CN110954614B - 复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱及其构建方法与应用 - Google Patents

复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药质控检测领域，具体提供了一种复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱及其构建方法与应用，包括供试品溶液的制备、色谱条件的选择、测定步骤以得到复方威麦宁HPLC指纹图谱。本发明的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱构建方法，供试品溶液制备简便、提取率高、色谱条件容易实现，得到的复方威麦宁指纹图谱能够全面、系统、特征性地反应复方威麦宁中的组成成分，可全面有效地评价复方威麦宁的质量及真伪，实现了产品质量监控。

Description

复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及中药质控检测领域，具体涉及一种复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱及其构建方法与应用。
背景技术
复方威麦宁在医院临床上应用多年，用于咳嗽，慢性支气管炎，肺脓疡，肺癌等上述症候证者。配合放、化疗治疗肿瘤有增效减毒作用；单独使用可用于不适合放、化疗的肺癌患者的治疗。其主要处方为金荞麦、绞股蓝、岩白菜素，该方中金荞麦具有清热解毒，排脓祛瘀之功效，主治肺痈吐脓，肺热喘咳，乳蛾肿痛，为主药。绞股蓝、岩白菜素为辅药，祛邪扶正、清热解毒、活血化瘀、消瘀散结、镇咳祛痰之功效，具有广阔的开发前景及市场需求。
但中药复方制剂，所含成分较为复杂，有效成分就更难于确定。现有技术中对复方威麦宁的质量评价研究尚不充分，难以全面反映药品质量。而质量标准的缺失进一步制约着复方威麦宁的产业化发展，也使得该优秀的现代中药难以实现全球化发展道路。
中药指纹图谱技术是评价中药优劣、鉴别真伪、区分物种和确保其一致性和稳定性的有效方法，且已得到国际上广泛的认可。因此，本发明提供了一种复方威麦宁高效液相色谱(HPLC)标准指纹图谱及其构建方法来解决现有技术中的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以全面、综合反映复方威麦宁质量及真伪的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱及其构建方法。
本发明的另一目的在于提供复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱在复方威麦宁质量检测及真伪辨别中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明的一种复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取复方威麦宁胶囊中粉末溶解于水中，水浴加热后冷却、滤过得滤液，所述滤液用乙醚萃取(优选，以等体积乙醚萃取)，收集水液得第一水液；所述第一水液用醋酸乙酯萃取(优选，以等体积醋酸乙酯萃取)，收集水液得第二水液，蒸干完成萃取后的醋酸乙酯得第一残渣；
将所述第一残渣溶解于(优选，5ml～10ml)水中得第一残渣水溶液，将所述第一残渣水溶液通过大孔吸附树脂柱，先以水洗脱，再用浓度为50％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干得第三残渣；将所述第三残渣溶解于乙腈-水溶液中(优选，定容至10ml)，过滤，取续滤液作为供试品一(用于检测金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱)，所述乙腈-水溶液中乙腈与水的体积比为1：9；
所述第二水液用水饱和的正丁醇萃取(优选，以等体积水饱和的正丁醇萃取)，蒸干完成萃取后的水饱和的正丁醇得第二残渣；将所述第二残渣溶解于乙腈-水溶液中(优选，定容至10ml)，过滤，取续滤液作为供试品二(用于检测绞股蓝总皂苷部分指纹图谱)，所述乙腈-水溶液中乙腈与水的体积比为1：9；
(2)采用高效液相色谱仪分别检测所述供试品一及所述供试品二，得到复方威麦宁指纹图谱。
优选的，将所述复方威麦宁胶囊中粉末溶解于水中时，所述复方威麦宁胶囊中粉末与所述水的固液比为1：(75-90)g/ml，更优选为1:83。
优选的，所述滤液用所述乙醚萃取2～4次(优选，3次)；所述第一水液用所述醋酸乙酯萃取3～5次(优选，4次)，所述第一残渣为合并各次完成萃取后的所述醋酸乙酯蒸干制得。
优选的，所述第一残渣水溶液先以120ml所述水洗脱再以70ml所述乙醇洗脱。
优选的，所述第二水液用所述水饱和的正丁醇萃取3～5次(优选，4次)，所述第二残渣为合并各次完成萃取后的所述水饱和的正丁醇蒸干制得。
优选的，检测所述供试品一的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：以体积比为92：8的用磷酸调pH值至3.00±0.02的水-乙腈洗脱；和/或，流速0.8ml·min-1；检测波长280nm；柱温35℃。
