CN112666268A - 一种中药组合物中多种成分鉴别及含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中药组合物中多种成分鉴别及含量的测定方法，该中药组合物由下列重量份数的原料药制成：麻黄52‑86；石膏194‑324；连翘194‑324；黄芩78‑130；桑白皮194‑324；炒苦杏仁78‑130；前胡78‑130；半夏78‑130；陈皮78‑130；浙贝母78‑130；牛蒡子78‑130；山银花78‑130；大黄39‑65；桔梗46‑76；甘草39‑65，具有高灵敏度，可以有效快速的全面控制该中药组合物的质量。

Description

一种中药组合物中多种成分鉴别及含量的测定方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体的涉及中药成分的鉴别及含量测定方法。

背景技术

该中药组合物是由麻黄、石膏、连翘、黄芩、桑白皮、炒苦杏仁、前胡、半夏等组成；各药合用，肺中痰热得清，肺气郁闭得开，宣降功能正常，则痰咳消失。实验研究表明，该中药组合物从止咳、祛痰、平喘、抗炎等不同角度证实，对治疗支气管炎，特别是急性气管-支气管炎有显著的疗效。

有报道采用薄层色谱法以及高效液相色谱法可以测定麻黄、连翘、陈皮等药材的活性成分。但对于该中药复方制剂，目前只公开了其药物组成成分和制备方法，并无文献或报道披露该中药组合物中多种成分的鉴别及含量测定方法。该药物组合物中包含有几十种甚至几百种生物活性成分，对于一个上市药物，如何全面控制该中药组合物的质量，保证人民用药安全，是目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种中药组合物多种成分的鉴别以及含量测定方法。具有高灵敏度，可以有效快速的全面控制该中药组合物的质量。

本发明所采用的技术方案是：

一种中药组合物中多种成分鉴别及含量的测定方法，该中药组合物由下列重量份数的原料药制成：麻黄52-86；石膏194-324；连翘194-324；黄芩78-130；桑白皮194-324；炒苦杏仁78-130；前胡78-130；半夏78-130；陈皮78-130；浙贝母78-130；牛蒡子78-130；山银花78-130 ；大黄39-65；桔梗46-76；甘草39-65，该中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法包括：

浙贝母的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量15-20g的组合物，加浓氨试液与三氯甲烷，超声处理，蒸干溶液，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

连翘的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量5-10g的组合物，加甲醇超声处理，溶液蒸干，残渣加甲醇溶解，置中性氧化铝柱上，用80%甲醇洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材0.5-1.5g，加甲醇超声处理后滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

牛蒡子鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量5-10g的组合物，加甲醇超声处理，溶液蒸干，残渣加甲醇溶解，置中性氧化铝柱上，用80%甲醇洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5g，加甲醇超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取两种溶液各1-8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

大黄鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量15-20g的组合物，加甲醇超声处理，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2-0.8g，加甲醇超声处理，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

甘草鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量5-10g的组合物，加甲醇超声处理，溶液蒸干，残渣加甲醇溶解，置中性氧化铝柱上，用80%甲醇洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；取甘草对照药材1g，加甲醇超声处理，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～8μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

取相当于该中药组合物生药量30-40g的组合物，加入甲醇超声处理过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，上述三种溶液各2-8μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

该药物组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量1-3g的组合物，加入甲醇50ml，超声处理后滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1-5ml，摇匀，用乙醚振摇提取，乙醚溶液加配比为1：10盐酸-甲醇溶液混匀，蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加比例为5：95的乙腈-0.1%磷酸溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为比例为5：95的乙腈-0.1%磷酸溶液，检测波长207nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液5-10μL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液5-10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

该药物组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量0.5-2g的组合物，加入甲醇50ml，超声处理，滤过，取续滤液25ml，蒸干，残渣用水溶解，上聚酰胺柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加22%乙腈--78%0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长283nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10-15μL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液10-20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

优选的，该中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法为：

浙贝母的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量18-20g的组合物，加浓氨试液2ml与三氯甲烷20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为17：2：1乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

连翘的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量8-10g的组合物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4～6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

牛蒡子鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量8-10g的组合物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4～6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

大黄鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量18-20g的组合物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理10分钟，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为15：5：1的30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

