录色谱图,以4号峰为参照峰,计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于3.0%,相对峰面积的RSD均小于3.0%,结果表明方法重复性良好。
共有峰的确定
取29批有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦样品,按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,进样测定,使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对29批有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦药材特征图谱进行共有峰标识,并生成对照图谱,得到其共有峰图,结果见图1,同时标记其共有峰,得到有柄石韦、石韦、庐山石韦与华北石韦共有峰表3。
表3 有柄石韦、石韦、庐山石韦或华北石韦共有峰
实施例2
5批庐山石韦药材的鉴别
庐山石韦药材的鉴别步骤为:
(1)精密称取待鉴别庐山石韦药材,制备得到待鉴别庐山石韦样品溶液;
(2)精密吸取待鉴别庐山石韦样品溶液,注入超高效液相色谱仪,测定,即得;
(3)将测得的UPLC特征图谱与构建出的庐山石韦的UPLC特征图谱进行比较比对,若共有峰数量与庐山石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为庐山石韦。
色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为1μl。
庐山石韦待鉴别样品溶液的配制:取庐山石韦粉末0.5g,精密称量,置具塞锥形瓶中,精密加入有机溶剂25ml,称定重量,在功率300W,频率40kHz条件下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
表4 梯度洗脱流动相配比
数据处理
利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件和SPSS20.0对数据进行处理分析。
5批庐山石韦测得的特征图谱图2,将其与构建的庐山石韦特征图谱比对,两者共有峰数量一致,则待鉴别5批庐山石韦样品为庐山石韦。
实施例3
3批华北石韦药材的鉴别
华北石韦药材的鉴别步骤为:
(1)精密称取待鉴别华北石韦药材,制备得到待鉴别华北石韦样品溶液;
(2)精密吸取待鉴别华北石韦样品溶液,注入超高效液相色谱仪,测定,即得;
(3)将测得的UPLC特征图谱与与构建出的华北石韦的UPLC特征图谱进行比较比对,若共有峰数量与华北石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为华北石韦。
色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为1μl。
华北石韦待鉴别样品溶液的配制:取华北石韦粉末0.5g,精密称量,置具塞锥形瓶中,精密加入有机溶剂25ml,称定重量,在功率300W,频率40kHz条件下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
表5 梯度洗脱流动相配比
数据处理
利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件和SPSS20.0对数据进行处理分析。
3批华北石韦测得的特征图谱图3,将其与构建的华北石韦特征图谱比对,两者共有峰数量一致,则待鉴别3批华北石韦样品为华北石韦。
实施例4
石韦药材的鉴别
石韦药材的鉴别步骤为:
(1)精密称取待鉴别石韦药材,制备得到待鉴别石韦样品溶液;
(2)精密吸取待鉴别石韦样品溶液,注入超高效液相色谱仪,测定,即得;
(3)将测得的UPLC特征图谱与与构建出的石韦的UPLC特征图谱进行比较比对,若共有峰数量与石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为石韦。
色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为1μl。
石韦待鉴别样品溶液的配制:取石韦粉末0.5g,精密称量,置具塞锥形瓶中,精密加入有机溶剂25ml,称定重量,在功率300W,频率40kHz条件下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
表6 梯度洗脱流动相配比
数据处理
利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件和SPSS20.0对数据进行处理分析。
石韦测得的特征图谱图4,将其与构建的石韦特征图谱比对,两者共有峰数量一致,则待鉴别样品为石韦。
实施例5
20批有柄石韦药材的鉴别
有柄石韦药材的鉴别步骤为:
(1)精密称取待鉴别有柄石韦药材,制备得到待鉴别有柄石韦样品溶液;
(2)精密吸取待鉴别有柄石韦样品溶液,注入超高效液相色谱仪,测定,即得;
(3)将测得的UPLC特征图谱与与构建出的有柄石韦的UPLC特征图谱进行比较比对,若共有峰数量与有柄石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为有柄石韦。
色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为1μl。
有柄石韦待鉴别样品溶液的配制:取有柄石韦粉末0.5g,精密称量,置具塞锥形瓶中,精密加入有机溶剂25ml,称定重量,在功率300W,频率40kHz条件下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
表7 梯度洗脱流动相配比
数据处理
利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件和SPSS20.0对数据进行处理分析。
20批有柄石韦测得的特征图谱图4,将其与构建的石韦特征图谱比对,两者共有峰数量一致,则待鉴别20批有柄石韦样品为有柄石韦。
中药特征图谱与指纹图谱研究是整体评价中药质量的可行模式,能反映中药质量的真实性、稳定性与一致性。目前有关中药石韦药材指纹图谱已有文献报道,特征图谱研究较少。超高效液相色谱法具有分析速度快、分离度好、所需流动相少等优点。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (2)
1.一种有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦与华北石韦的UPLC特征图谱构建方法,其特征在于,包含如下步骤:
(1)精密称取有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦、华北石韦药材,制备得到有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦、华北石韦供试品溶液;