优选的，检测所述供试品二的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：以体积比为33：67的水-乙腈洗脱；和/或，流速1.0ml·min-1；检测波长203nm；柱温40℃。
优选的，检测所述供试品一与所述供试品二时的进样量为20μl。
优选的，所述大孔吸附树脂柱为
Figure BDA0002307241000000031
优选的，采用微孔滤膜对所述第二残渣及所述第三残渣进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
本发明还提供一种复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱，其为根据上述方法构建而得。
本发明另提供一种复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱在复方威麦宁质量检测及真伪辨别中的应用。
本发明的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱及其构建方法与应用至少具有如下优点及有益效果：
(1)供试品溶液制备简便、提取率高。在绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究供试品提取时，供试品以金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究的供试品制备过程中经醋酸乙酯萃取后的水溶液为基础，继用水饱和的正丁醇萃取，使得制备供试品较为方便，且供试品经乙醚脱脂和醋酸乙酯萃取后，对绞股蓝总皂苷具有纯化的作用，提取率高。
(2)色谱条件容易实现，得到的复方威麦宁指纹图谱通过表征金荞麦、岩白菜素、绞股蓝这三个主要成分，能够全面、系统、特征性地反应复方威麦宁中的组成成分，可全面有效地评价复方威麦宁的质量与真伪，实现了产品质量监控；
(3)该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。
附图说明
图1为表儿茶素对照品HPLC图谱；
图2为原花青素B2对照品HPLC图谱；
图3为金荞麦药材HPLC图谱；
图4为10批金荞麦药材HPLC图谱；
图5为岩白菜素对照品HPLC图谱；
图6为岩白菜素HPLC图谱；
图7为10批岩白菜素HPLC图谱；
图8为人参皂苷Rb1对照品HPLC图谱；
图9为人参皂苷Rd对照品HPLC图谱；
图10为绞股蓝药材HPLC图谱；
图11为10批绞股蓝药材HPLC图谱；
图12为复方威麦宁胶囊样品中金荞麦与岩白菜素部分HPLC指纹图谱；
图13为10批复方威麦宁胶囊样品中金荞麦与岩白菜素部分HPLC指纹图谱；
图14为复方威麦宁胶囊样品中绞股蓝总皂苷部分HPLC指纹图谱；
图15为10批复方威麦宁胶囊样品中绞股蓝总皂苷部分HPLC指纹图谱。
其中，本发明附图中纵坐标Norm.代表归一化法来计算峰面积，mAU代表吸光度单位，本发明中所计算的峰面积均采用归一化法来计算。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1.实验材料
1.1实验药材
金荞麦药材(10批批号：20160611、20160705、20160804、20160901、20161012、20161013、20170109、20170225、20170404、20170721)、绞股蓝药材(10批批号：20160512、20160816、20160817、20180820、20170701、20170901、20170612、20180915、20180702、20181101)及复方威麦宁胶囊(10批批号：20170408、20170409、20170410、20170829、20170830、20170831、20171009、20180119、20180120、20180121)均由曲靖市第一人民医院提供，岩白菜素(10批批号：20160402、20160501、20160913、20161225、20170221、20170412、20170601、20170709、20171119、20171230)由云南玉溪万方药业有限公司提供。金荞麦药材由曲靖市食品药品检验检测中心中药室何继祥主任药师鉴定为蓼科植物金荞麦F.dibotrys(D.don)HaraD的根茎。表儿茶素对照品(批号878-200001)、岩白菜素对照品(批号1532-200202)均购自中国药品生物制品检定所；原花青素B2对照品购自天津尖峰天然产物公司(批号253-050302)；人参皂苷Rb1对照品(批号1130-050102)、人参皂苷Rd对照品(批号1134-050317)均购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。
1.2实验仪器
Agilent-1100型高效液相色谱仪，TU-1800型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，Delta 320-S pH计(梅特勒-托利多)，AE-100型电子天平(梅特勒-托利多)。
2.实验方法
2.1供试品提取方法的考察
2.1.1金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究的供试品提取方法的考察，结果见表1。