甘草鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量8-10g的组合物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取甘草对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各4～6μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以比例为6：1的三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

取相当于该中药组合物生药量1-3g的组合物，加入甲醇50ml超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取盐酸麻黄碱含量测定项下备用的甲醇滤液2～3μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以新配制的比例为8：1：1：1的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

该药物组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量30-40g的组合物，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液15ml溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1ml，摇匀，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加比例为1：10的盐酸-甲醇溶液1ml混匀，水浴蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加比例为5：95乙腈-0.1%磷酸溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为比例5：95的乙腈-0.1%磷酸溶液，检测波长207nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液5-10μL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液5-10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

该药物组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量30-40g的组合物，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水10ml溶解，上聚酰胺柱，60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加比例为22：78的乙腈--0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60%的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长283nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10-15μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液10-20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

作为优选方案，该中药组合物由如下重量份比例的原料药制成的：

麻黄52；石膏324；连翘194；黄芩78；桑白皮194；炒苦杏仁130；前胡78；半夏130；陈皮78；浙贝母78；牛蒡子130；山银花130 ；大黄39；桔梗76； 甘草65。

或者由如下重量份原料药制成：

麻黄86；石膏194；连翘324；黄芩130；桑白皮324；炒苦杏仁78；前胡130；半夏78；陈皮130；浙贝母130； 牛蒡子78；山银花78 ；大黄65；桔梗46； 甘草39。

还可以由如下重量份比例的原料药制成的：

麻黄69；石膏259；连翘259；黄芩104；桑白皮259；炒苦杏仁104；前胡104；半夏104；陈皮104；浙贝母104； 牛蒡子104；山银花104；大黄52；桔梗61；甘草52。

也可以由如下重量份比例的原料药制成的：

麻黄55；石膏254；连翘318；黄芩107；桑白皮203；炒苦杏仁107；前胡82；半夏105；陈皮84；浙贝母125； 牛蒡子122；山银花113；大黄42；桔梗60； 甘草50。

该中药组合物的活性成分是由以下步骤制成：

A、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

B、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加40-70%乙醇回流提取2次，每次1-4小时，第一次加8-10倍量，第二次加6-9倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，备用；

C、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次1-4小时，第一次加9-11倍量，第二次加7-9倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

步骤A所得细粉和步骤C所得合并后的清膏共同构成该药物组合物的活性成分。

为便于携带、服用方便，该中药组合物可以制成胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂或注射剂。

该中药组合物的片剂的制备方法，是由如下步骤组成：

A、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

B、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加40-70%乙醇回流提取2次，每次1-4小时，第一次加8-10倍量，第二次加6-9倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，备用；

C、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次1-4小时，第一次加9-11倍量，第二次加7-9倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

D、将步骤C所得合并的清膏，喷雾干燥，收集喷雾粉备用；

E、压片所需原料的重量份比例如下：

步骤D所得喷雾粉200-355；步骤A所得细粉54-145；羧甲基淀粉钠10-15.5；微晶纤维素7-12；硬脂酸镁1.5-3.5，加入淀粉，按常规制剂方法制成片剂，即得。

片剂的制备方法还可优选为：

A、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

B、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加50%乙醇回流提取2次，每次3小时，第一次加10倍量，第二次加6倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，备用；

C、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加7倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

D、将步骤C所得合并的清膏，喷雾干燥，收集喷雾粉备用；

E、压片所需原料的重量份比例如下：

步骤D所得喷雾粉282.6；步骤A所得细粉101；羧甲基淀粉钠12.5；微晶纤维素9.0；硬脂酸镁2.25，加入淀粉，按常规制剂方法制成片剂，即得。

【鉴别】

本品中药组合物在获得药物临床批件前采用薄层色谱鉴别法建立了麻黄、浙贝母、黄芩、山银花、陈皮、大黄、甘草7味药的鉴别方法，临床试验期间持续不断的对薄层色谱鉴别方法进行了优化和完善，并新增了连翘、牛蒡子的薄层色谱鉴别，还优化了浙贝母、大黄、甘草的薄层色谱鉴别方法。按照实施例3制得的片剂进行鉴别和含量测定的检验，方中各味药的薄层色谱鉴别研究结果如下：