(2)将有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦、华北石韦供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析,得到有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.)Farwell、庐山石韦、华北石韦的UPLC特征图谱,确定共有峰数量;
所述的供试品溶液通过如下步骤的方法制备得到:取有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua(Thunb.) Farwell、庐山石韦、华北石韦粉末0.4~0.6g,精密加入50%甲醇20~30ml,称定重量,超声处理26~35分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇为流动相A,以0.08~0.13%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为每分钟0.34~0.46ml,柱温为28~32℃,检测波长为290~360nm,进样量为0.5~2μl;
梯度洗脱条件为:0~15min,流动相A的体积分数变化为7~15%,流动相B的体积分数变化为93~85%;15~18min,流动相A的体积分数变化为15~20%,流动相B的体积分数变化为85~80%;18~25min,流动相A的体积分数变化为20~25%,流动相B的体积分数变化为80~75%;25~30min,流动相A的体积分数为25%,流动相B的体积分数为75%;30~35min,流动相A的体积分数变化为25~40%,流动相B的体积分数变化为75~60%;35~40min,流动相A的体积分数变化为40~80%,流动相B的体积分数变化为60~20%;40~45min,流动相A的体积分数为80%,流动相B的体积分数为20%。
2.一种有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦与华北石韦的鉴别方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)按权利要求1所述的供试品溶液的制备方法制备待鉴别有柄石韦、石韦Pyrrosialingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦、华北石韦样品溶液;
(2)精密吸取待鉴别有柄石韦、石韦Pyrrosia lingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦、华北石韦样品溶液,注入超高效液相色谱仪,按权利要求1所述的超高效液相色谱仪分析的色谱条件进行测定;
(3)将测得的UPLC特征图谱与按权利要求1所述方法构建出的有柄石韦、石韦Pyrrosialingua (Thunb.) Farwell、庐山石韦和华北石韦的UPLC特征图谱进行比对,若共有峰数量与有柄石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为有柄石韦;若共有峰数量与石韦Pyrrosialingua (Thunb.) Farwell特征图谱一致,则待鉴别样品为石韦Pyrrosia lingua(Thunb.) Farwell;若共有峰数量与庐山石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为庐山石韦;若共有峰数量与华北石韦特征图谱一致,则待鉴别样品为华北石韦。
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CN (1) | CN110441443B (zh) |
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CN112415104B (zh) * | 2020-10-26 | 2022-04-12 | 四川新绿色药业科技发展有限公司 | 一种有柄石韦药材及其饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱、构建方法和检测方法 |
Citations (3)
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CN1775234A (zh) * | 2005-04-22 | 2006-05-24 | 安徽科创中药天然药物研究所有限责任公司 | 一种复方石韦颗粒的制备方法及其质量控制技术 |
CN1850170A (zh) * | 2005-04-22 | 2006-10-25 | 安徽科创中药天然药物研究所有限责任公司 | 一种复方石韦胶囊的制备方法及其质量控制技术 |
CN105738547A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-07-06 | 广西梧州制药(集团)股份有限公司 | 一种结石通片指纹图谱的建立方法 |
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2019
- 2019-09-20 CN CN201910895239.2A patent/CN110441443B/zh active Active
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CN1775234A (zh) * | 2005-04-22 | 2006-05-24 | 安徽科创中药天然药物研究所有限责任公司 | 一种复方石韦颗粒的制备方法及其质量控制技术 |
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Title |
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Comparative pharmacognosy of Pyrrosia petiolosa and Pyrrosia davidii;Dandan Cheng 等;《Rev Bras Farmacogn》;20141231;第24卷;368-380 * |
HPLC法测定有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指纹图谱分析;高贝 等;《中国野生植物资源》;20150228;第34卷(第01期);19-21,36 * |
光石韦药材HPLC指纹图谱研究;黄艳 等;《中国实验方剂学杂志》;20130630;第19卷(第11期);152-155 * |
石韦的HPLC指纹图谱研究与灰色关联度分析;崔露露;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 医药卫生科技辑》;20180315(第03期);E057-98 * |
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