方法一：取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g加水50ml，水浴加热30min后冷却、滤过得滤液，滤液用等体积乙醚萃取，收集水液；水液用等体积醋酸乙酯萃取，收集醋酸乙酯液，蒸干，残渣加10ml水使溶解，水溶液通过大孔吸附树脂柱，先以水120ml洗脱，再用浓度为50％的乙醇70ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加乙腈-水(1：9)溶液使溶解并定容至10ml，过滤，取续滤液，按上述优选供试品一的检测条件测定，记录色谱图，计算表儿茶素和岩白菜素含量。
方法二：取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g加水50ml，超声处理1h、滤过得滤液，滤液用等体积乙醚萃取，收集水液；水液用等体积醋酸乙酯萃取，收集醋酸乙酯液，蒸干，残渣加10ml水使溶解，水溶液通过大孔吸附树脂柱，先以水50ml洗脱，再用浓度为50％的乙醇50ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加乙腈-水(1：9)溶液使溶解并定容至10ml，过滤，取续滤液，按上述优选供试品一的检测条件测定，记录色谱图，计算表儿茶素和岩白菜素含量。
方法三：取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g，精密加入50％乙醇50ml，水浴加热回流1h，放冷，滤过得滤液，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣加乙腈-水(1：9)溶液使溶解并定容至10ml，过滤，取续滤液，按上述优选供试品一的检测条件测定，记录色谱图，计算表儿茶素和岩白菜素含量。
方法四：取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g，精密加入50％乙醇50ml，超声处理1h，放冷，滤过得滤液，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣加乙腈-水(1：9)溶液使溶解并定容至10ml，过滤，取续滤液，按上述优选供试品一的检测条件测定，记录色谱图，计算表儿茶素和岩白菜素含量。
表1不同金荞麦和岩白菜提取方法的表儿茶素和岩白菜素含量
Figure BDA0002307241000000071
经考察，供试品以方法一进行提取效果最好。
2.1.2绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究供试品提取方法的考察，结果见表2。
方法一：取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g加水50ml，水浴加热30min后冷却、滤过得滤液，所述滤液用等体积乙醚萃取，收集水液，水液用等体积醋酸乙酯萃取，收集水液，水液用等体积的水饱和的正丁醇萃取，收集正丁醇液，蒸干，残渣加乙腈-水(1：9)溶液使溶解并定容至10ml，过滤，取续滤液，按上述优选供试品二的检测条件测定，记录色谱图，计算人参皂苷Rb1含量。
方法二：取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g加水50ml，水浴加热后冷却、滤过得滤液，所述滤液用等体积水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇液，蒸干，残渣加乙腈-水(1：9)溶液使溶解并定容至10ml，过滤，取续滤液，按上述优选供试品二的检测条件测定，记录色谱图，计算人参皂苷Rb1含量。
方法三：取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g加水饱和正丁醇50ml，超声处理45min，冷却、滤过得滤液，蒸干，残渣加乙腈-水(1：9)溶液使溶解并定容至10ml，过滤，取续滤液，按上述优选供试品二的检测条件测定，记录色谱图，计算人参皂苷Rb1含量。
表2不同提取方法的人参皂苷Rb1含量
提取方法 样品取样量(g) 人参皂苷Rb<sub>1</sub>含量(mg/g)
方法一 0.6001 0.18
方法二 0.6008 0.03
方法三 0.6003 0.06
经考察，供试品以金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究的供试品制备过程中经醋酸乙酯萃取后的水溶液为基础，继用水饱和的正丁醇萃取(方法一)，制备供试品较为方便，且供试品经乙醚脱脂和醋酸乙酯萃取后，对绞股蓝总皂苷具有纯化的作用，因此选择其作为制备绞股蓝总皂苷指纹图谱供试品的方法。
2.2供试品的制备
取复方威麦宁胶囊中粉末0.6g，精密称定，置锥形瓶中，加水50ml，水浴加热30min，放冷至室温，滤过，滤液用乙醚(1：1)萃取3次，弃去乙醚液；水液用醋酸乙酯(1：1)萃取4次，合并醋酸乙酯液蒸干，备用；水液继用水饱和的正丁醇(1：1)萃取4次，合并正丁醇液蒸干，备用。将醋酸乙酯液蒸干后的残渣加水5ml～10ml使溶解，通过LSA-10大孔吸附树脂柱(
Figure BDA0002307241000000081