浙贝母的薄层色谱鉴别。浙贝母中主要含贝母素类生物碱。采用说明书中供试品溶液制备方法，以浙贝母对照药材作为对照，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨溶液（17：2：1）为展开剂，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且斑点清晰，分离度好，阴性无干扰，经三批样品验证，重现性良好。

连翘的薄层色谱鉴别。连翘中主要含连翘苷、连翘酯苷等成分。采用甲醇超声提取，提取液蒸干，残渣加80%甲醇溶解，置中性氧化铝柱（100～200目，3g，内径1cm）上，再用80%甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液，以连翘对照药材作为对照，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，展开剂考察了三氯甲烷-甲醇（8：1）、三氯甲烷-甲醇（24：1）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（24：1：0.1），结果采用三氯甲烷-甲醇-甲酸（24：1：0.1），供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且斑点清晰，分离度好，阴性无干扰，经三批样品验证，重现性良好。

牛蒡子的薄层色谱鉴别。牛蒡子中主要含牛蒡子苷等木质素类成分。采用连翘薄层鉴别项下供试品溶液，以牛蒡子对照药材作为对照，点于硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（8：1）为展开剂，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，结果效果不理想，后点于硅胶GF254薄层板上，置紫外光灯（254nm）下检视，展开剂考察了三氯甲烷-甲醇（8：1）、三氯甲烷-甲醇（16：3），结果采用三氯甲烷-甲醇（16：3），供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且斑点清晰，分离度好，阴性无干扰，经三批样品验证，重现性良好。

大黄的薄层色谱鉴别。大黄中主要含蒽醌类成分。供试品溶液采用甲醇超声，以大黄对照药材作为对照，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）的上层溶液为展开剂，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，且斑点清晰，阴性无干扰，经三批样品验证，重现性良好。

山银花和黄芩的薄层色谱鉴别。山银花中主要含有机酸类成分，黄芩中主要含黄酮类成分。采用盐酸麻黄碱含量测定项下剩余的甲醇滤液作为供试品溶液，薄层背景较浅，而且简化了操作。考察了36％醋酸、乙酸乙酯-丁酮-冰醋酸-水（10：7：5：1）、乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8：1：1）、三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（9：1：1：1）等不同的展开系统。结果采用说明书中的检测方法，两味饮片中所含的代表性成分绿原酸和黄芩苷分离效果良好，阴性亦无干扰。该方法采用同一供试品，同一展开系统，同时鉴别山银花和黄芩两味饮片，专属性和重现性良好。

甘草的薄层色谱鉴别。甘草中主要含甘草酸、甘草次酸及黄酮类成分。供试品采用甲醇超声，以甘草对照药材作为对照，分别置紫外光灯（365nm）、紫外光灯（254nm）下检视，结果色谱背景较深，后供试品采用甲醇超声提取，提取液蒸干，残渣加80%甲醇溶解，置中性氧化铝柱（100～200目，3g，内径1cm）上，再用80%甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液，以甘草对照药材作为对照，以三氯甲烷-甲醇（6：1）为展开剂，分别置紫外光灯（365nm）、紫外光灯（254nm）下检视，结果置紫外光灯（254nm）下，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且斑点清晰，分离度好，阴性无干扰，经三批样品验证，重现性良好。

桔梗薄层色谱鉴别的研究。桔梗中主要含三萜皂苷类成分，曾对桔梗所含皂苷类成分进行了鉴别考察，对照药材和供试品均用甲醇直接超声提取，过滤后点样，使用了正丁醇-冰醋酸-水（7：1：2）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（16：10：1）、三氯甲烷-甲醇-水（13：7：2）等不同展开剂，采用10%硫酸乙醇试液和5％香草醛硫酸试液显色，结果对照药材和供试品色谱中有对应斑点，但阴性亦有干扰。又采用多种桔梗药材鉴别项下的方法，对桔梗皂苷元进行了鉴别，结果供试品背景较深，斑点相互重叠，无法辨认特征性斑点，试用其他展开系统，效果仍不理想。故不进行该药材的鉴定。

前胡薄层色谱鉴别研究。前胡中主要含香豆素类成分。以白花前胡对照药材为对照，对其进行了鉴别研究。供试品处理采用了乙醇提取，水溶，酸化，三氯甲烷萃取的方法，考察正己烷-乙酸乙酯（3：1）、石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯（3：1）、正己烷-乙酸乙酯（3：2）等不同的展开系统，分别在紫外光灯365nm、254nm下检视，结果供试品色谱中未能检出特征性斑点，故无法进行鉴别。

