CN110297047B - 细梗香草药材的hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种细梗香草药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，所述方法包括以下步骤：(1)参照物溶液的制备：(2)供试品溶液的制备：(3)指纹图谱：(4)相似度评价：本发明方法简便、快速、准确、重现性好；为细梗香草材质量全面有效的控制提供了有力的保障。
Description
技术领域
本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，尤其是细梗香草药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的图谱。它可以较全面地反映药材所含化学成分的种类和数量，有效地体现中药成分的整体性和综合作用，以其快速、准确等特点已被广泛运用于中药分析鉴定和质量控制等方面，是现阶段最有效的技术手段之一，也得到国际社会的认可。
细梗香草(Lysimachia capillipes Hemsl.)是报春花科(Primulaceae)珍珠菜属(Lysimachia)植物细梗香草的干燥全草，又名满山香、排香、香排草、香草、毛柄珍珠菜，其性甘，味平，归肝、胃、肾经。以全草入药，具有清热解毒、止咳、祛风之功效，用于感冒咳嗽、气管炎、哮喘、月经不调、神经衰弱的治疗。药材分布广泛，主产于福建、江西、湖南、贵州等地。
据文献报道，细梗香草药材中主要含黄酮、皂苷、挥发油和其他类成分，化学成分丰富且复杂。由于受气候、产地、采收季节等因素的影响，不同的细梗香草药材所含成分也存在较大差异。目前，细梗香草的质量控制研究较少且主要集中在单指标成分含量测定，这对细梗香草药材质量的控制就显得非常薄弱。本专利通过对11批次来源不同的细梗香草进行 HPLC指纹图谱研究，建立了细梗香草的指纹图谱，为该药材的质量控制提供了有力的保障。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种细梗香草药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，利用该图谱可监控细梗香草药材不同来源、不同采收季节细梗香草的主要成分的相对含量，用以鉴别其质量真伪。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：细梗香草药材指纹图谱的建立方法包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备
取槲皮素-3-O-(2”,6”-二-O-α-吡喃鼠李糖基)-β-半乳糖苷，山奈酚-3-O-[2-吡喃葡萄糖基(1→3)- 吡喃鼠李糖-6-吡喃鼠李糖]-β-D-吡喃半乳糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基 (1→3)]-4-O-(E-p-香豆)}-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-(4-O-乙酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→6)][α-L-吡喃鼠李糖 -(1→2)]}-β-D-3-反式-p-香豆酰基吡喃葡萄糖苷和细梗香草皂苷I对照品适量，混合，加入甲醇，得到参照物溶液。
(2)供试品溶液的制备：
取细梗香草全草药材提取，提取液经过滤即得；
(3)指纹图谱的制备：
取参照物溶液和多批次供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经过软件处理，得到标准对照指纹图谱，
其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相为乙腈-0.3％磷酸溶液系统，采用梯度洗脱方式。
其中，所述(1)参照物溶液的制备，步骤如下：
其中，所述(2)供试溶液的制备，步骤如下
取干燥的细梗香草全草药材适量，打粉，过3号筛，混匀，取约2.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，加热回流1h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
其中，所述(3)指纹图谱的制备，步骤如下
分别取参照物溶液和由不同批次细梗香草药材制备得到的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录90min内的指纹图谱：
其中，色谱条件为：
采用YMC-Pack ODS-A色谱柱，4.6×150mm，5μm，流动相：乙腈-0.3％磷酸系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→90min，乙腈10％→15％→20％；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；分析时间：90min。
本发明进一步提供一种细梗香草全草药材指纹图谱的检测方法，所述方法，步骤如下：
(1)供试品溶液的制备：
取待测定的细梗香草全草药材，提取，提取液经过滤即得；
(2)检测：
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，将得到的色谱图，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2014A版相似度软件和标准对照指纹图谱进行相似度评价。
其中，所述(1)供试溶液的制备，步骤如下
取干燥的细梗香草全草药材适量，打粉，过3号筛，混匀，取约2.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，加热回流1h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
其中，所述(2)检测，步骤如下
取细梗香草药材制备得到的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录90min内的指纹图谱：
其中，指纹色谱条件为：
采用YMC-Pack ODS-A色谱柱，4.6×150mm，5μm，流动相：乙腈-0.3％磷酸系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→90min，乙腈10％→15％→20％；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；分析时间：90min。