湿法装柱)，以水120ml洗脱，弃去水液，再用50％乙醇70ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干。将乙醇洗脱液和水饱和的正丁醇萃取液蒸干后的残渣分别用乙腈-水(1：9)溶液溶解并转移至10ml量瓶中，加乙腈-水(1：9)溶液至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即可。过大孔树脂柱的样品作为检测金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱的供试品(供试品一)；水饱和的正丁醇萃取的样品作为检测绞股蓝总皂苷部分指纹图谱的供试品(供试品二)。
对照品溶液的制备
(2)对照品溶液的制备：
精密称取表儿茶素、原花青素B2、岩白菜素、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd对照品各1.0mg，分别置5ml容量瓶中，用体积比为1：9的乙腈-水溶液溶解稀释至刻度，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。
2.3指纹图谱测定波长的认定
取原花青素B2对照品的乙腈-水(1：9)溶液，经TU-1800型紫外-可见分光光度计在200～400nm波长进行光谱扫描，结果均在280.0nm波长处有最大吸收。在280nm检测波长下，复方威麦宁HPLC图谱中均有多个色谱峰，且峰形较好，因此选定280nm为制作复方威麦宁胶囊指纹图谱中金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱分析方法的测定波长。
取人参皂苷Rb1对照品的乙腈-水(1：9)溶液，经TU-1800型紫外-可见分光光度计在200～400nm波长进行光谱扫描，结果均在203.0nm波长处有最大吸收。在203nm检测波长下，复方威麦宁HPLC图谱中均有多个色谱峰，且峰形较好，因此选定203nm为制作复方威麦宁胶囊指纹图谱中绞股蓝总皂苷部分指纹图谱分析方法的测定波长。
2.4流动相的选择
2.4.1金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究流动相的选择
试验中共选择了5种流动相系统：
①乙腈-0.01％醋酸水(8：92)；
②乙腈-水(用磷酸调至不同的pH值)(1：9，9：91，8：92)；
③乙腈-甲醇-水(用磷酸调至不同的pH值)(1：1：8)；
④乙腈-四氢呋喃-水(7.8：0.2：92)；
⑤甲醇-水(70：30，60：40，50：50，30：70，10：90)。
结果表明，各种流动相系统中以乙腈-水(用磷酸调pH值至3.00±0.02)(8：92)系统为最佳，图谱中各个色谱峰(280nm)的分离度较好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为实验的流动相。
2.4.2绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究流动相的选择
试验中共选择了5种流动相系统：
①乙腈-水(30：70，33：67)；
②乙腈-水(用磷酸调pH值至3.00±0.02)(梯度洗脱)；
③乙腈-水(梯度洗脱)；
④乙腈-水(用磷酸调pH值至3.00±0.02)(8：92)；
⑤甲醇-乙腈(30：70)；
⑥乙腈-甲醇-0.2％磷酸(35.5：4.5：60)
其中流动相系统②、③梯度洗脱条件见表3所示：
表3流动相梯度洗脱条件
时间(min) 流动相A(％)：乙腈 流动相B(％)：水或磷酸水溶液
0～15 25 75
15～20 25～40 75～60
20～32 40～50 60～50
32～40 50～85 50～15
40～60 85～90 15～10
考察数据见表4-表5：
表4流动相筛选数据(流速：0.8ml/min，柱温：30℃)
Figure BDA0002307241000000101
Figure BDA0002307241000000111
表5流动相筛选数据(流速：1.0ml/min，柱温：30℃)
Figure BDA0002307241000000112
进一步以乙腈-水(33：67)为流动相，流速：1.0ml/min，波长203nm，柱温40℃为色谱条件，考察此方法的重复性、精密度、稳定性。
将6批次复方威麦宁胶囊(批号：20170829、20170830、20170831、20180119、20180120、20180121)按2.2供试品制备方法制得6份供试品二用于重复性试验。
重复性试验：按上述色谱条件对上述6份供试品二进行测定，测定结果以人参皂苷Rb1计，结果如下，见表6：
表6
Figure BDA0002307241000000113
精密度试验：取上述复方威麦宁胶囊(批号：20180120)制备的供试品二，同一色谱条件连续进样6次进行测定，测定结果以人参皂苷Rb1计，结果如下，见表7：
表7
Figure BDA0002307241000000121
稳定性试验：取上述复方威麦宁胶囊(批号：20180120)制备的供试品二，同一色谱条件进行测定，测定结果以人参皂苷Rb1计，结果如下，见表8：
表8
Figure BDA0002307241000000122