炒苦杏仁薄层鉴别的研究。苦杏仁中主要含苦杏仁苷，但成药中苦杏仁的薄层鉴别方法报道较少。参照《中国药典》2000年版一部苦杏仁项下的鉴别方法，对其进行了薄层鉴别研究，采用甲醇提取，蒸干，水溶解，三氯甲烷脱酯，正丁醇萃取的方法，使用了三氯甲烷-甲醇-水（13：6：2）10℃以下放置过夜的下层溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15：40：22：10）10℃以下放置过夜的下层溶液作展开剂，磷钼酸硫酸试液显色，结果供试品色谱背景较深，无法判断，且对照品显色也不灵敏。又采用甲醇提取，提取液蒸干，水溶解，乙酸乙酯萃取制备供试品，同时对显色方法进行了改进，先喷10%硫酸乙醇，吹干，再喷5%磷钼酸试液，105℃烘烤，结果苦杏仁苷斑点显色有所改善，但供试品色谱中斑点重叠，又有背景干扰，无法判断。又考察了5%香草醛硫酸试液、茴香醛试液等显色剂，效果均不理想。故无法进行鉴别。

桑白皮薄层色谱鉴别的研究。采用多种桑白皮的鉴别方法对其进行了薄层鉴别研究，其中供试品采用乙醇提取，饱和碳酸氢钠溶液溶解，滤过，酸化，乙酸乙酯萃取的方法，以聚酰胺薄膜为吸附剂，36%的醋酸、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10：3：1：2）、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5：3：1：1）不同展开系统，紫外光灯（365nm）下检视，结果供试品色谱中斑点重叠，未能发现特征性斑点，又采用甲醇提取，提取液挥干，水溶解，过聚酰胺柱，分别用水、甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，挥干，甲醇溶解作为供试品，使用硅胶G板，以甲醇-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（4：5：2：2）为展开剂，紫外光灯（365nm）检视，分别用三氯化铝试液和1%的三氯化铁乙醇溶液显色，效果均不理想。故无法进行鉴别。

清半夏薄层色谱鉴别的研究。半夏主要含氨基酸等成分。成药中有关半夏的鉴别报道较少，发明人采用了多种方法进行研究，但均未取得满意效果。

经过10余年持续不断的试验和研究，在参照现有文献的基础上，实验人员经过无数次的摸索，对供试品的制备、对照品的处理方法的改良和验证，并对显色剂、展开剂的成分和配比以及对试验温度、湿度等条件进行各种摸索和改进，最终确定下来的多种成分的鉴别方法，由于该中药组合物为大复方制剂，其中的活性成分复杂，相互作用众多，发明人采用的鉴别方法能准确有效的鉴别出该中药组合物中多种药材的成分，且连翘、牛蒡子、甘草的鉴别供试品溶液采用了同一种处理方法，节省了时间和步骤，但是专属性极强，达到了非常准确的结果，有效的达到了控制该中药组合物产品质量，提高药品的安全性和可靠性，保障了人民用药安全。

【含量测定】

（一）、盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量测定

麻黄具有发汗散寒，宣肺平喘之功效，为方中君药。其中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱为其主要成分，为了有效的控制成品质量，选择盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱作为含量测定指标，采用高效液相色谱法，建立了该中药组合物中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量测定方法。试验结果表明：采用发明人专利的方法测定盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量，专属性强、重现性好、分析时间短、结果稳定可靠，能够有效的控制本品的质量。研究过程如下：

1、试验材料、仪器与试药

盐酸麻黄碱对照品：购自中国药品生物制品检定所，批号：171241-200506，供含量测定用。

盐酸伪麻黄碱对照品：购自中国药品生物制品检定所，批号：171237-200505，供含量测定用。

本发明中药组合物：为按照实施例3制备的药物片剂，石家庄以岭药业股份有限公司，批号：060601

Agilent 1100系列高效液相色谱仪 VWD紫外检测器

乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，磷酸为优级纯，其余试剂、试药均为分析纯。

2、检测波长的选择 对盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品溶液进行紫外光谱扫描，由扫描结果可知，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱均在206.2nm处有最大吸收，与《中国药典》2005年版一部麻黄项下检测波长207nm基本一致，故选择207nm为检测波长。（光谱图见图七）。