其中，将所得的高效液相色图谱，和标准对照指纹图谱，进行对照，符合一致为合格产品，所述符合一致要求在90％以上，优选的所述符合一致要求在95％以上。
其中，细梗香草药材标准对照指纹图谱，由12个共有指纹峰构成，所述指纹图谱的12个共有指纹峰的相对保留时间范围及相对标准偏差如下：
1号峰：0.236～0.246，RSD为1.595％；
2号峰：0.861～0.864，RSD为0.120％；
3号峰：1，RSD为0；
4号峰：1.190～1.206，RSD为0.496％；
5号峰：1.217～1.234，RSD为0.522％；
6号峰：1.347～1.370，RSD为0.604％；
7号峰：1.363～1.386，RSD为0.607％；
8号峰：1.578～1.594，RSD为0.356％；
9号峰：1.713～1.727，RSD为0.287％；
10号峰：1.807～1.820，RSD为0.256％；
11号峰：2.092～2.103，RSD为0.196％；
12号峰：2.141～2.152，RSD为0.193％；
以下为对不同采收时间、不同产地的12批细梗香草药材的指纹图谱建立方法及据此得到的指纹图谱：
一、试验材料
1.1、药材
12批不同细梗香草药材经江西中医药大学刘勇教授鉴定为报春花科珍珠菜属细梗香草 (Lysimachia capillipes Hemsl.)的干燥全草。12批次细梗香草供试品样品来源等基本信息如表1：
表1：不同批次细梗香草的具体信息
1.2、实验器材
SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪(四元泵，PDA检测器，LC solution色谱工作站，自动进样器)，Sartorius BSA 124S-CW型电子天平(德国赛托利斯公司)，电热恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，FSJ-A05B1型粉碎机，YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×4.6 mm，5μm)。
1.3、试药
槲皮素-3-O-(2”,6”-二-O-α-吡喃鼠李糖基)-β-半乳糖苷，山奈酚-3-O-[2-吡喃葡萄糖基 (1→3)-吡喃鼠李糖-6-吡喃鼠李糖]-β-D-吡喃半乳糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基 (1→3)]-4-O-(E-p-香豆)}-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-(4-O-乙酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→6)][α-L-吡喃鼠李糖 -(1→2)]}-β-D-3-反式-p-香豆酰基吡喃葡萄糖苷和细梗香草皂苷I
1.4、实验试剂
表2：实验的主要试剂：
二、实验方法
2.1、提取溶剂的选择
精密称取3份S1细梗香草药材2.5g，置圆底烧瓶中，分别精密加入甲醇、20％乙醇、70％乙醇溶液25ml，加热回流1h，放冷，再称定重量，分别用甲醇、20％乙醇、70％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。在相同检测方法的条件下分别测其指纹图谱，通过比较确定最佳的提取溶剂；如图1、图2和图3所示，提取剂为20％乙醇的细梗香草谱图峰尖较高，提取效率最高，所以选20％乙醇溶液作为制备细梗香草供试品的提取溶剂。
2.2、提取方式的选择
精密称取2份S1细梗香草药材2.5g，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，超声处理、加热回流1h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液供试品溶液。在相同检测方法的条件下分别测其指纹图谱，通过比较确定最佳的提取方式；如图4和图5所示，在其他条件相同的情况下，加热回流所得供试品的谱图峰尖较高，基线较平且分离效果较好。所以选加热回流作为细梗香草药材的提取方法。
2.3、提取时间的选择
精密称取3份S1细梗香草药材2.5g，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，加热回流0.5h、1h、2h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液供试品溶液。在相同检测方法的条件下分别测其指纹图谱，通过比较确定最佳的提取时间；如图6、图7和图8所示，在其他条件相同的情况下，提取1h所得供试品的谱图峰尖较高，基线较平且分离效果较好。所以选提取1h作为细梗香草药材的提取时间。
2.4、检测波长的选择
取相同条件下用S1号细梗香草药材制备的供试品溶液，精密吸取该溶液10μL，注入高效液相色谱仪，查看190～400nm波长范围内的3D光谱图，结果大部分化合物在254nm波长附近有最大吸收，且该峰分离效果较好，故确定检测波长为254nm。
以下为细梗香草药材指纹图谱的建立方法：
(1)参照物溶液的制备
取槲皮素-3-O-(2”,6”-二-O-α-吡喃鼠李糖基)-β-半乳糖苷，山奈酚-3-O-[2-吡喃葡萄糖基 (1→3)-吡喃鼠李糖-6-吡喃鼠李糖]-β-D-吡喃半乳糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基 (1→3)]-4-O-(E-p-香豆)}-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-(4-O-乙酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→6)][α-L-吡喃鼠李糖 -(1→2)]}-β-D-3-反式-p-香豆酰基吡喃葡萄糖苷和细梗香草皂苷I对照品适量，加甲醇制每毫升分别含34.55μg、44.52μg、38.52μg、40.63μg、40.40μg的混合参照物溶液，如图9。
(2)供试溶液的制备
取干燥的细梗香草全草药材适量，打粉，过3号筛，混匀，取约2.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，加热回流1h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(3)高效液相色谱检测方法