由上述表4-8的结果可知，各种流动相系统中以乙腈-水(33：67)系统，流速：1.0ml/min为最佳，图谱中各个色谱峰(203nm)的分离度较好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为复方威麦宁胶囊HPLC指纹图谱中绞股蓝总皂苷指纹图谱检测的流动相。
2.4.3其他色谱条件的优化
采用VWD检测器，比较25℃、30℃、35℃、40℃4种柱温，0.8ml/min和1.0ml/min不同流速下的色谱峰的形状、大小和分离情况。
利用供试品的参照峰峰型、分离度、对称因子考察柱温。
2.4.3.1金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究其他色谱条件的选择
色谱条件：检测波长280nm、流速1.0ml/min时，测定结果如下，见表9：
表9
Figure BDA0002307241000000131
色谱条件：检测波长280nm、流速0.8ml/min时，测定结果如下，见表10：
表10
Figure BDA0002307241000000132
由上述表9-10结果可知，以检测波长280nm、35℃柱温、0.8ml/min流速的色谱条件下色谱峰数目较多，各色谱峰之间分离度良好，稳定性较好，所以选择为金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱检测的色谱条件。
2.4.3.2绞股蓝总皂苷色谱条件优化：
根据上述流动相考察结果，以流动相：乙腈-水(33:67)，流速：1.0ml/min，检测波长203nm考察最优柱温。柱温筛选数据如下，见表11：
表11
Figure BDA0002307241000000133
由表11可知，最终柱温：40℃效果最好。
综上所述，绞股蓝总皂苷在检测波长为203nm、40℃柱温、1.0ml/min流速的色谱条件下效果较理想，因此选择其作为绞股蓝总皂苷部分指纹图谱检测的色谱条件。
2.5色谱条件及色谱适应性试验
2.5.1复方威麦宁胶囊HPLC指纹图谱中金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究的色谱条件及色谱适应性试验
色谱柱：Zorbax XDB-Cl8预柱(4.6×12.5mm)，Zorbax Eclipse XDB-Cl8色谱柱(5um，4.6mm×150mm)；流动相：水(用磷酸调pH值至3.00±0.02)-乙腈(92：8)；流速0.8ml·min-1；检测波长280nm；柱温35℃；进样量：供试品与对照品进样量各20μL，理论板数按原花青素B2峰计算应不低于4000。
2.5.2复方威麦宁胶囊HPLC指纹图谱中绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究色谱条件及色谱适应性试验
色谱柱：Zorbax XDB-Cl8预柱(4.6×12.5mm)，Zorbax Eclipse XDB-Cl8色谱柱(5um，4.6mm×150mm)；流动相：水-乙腈(33：67)；流速1.0ml·min-1；检测波长203nm；柱温40℃；进样量：供试品与对照品进样量各20μL，理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于3000。
3.实验结果
3.1指纹图谱的方法学考察
3.1.1稳定性试验(结果参见表12)
取以2.2部分记载的方法制备得到的复方威麦宁胶囊(批号：20180120)供试品一、供试品二按上述确定的各自色谱条件，在0、2、4、6、12、24小时6个时间点进行检测，分别以原花青素B2峰与人参皂苷Rb1峰为参照峰，对主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD<3.0％，表明供试品溶液在24h内稳定。
表12
Figure BDA0002307241000000141
Figure BDA0002307241000000151
3.1.2精密度试验(结果参见表13)
取以2.2部分记载的方法制备得到的复方威麦宁胶囊(批号：20180120)供试品一、供试品二按上述确定的各自色谱条件，连续进样6次，每次进样量20μl，分别以原花青素B2峰与人参皂苷Rb1峰为参照峰，对主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD<3.0％，表明精密度良好。
表13
Figure BDA0002307241000000152
3.1.3重复性实验(结果参见表14-1、表14-2)
取以2.2部分记载的方法制备得到的10批复方威麦宁胶囊(批号见1.1实验药材部分)供试品一、供试品二按上述确定的各自色谱条件测定，分别以原花青素B2峰与人参皂苷Rb1峰为参照峰，对主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，RSD<3.0％，表明该方法的重复性较好。
表14-1
Figure BDA0002307241000000153
表14-2
Figure BDA0002307241000000161
3.2相似度
测定各药材、原料对照品以及复方威麦宁胶囊的指纹图谱(n＝10)，为保证评价的一致性，均采取上述确定的各样品的测试方法进行测定。测试结果参见图1至图15。