3、流动相选择 根据文献报道，盐酸麻黄碱的含量测定的流动相多采用乙腈-磷酸溶液体系，经多次讨论和试验验证，最终试验采用了乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95）的流动相，结果盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱和相邻的色谱峰均能达到基线分离。

4、色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95）

流速：1.0ml/min

检测波长：207nm

柱温：30℃

理论板数：按盐酸麻黄碱峰计算应不低于5000

5、对照品溶液的制备

取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，用流动相制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液。

6、供试品溶液的制备

本品为含15味中药的复方制剂，成分复杂，根据盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的性质，考察了甲醇超声提取，上中性氧化铝柱及有机溶剂萃取的方法对供试品进行了纯化，结果中性氧化铝柱的供试品色谱中，杂质多，峰型及分离度差；而有机溶剂萃取纯化的供试品，在所采用的色谱条件下，盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱色谱峰以及与其相邻色谱峰均达到了基线分离，能够满足定量分析的要求。为了保证含量测定结果的准确性，我们对供试品溶液制备方法进行试验考察。

（1）萃取溶剂的考察

取同一批样品（批号060601），提取碱化后分别以乙醚和三氯甲烷为溶剂进行萃取，测定含量，结果见表1：

结果表明，用乙醚萃取比三氯甲烷萃取含量稍高，且乙醚相比较三氯甲烷毒性小，故选择乙醚为萃取溶剂。

（2）萃取次数的考察

取样品一份（批号060601），提取碱化后，用乙醚萃取5次，每次15ml，将前3次萃取液合并，加盐酸-甲醇（1:10）1ml，挥干，用流动相溶解并稀释至10ml量瓶中。将第4次、第5次萃取液单独收集，分别加盐酸-甲醇（1:10）0.5ml，挥干，用流动相溶解并稀释至10ml量瓶中。分别注入液相色谱仪，进行含量测定。试验结果见表2：

由以上试验结果可以看出，萃取3次基本萃取完全，第5次萃取液中未检出盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱吸收峰，说明萃取4次能够保证萃取完全。因此将萃取次数定为4次，溶剂用量为每次15ml。

（3）提取溶媒的考察

取同一批样品（批号060601），分别以50％甲醇、70％甲醇和甲醇为溶剂，超声提取制备，测定含量，试验结果见表3：

结果表明，三种溶剂含量接近，但甲醇粘性较小，提取液易于过滤，故选择甲醇为提取溶剂。

（4）超声时间的考察

取同一批样品（批号060601），以甲醇为溶剂，分别超声处理（功率250W，频率40KHz）20分钟、30分钟和40分钟，制备，测定含量，试验结果见表4：

结果表明，超声处理30分钟含量最高，故超声处理时间定为30分钟。

（5）提取溶媒用量考察

取同一批样品（批号060601），分别加甲醇25ml、50ml、100ml提取制备供试品溶液，测定含量，试验结果见表5：

结果表明，提取溶媒用量为50ml含量最高，为了保证提取完全，故提取溶媒用量定为50ml。

综上所述，供试品溶液采用如下方法制备：取本品，精密称定，研细，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40KHz）30分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，水浴蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液15ml溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L 氢氧化钠溶液1ml，摇匀，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加盐酸-甲醇（1：10）1ml混匀，水浴蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

7、专属性考察

按处方比例称取除麻黄外的其它药味，照制备工艺制得缺麻黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法进行制备，得到缺麻黄的阴性样品溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液、按照测定条件进行检测，结果阴性样品溶液色谱图中未检出盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱吸收峰，表明该方法的专属性良好。

8、线性关系考察

精密称取盐酸麻黄碱对照品11.58mg、盐酸伪麻黄碱11.90mg，分别置10 ml、25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱溶液各1ml，置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含盐酸麻黄碱46.32μg和盐酸伪麻黄碱19.04μg混合溶液，分别精密吸取1、2、5、10、20、30、50μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。试验数据见表6:

结果表明：盐酸麻黄碱在进样量为：46.32～2316ng，盐酸伪麻黄碱在进样量为：19.04～952ng范围内均呈良好线性关系，回归方程分别为y = 2.2745x -3.0451，相关系数r=0.99999；y = 2.4122x-2.9852，r=0.99999。

9、精密度试验

分别精密吸取浓度分别为46.32μg/ml的盐酸麻黄碱和19.04μg/ml的盐酸伪麻黄碱混合溶液及供试品溶液，分别连续进样5次，测定峰面积，结果见表7：

由以上试验结果，可得对照品中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的RSD分别为0.18%、0.43%，供试品中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的RSD分别为0.06%、0.20%，说明该仪器精密度良好。

10、稳定性试验

精密吸取对照品溶液与供试品溶液，每隔一定时间进样，考察了24小时内的稳定性，结果见表8：

由稳定性试验结果可得：对照品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱在24小时内的RSD分别为：0.81%、0.98%，供试品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为：0.34%、0.32%，表明对照品和供试品在24小时内均较稳定。

11、重复性试验

取同一批样品（批号060601），设高、中、低三个取样量，每个取样量平行3份，按供试品溶液制备方法，分别进行制备，测定，试验结果见表9：

试验结果表明，高、中、低三个不同取样量的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的平均含量分别为：0.6297mg/g、0.1948mg/g；RSD分别为：1.31%、1.48%，表明方法重复性良好。

12、回收率试验

采用加样回收试验，取同一批样品（批号060601)9份，分为三组，分别加入高、中、低浓度的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱混合对照品甲醇溶液50ml，进行超声提取，制备供试品溶液，测定，计算回收率，试验结果见表10：

由加样回收试验结果可知，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的平均回收率分别为：100.54%、102.28%，RSD分别为：1.92％、1.52%，表明该方法准确可靠。

13、耐用性试验（060601）

（1）流动相组成比例变化

取同一份供试品溶液，考察流动相组成比例变化对含量测定结果的影响程度，结果见表11：

试验结果表明，流动相组成比例发生小的变化，对含量测定结果影响较小。

（2）不同柱温的比较

取同一份供试品溶液，考察柱温变化对含量测定结果的影响，结果见表12：

试验结果表明,色谱柱温度在小范围内发生变化，对含量测定结果影响较小。

（3）不同品牌色谱柱的比较

取同一份供试品溶液，考察不同品牌色谱柱对含量测定结果的影响程度，试验结果见表13：

试验结果表明，采用三种不同品牌的C18色谱柱（250mm），对含量测定结果影响较小。

（4）不同流速的比较

取同一份供试品溶液，考察流动相流速变化对含量测定结果的影响程度，试验结果见表14：

试验结果表明，流动相流速发生小的变化，对含量测定结果影响较小。

（5）不同检测波长的比较

取同一份供试品溶液，考察不同检测波长对含量测定结果的影响程度，试验结果见表15：

试验结果表明，检测波长发生小的变化，对含量测定结果影响较小。

14、中试样品含量的测定

对按实施例1090901、实施例2090902、实施例4090903三批本发明中药组合物中的盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱含量进行了测定，结果见表16：

由含量测定结果可知，三批中试样品盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量平均转移率为42.5%。

（二）、橙皮苷含量测定

水提取部分选取陈皮中橙皮苷为含量测定指标，为了有效的控制成品质量，采用反相高效液相色谱法，建立了成品中橙皮苷的含量测定方法。试验结果表明：采用正文中的方法测定橙皮苷含量，专属性强、重现性好、结果稳定可靠，能够有效的控制本品的质量。研究过程如下：

1、试验材料、仪器与试药

橙皮苷对照品：购自中国药品生物制品检定所，批号：110721-200613，供含量测定用。

本发明中药组合物：为按照实施例3制备的药物片剂组合物，石家庄以岭药业股份有限公司，批号：060601

Agilent 1100系列高效液相色谱仪 VWD紫外检测器；

乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，磷酸为优级纯

其余试剂、试药均为分析纯。

2、检测波长的选择 对橙皮苷对照品溶液进行紫外光谱扫描，由扫描结果可知，橙皮苷在284.3nm处有最大吸收，与《中国药典》2005年版一部陈皮项下检测波长283nm基本一致，故选择283nm为检测波长。