分别取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行检测，记录90min内的指纹图谱：
其中，指纹色谱条件为：
采用YMC-Pack ODS-A色谱柱，4.6×150mm，5μm，流动相：乙腈-0.3％磷酸系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→90min，乙腈10％→15％→20％；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；分析时间：90min。在此条件下分析供试样品，得到细梗香草药材的指纹图谱，如图10。
按照上述方法，对12批次细梗香草药材建立了HPLC指纹图谱，如图11和图12所示，图11中所标的序号为样品1到样品12，通过分析比较，确定了12个共有指纹峰，3号峰的出峰位置比较稳定，且峰面积较大，所以以3号色谱峰的保留时间和峰面积为参照值，计算其它各峰的相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间的RSD小于5.0％，结果如表3和表 4：
表3细梗香草HPLC指纹图谱共有特征指纹峰的相对保留时间：
表4细梗香草HPLC指纹图谱共有特征指纹峰的相对峰面积：
| 编号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | S11 | S12 | 均值 | RSD |
| 峰1 | 0.672 | 0.852 | 0.776 | 0.671 | 0.658 | 0.679 | 0.442 | 0.409 | 0.735 | 0.764 | 0.710 | 0.745 | 0.676 | 0.192 |
| 峰2 | 0.369 | 0.422 | 0.451 | 0.468 | 0.445 | 0.457 | 0.761 | 0.712 | 0.370 | 0.495 | 0.464 | 0.509 | 0.493 | 0.246 |
| 峰3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.000 |
| 峰4 | 0.170 | 0.169 | 0.134 | 0.173 | 0.181 | 0.184 | 0.189 | 0.185 | 0.154 | 0.082 | 0.190 | 0.031 | 0.154 | 0.320 |
| 峰5 | 0.350 | 0.311 | 0.242 | 0.295 | 0.290 | 0.291 | 0.281 | 0.294 | 0.322 | 0.157 | 0.277 | 0.065 | 0.265 | 0.297 |
| 峰6 | 0.457 | 0.393 | 0.376 | 0.392 | 0.391 | 0.398 | 0.153 | 0.183 | 0.402 | 0.386 | 0.413 | 0.374 | 0.360 | 0.257 |
| 峰7 | 0.260 | 0.226 | 0.225 | 0.205 | 0.207 | 0.213 | 0.082 | 0.089 | 0.205 | 0.202 | 0.217 | 0.225 | 0.196 | 0.276 |
| 峰8 | 0.092 | 0.117 | 0.098 | 0.110 | 0.122 | 0.122 | 0.147 | 0.142 | 0.106 | 0.070 | 0.120 | 0.074 | 0.110 | 0.216 |
| 峰9 | 0.246 | 0.307 | 0.254 | 0.318 | 0.325 | 0.328 | 0.365 | 0.351 | 0.322 | 0.204 | 0.470 | 0.128 | 0.301 | 0.286 |
| 峰10 | 0.607 | 0.536 | 0.415 | 0.496 | 0.480 | 0.490 | 0.582 | 0.614 | 0.512 | 0.239 | 0.506 | 0.145 | 0.468 | 0.304 |
| 峰11 | 0.346 | 0.365 | 0.376 | 0.365 | 0.392 | 0.379 | 0.180 | 0.171 | 0.373 | 0.383 | 0.362 | 0.364 | 0.338 | 0.228 |
| 峰12 | 0.709 | 0.746 | 0.759 | 0.754 | 0.764 | 0.764 | 0.328 | 0.323 | 0.741 | 0.777 | 0.765 | 0.814 | 0.687 | 0.248 |
由表3和表4可见，各批供试品指纹图谱的重现性较好，但各批样品间共有指纹峰的相对峰面积有一定差异。
经实验得到12批细梗香草药材的指纹图谱，将12批细梗香草药材样品指纹图谱的AIA 格式数据文件导入中药指纹图谱相似度评价系统研究版(2014A版)，进行相似度计算，因3 号峰在各样品中均存在，分离度好，故选取3号峰为参照峰(S)，采用中位数法，时间窗宽度为0.1min，采用多点校正匹配，获得细梗香草对照指纹图谱，见图11，计算机辅助相似度评价报告结果见表5。12批细梗香草药材的指纹图谱指纹图谱见图12。
表5 12批细梗香草相似度计算结果
细梗香草药材总体相似度较高，提示药材质量相对稳定。只有S12很低，这可能是采收时间因素所造成的，细梗香草是江西特色药材，花期为6-7月，果期为8-10月，S12采收时间较晚，提示药材采收时间对成分影响较大。
因此，通过构建HPLC指纹图谱及解谱分析，可以从细梗香草药理作用的物质基础出发，有效评价细梗香草药材的质量状况，达到监控细梗香草药材的质量及鉴别真伪的目的。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明确立了细梗香草药材指纹图谱的建立方法，通过该方法可获得细梗香草药材的标准指纹图谱，比较指纹图谱中共有峰的缺失，能有效地鉴别细梗香草药材的真伪及产地、采收时间，用于反映细梗香草质量的优劣，并且通过指纹图谱主要特征峰的相对稳定能够有效控制中药的质量，确保产品的相对稳定；完善了细梗香草药材的质量评价体系，为细梗香草药材质量的系统、有效控制提供了理论和实践基础。
附图说明
图1为细梗香草药材提取剂为甲醇溶液的谱图。
图2为细梗香草药材提取剂为20％乙醇溶液的谱图。
图3为细梗香草药材提取剂为70％乙醇溶液的谱图。
图4为细梗香草药材超声条件下的谱图。
图5为细梗香草药材回流条件下的谱图。