通过对药材、原料对照品相似度的考察进一步确定了本发明所用药材的种类。
采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》2004版相似度软件对上述10批复方威麦宁制剂的指纹图谱进行相似度的分析。以相关系数(中位数)代表其相似度，10批复方威麦宁制剂的相似度结果见表15、表16。
表15金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究10批样品相似度评价结果
Figure BDA0002307241000000162
表16绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究10批样品相似度评价结果
Figure BDA0002307241000000163
Figure BDA0002307241000000171
通过表15-16的数据可知，此方法获得的各批样品相似度高。
通过以上指纹图谱的方法学和相似度考察表明：目前的方法适合复方威麦宁指纹图谱的建立与分析。
3.3指纹图谱建立及分析
3.3.1金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究共有指纹峰的标定(参见图1至图7、图12、图13)
取10批复方威麦宁胶囊样品，分别按上述确定的供试品的制备方法处理，在上述色谱条件下，测定其金荞麦与岩白菜素部分色谱图。其中，11号峰保留时间与原花青素B2峰保留时间一致(参见图12及图2，图12为对10批复方威麦宁胶囊样品中金荞麦与岩白菜素部分HPLC指纹图谱(参见图13)，使用《中药指纹图谱相似度计算软件》进行数据处理得到的复方威麦宁胶囊样品中金荞麦与岩白菜素部分HPLC指纹图谱)，作为参照峰。岩白菜素峰形较好，分离度好，可作为特征峰(参见图5及图3，图3为对10批金荞麦药材的HPLC图谱(参见图4)，使用《中药指纹图谱相似度计算软件》进行数据处理得到的金荞麦药材共有模式指纹图谱)，但复方威麦宁胶囊中以金荞麦为主，用为君药，而原花青素B2峰在金荞麦指纹图谱(见图3)中峰面积相对较大，分离度较好，且有已知的对照品，因此选择原花青素B2峰作为参考峰。
综合10批样品的色谱图，发现其中18个峰为10批样品所共有的(参见图13)，因此确定为共有指纹峰；经计算各色谱图中共有峰总面积占所有色谱峰面积的百分比在75％～95％之间。根据10批样品的平均值，以保留时间与原花青素B2峰一致的11号峰为参照峰，标定了18个共有指纹峰及其相对保留时间如下：1(0.124～0.126)，2(0.160～0.163)，3(0.198～0.202)，4(0.241～0.244)，5(0.286～0.289)，6(0.326～0.328)，7(0.350～0.353)，8(0.379～0.382)，9(0.462～0.464)，10(0.528～0.530)，11(0.579～0.581)，12(0.624～0.626)，13(0.703～0.706)，14(0.839～0.841)，15(0.992～0.994)，16(1.074～1.075)，17(1.295～1.297)，18(2.115～2.118)。
各共有峰的相对保留时间均在±1％之间。
3.3.2绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究共有指纹峰的标定(参见图8至图11、图14、图15)
取10批复方威麦宁胶囊样品，分别按上述确定的供试品的制备方法处理，在上述色谱条件下，测定其绞股蓝总皂苷部分色谱图。其中，S峰保留时间与人参皂苷Rb1峰保留时间一致(参见图14及图8，图14为对10批复方威麦宁胶囊样品中绞股蓝总皂苷部分HPLC指纹图谱(参见图15)，使用《中药指纹图谱相似度计算软件》进行数据处理得到的复方威麦宁胶囊样品中绞股蓝总皂苷部分HPLC指纹图谱)，峰面积较大，分离度相对较好，作为参照峰。综合10批样品的色谱图，发现其中9个峰为10批样品所共有的(参见图15)，因此确定为共有指纹峰；经计算各色谱图中共有峰总面积占所有色谱峰面积的百分比在75％～95％之间。根据10批样品的平均值，以保留时间与人参皂苷Rb1峰一致的S峰为参照峰，标定了9个共有指纹峰及其相对保留时间如下，见表17：
表17
Figure BDA0002307241000000181
各共有峰的相对保留时间均在±1％之间。
3.3.3共有指纹峰面积的比值
3.3.3.1金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究共有指纹峰面积的比值
以图谱中原花青素B2为参照峰，将各色谱峰峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积(见表18)。据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定，各共有指纹峰的面积比值必须相对固定：单峰峰面积占总峰面积≥20％，其差值＜20％；单峰峰面积占总峰面积≥10％，其差值＜25％；单峰峰面积占总峰面积＜20％，峰面积比值不作要求，仅需要标定相对保留时间。
3.3.3.2绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究共有指纹峰面积的比值