3、流动相选择 结果以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，橙皮苷和相邻的色谱峰能达到基线分离，峰型对称。

4、色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱

流速：1.0ml/min

检测波长：283nm

柱温：25℃

理论板数：按橙皮苷峰计算应不低于3000

5、对照品溶液的制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，用流动相制成每1ml含橙皮苷30μg溶液。

6、供试品溶液的制备

本品为含15味中药的复方制剂，成分复杂，根据橙皮苷的性质，采用甲醇超声提取样品。又利用聚酰胺对黄酮类化合物具有良好富集的特性，对供试品进行了纯化，结果有效消除了其他成分的干扰，在所采用的色谱条件下，橙皮苷色谱峰与其相邻色谱峰达到了基线分离，能够满足定量分析的要求。为了保证含量测定结果的准确性，我们对供试品溶液制备方法进行试验考察。

（1）聚酰胺用量考察

取同一批样品（批号060601），加甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置1g、1.5g、2g聚酰胺柱（60～80目，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%甲醇洗脱，收集洗脱液，测定橙皮苷含量。（上样及洗脱速度为每分钟1ml）结果见表17：

由以上试验结果可得，聚酰胺用量为1、1.5、2g，对橙皮苷含量测定结果影响不大，为保证充分吸附和洗脱，聚酰胺用量定为1.5g。

（2）聚酰胺规格考察

取同一批样品（批号060601），加甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置不同规格聚酰胺柱（1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%甲醇洗脱，收集洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表18：

由以上试验结果可得，30～60目聚酰胺较60～80目和80～100目橙皮苷含量测定结果小，80～100目聚酰胺柱洗脱速度过慢，因此选择60～80目聚酰胺为宜。

（3）上样浓度考察

取同一批样品（批号060601），加甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣分别用水5ml、10ml溶解，分别置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%甲醇洗脱，收集洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表19：

由以上试验结果可得，两者结果相差不大，为保证充分溶解，选择用10ml水溶解上样。

（4）洗脱剂用量考察

取本样品（批号060601），加甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%甲醇洗脱，分别收集洗脱液前30ml和后20ml，分别测定橙皮苷含量。结果见表20：

由以上试验结果可得，用30%甲醇30ml已经洗脱完全，为保证充分洗脱橙皮苷，选择洗脱剂用量为40ml。

（5）径高比考察

取同一批样品（批号060601），加甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置内径为1cm和1.2cm聚酰胺柱（60～80目，1.5g，用水湿法上柱）上，用30%甲醇洗脱，收集洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表21：

由以上试验结果可得，内径为1cm聚酰胺柱含量明显比内径为1.2cm含量高，因此选择聚酰胺柱内径为1cm。

（6）洗脱速度考察

取同一批样品（批号060601），加甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%甲醇分别以1.0、1.2、1.5ml/min洗脱，收集各洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表22：

由以上试验结果可得，洗脱速度1.0和1.2ml/min含量稍高，且两者相差不大，因此选择洗脱速度为1.0～1.2ml/min。

（7）洗脱溶剂考察

取同一批样品（批号060601），加甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，分别用25%甲醇、30%甲醇、25%乙醇、30%乙醇洗脱，收集各洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表23：

由以上试验结果可得，用30%乙醇洗脱结果稍高，且乙醇比甲醇环保，因此选择洗脱溶剂为30%乙醇。

（8）超声时间考察

取同一批样品（批号060601），分别加甲醇超声处理25min、30min、40min，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表24：

由以上试验结果可得，超声提取30分钟和40分钟结果稍高，且相差不大，因此选择超声时间为30分钟。

（9）提取溶媒考察

取同一批样品（批号060601），分别加甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇超声处理30min，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表25：

由以上试验结果可得，以甲醇为提取溶媒，结果最高，且甲醇粘度小易过滤，因此选择甲醇为提取溶媒。

（10）提取溶媒用量考察

取同一批样品（批号060601），分别加25ml、50ml、100ml甲醇超声提取，取续滤液蒸干，残渣用水溶解，分别置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，用30%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定橙皮苷含量。结果见表26：

由以上试验结果可得，提取溶媒用量对含量测定结果影响不大，为保证充分提取橙皮苷，选择溶媒用量为50ml。

综上所述，供试品溶液采用如下方法制备：取本品，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40KHz）30分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水10ml溶解，置聚酰胺柱（60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱）上，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。（上样及洗脱速度为每分钟1～1.2ml）