图6为细梗香草药材处理0.5h的谱图。
图7为细梗香草药材处理1.0h的谱图。
图8为细梗香草药材处理2.0h的谱图。
图9为参照物溶液的图谱。
图10为本细梗香草药材HPLC指纹图谱。
图11为12批次细梗香草药材对照指纹图谱。
图12为12批次细梗香草药材原始指纹图谱。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步详述：
实施例1
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长25cm，内径为4.6 mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.3％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。
参照物溶液的制备
精密量取细梗香草对照品槲皮素-3-O-(2”,6”-二-O-α-吡喃鼠李糖基)-β-半乳糖苷，山奈酚 -3-O-[2-吡喃葡萄糖基(1→3)-吡喃鼠李糖-6-吡喃鼠李糖]-β-D-吡喃半乳糖苷，山奈酚 -3-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)]-4-O-(E-p-香豆)}-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷 -7-O-(4-O-乙酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖 (1→6)][α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)]}-β-D-3-反式-p-香豆酰基吡喃葡萄糖苷和细梗香草皂苷I适量，分别加甲醇制成34.55μg/ml、44.52μg/ml、38.52μg/ml、40.63μg/ml、40.40μg/ml的对照品溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备
取江西本真药业有限责任公司批号为20170512的样品，适量，打粉，过3号筛，混匀，取约2.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，加热回流1h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。
将得到的供试品色谱图，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2014A版相似度软件和标准对照指纹图谱进行相似度评价，计算得相似度为0.99。
Claims (4)
1.一种细梗香草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)参照物溶液的制备，取槲皮素-3-O-(2”,6”-二-O-α-吡喃鼠李糖基)-β-半乳糖苷，山奈酚-3-O-[2-吡喃葡萄糖基(1→3)-吡喃鼠李糖-6-吡喃鼠李糖]-β-D-吡喃半乳糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)]-4-O-(E-p-香豆)}-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-(4-O-乙酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷，山奈酚-3-O-{[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→6)][α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)]}-β-D-3-反式-p-香豆酰基吡喃葡萄糖苷和细梗香草皂苷I对照品，适量，加甲醇溶解配制成参照物溶液；
(2)供试溶液的制备，取干燥的细梗香草全草药材适量，打粉，过3号筛，混匀，取约2.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，加热回流1h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(3)指纹图谱的制备，分别取参照物溶液和由不同批次细梗香草药材制备得到的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录90min内的指纹图谱：
其中，色谱条件为：
采用YMC-Pack ODS-A色谱柱，4.6×150mm，5μm，流动相：乙腈-0.3％磷酸系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→90min，乙腈10％→15％→20％；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；分析时间：90min。
2.一种细梗香草全草药材检测方法，所述方法，步骤如下：
(1)供试溶液的制备，取干燥的细梗香草全草药材适量，打粉，过3号筛，混匀，取2.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入20％乙醇溶液25ml，加热回流1h，放冷，再称定重量，用20％乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)检测，取细梗香草药材制备得到的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录90min内的指纹图谱：将所得的高效液相色图谱，和标准对照指纹图谱，进行对照，符合一致为合格产品；
其中，色谱条件为：
采用YMC-Pack ODS-A色谱柱，4.6×150mm，5μm，流动相：乙腈-0.3％磷酸系统；采用梯度洗脱方式：0min→10min→90min，乙腈10％→15％→20％；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；分析时间：90min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述符合一致要求在90％以上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述符合一致要求在95％以上。
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