以图谱中人参皂苷Rb1为参照峰，将各色谱峰峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积(见表19)。
表18金荞麦与岩白菜素部分指纹图谱研究10批样品的相对峰面积
Figure BDA0002307241000000191
表19绞股蓝总皂苷部分指纹图谱研究10批样品的相对峰面积
Figure BDA0002307241000000201
3.3.3.3非共有峰面积比值
通过对10批复方威麦宁供试品的测定，统计非共有峰面积占总峰面积的百分比(见表20)，峰面积全部＜10％，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》。
表20复方威麦宁指纹图谱检测共有峰数据统计结果
Figure BDA0002307241000000202
3.3.3.4复方威麦宁指纹峰的归属鉴别
对结果按照保留顺序进行指纹匹配后，通过比较复方威麦宁、药材、原料图谱，可以将复方威麦宁中编码的指纹峰进行来源归属，图12中，7号峰为岩白菜素峰、11号峰为原花青素B2峰、13号峰为表儿茶素峰，其余15个峰均来源于金荞麦提取物，绞股蓝总皂苷在此色谱条件下不出峰；绞股蓝总皂苷部分指纹图谱中(图14)：S峰为人参皂苷Rb1峰，来源于复方中的绞股蓝总皂苷。
4.结论
本实验应用HPLC色谱法，建立了复方威麦宁胶囊的指纹图谱研究方法，重点研究了指纹图谱本身对复方成分的显示程度，以及分析仪器对分析样品的选择性和图谱显示的信息包容情况；试验结果表明：不同批次复方威麦宁胶囊指纹图谱中的主要峰群的整体图貌基本一致；实验建立的方法稳定、可靠，可操作性强，重复性好，符合指纹图谱检测要求，为复方威麦宁胶囊质量的分析与控制提供了可靠的依据。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：
取复方威麦宁胶囊中粉末溶解于水中，水浴加热后冷却、滤过得滤液，所述滤液用乙醚萃取，收集水液得第一水液；所述第一水液用醋酸乙酯萃取，收集水液得第二水液，蒸干完成萃取后的醋酸乙酯得第一残渣；
将所述第一残渣溶解于水中得第一残渣水溶液，将所述第一残渣水溶液通过大孔吸附树脂柱，先以水洗脱，再用浓度为50%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干得第三残渣；将所述第三残渣溶解于乙腈-水溶液中，过滤，取续滤液作为供试品一，所述乙腈-水溶液中乙腈与水的体积比为1：9；
所述第二水液用水饱和的正丁醇萃取，蒸干完成萃取后的水饱和的正丁醇得第二残渣；将所述第二残渣溶解于乙腈-水溶液中，过滤，取续滤液作为供试品二，所述乙腈-水溶液中乙腈与水的体积比为1：9；
（2）采用高效液相色谱仪分别检测所述供试品一及所述供试品二，得到复方威麦宁指纹图谱；
检测所述供试品一的色谱条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：以体积比为92：8的用磷酸调pH值至3.00±0.02的水-乙腈洗脱；流速0.8ml•min-1；检测波长280 nm；柱温35℃；
检测所述供试品二的色谱条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：以体积比为33：67的水-乙腈洗脱；流速1.0ml•min-1；检测波长203nm；柱温40℃。
2.根据权利要求1所述的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，将所述复方威麦宁胶囊中粉末溶解于水中时，所述复方威麦宁胶囊中粉末与所述水的固液比为1：（75-90）g/ml。
3.根据权利要求1或2所述的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述滤液用所述乙醚萃取2~4次；所述第一水液用所述醋酸乙酯萃取3~5次，所述第一残渣为合并各次完成萃取后的所述醋酸乙酯蒸干制得。
4.根据权利要求1或2所述的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述第二水液用所述水饱和的正丁醇萃取3~5次，所述第二残渣为合并各次完成萃取后的所述水饱和的正丁醇蒸干制得。
5.根据权利要求3所述的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述第二水液用所述水饱和的正丁醇萃取3~5次，所述第二残渣为合并各次完成萃取后的所述水饱和的正丁醇蒸干制得。
6.根据权利要求1所述的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱为φ1×15cm。
7.根据权利要求1所述的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，采用微孔滤膜对所述第二残渣及所述第三残渣进行过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
8.根据权利要求1-7之一所述的方法构建而得的复方威麦宁高效液相色谱标准指纹图谱在复方威麦宁质量检测及真伪辨别中的应用。
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