7、专属性考察

按处方比例称取除陈皮外的其它药味，照制备工艺制得缺陈皮的样品，按供试品溶液制备方法进行制备，得到缺陈皮的阴性样品溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液、按照测定条件进行检测，结果阴性样品溶液色谱图中未检出橙皮苷吸收峰，表明该方法的专属性良好。

8、线性关系考察

精密称取橙皮苷对照品18.18mg，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含橙皮苷29.088μg溶液，分别精密吸取2、5、10、20、30、50μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。试验数据见表27：

结果表明：橙皮苷在进样量为：58.176～1454.4ng范围内呈良好线性关系，回归方程为y = 1.8209x + 0.0806，相关系数r=1.00000。

9、精密度考察

取本发明药物组合物（批号060601），按供试品处理方法制备得供试品溶液，分别精密吸取浓度为29.088μg/ml对照品溶液10μl及供试品溶液20μl，连续5次注入高效液相色谱仪，测定峰面积。结果见表28：

结果表明：对照品RSD为0.17%，供试品RSD为0.15%，说明仪器精密度良好。

10、稳定性考察

取本发明药物组合物（批号060601）制备供试品溶液，每隔一定时间，分别吸取橙皮苷对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。结果见表29：

结果表明：对照品及供试品溶液在0～24小时内，峰面积RSD分别为1.0%、0.5%，表明对照品和供试品均在0～24小时内稳定。

11、重复性试验

取同一批样品（批号060601），设高、中、低三个取样量，每个取样量平行3份，按供试品溶液制备方法，分别进行制备，测定，试验结果见表30：

试验结果表明，高、中、低三个不同取样量的RSD为0.83%，表明方法重复性良好。

12、回收率试验

采用加样回收试验，取同一批样品（批号060601) 9份，分为三组，分别加入高、中、低浓度的橙皮苷对照品甲醇溶液50ml，进行超声提取，制备供试品溶液，测定，计算回收率，试验结果见表31

由加样回收试验结果可知，平均回收率为97.39%，RSD为1.71％，表明该方法准确可靠。

13、耐用性试验

（1）不同流速变化

取同一份供试品（批号060601）溶液，考察不同流速变化对含量测定结果的影响程度，结果见表32：

试验结果表明，流速发生小的变化，对含量测定结果影响较小。

（2）不同色谱柱的比较

取同一份供试品（批号060601）溶液，考察不同色谱柱对含量测定结果的影响，试验结果见表33：

试验结果表明，不同品牌（型号）色谱柱对含量测定结果影响较小。

（3）不同柱温的比较

取同一份供试品（批号060601）溶液，考察不同柱温条件下对含量测定结果的影响程度，试验结果见表34：

试验结果表明,不同柱温条件下对含量测定结果影响较小。

（4）不同聚酰胺生产厂家的比较

取同一批（批号060601）供试品，考察不同生产厂家聚酰胺对含量测定结果的影响程度，试验结果见表35：

试验结果表明，不同生产厂家的聚酰胺对橙皮苷含量测定结果影响较小。

（5）不同检测波长的比较

取同一份供试品（批号060601）溶液，考察不同检测波长对含量测定结果的影响程度，试验结果见表36：

试验结果表明，检测波长发生小的变化，对含量测定结果影响较小。

（6）不同流动相比例比较

取同一份供试品（批号060601）溶液，考察流动相比例在不同时间变化时，对含量测定结果的影响程度，试验结果见表37：

试验结果表明，流动相比例在不同时间稍变化时对含量测定影响较小。

附图说明

图1 浙贝母薄层鉴别色谱图：1、阴性样品 2、浙贝母对照药材 3～5、供试品

图2 连翘薄层鉴别色谱图 1、阴性样品 2、连翘对照药材 3～5、供试品

图3 牛蒡子薄层鉴别色谱图 1、阴性样品 2、牛蒡子对照药材 3～5、供试品

图4 大黄薄层鉴别色谱图 1、阴性样品 2、大黄对照药材 3～5、供试品

图5 甘草薄层鉴别色谱图 1、阴性样品 2、甘草对照药材 3～5、供试品

图6 山银花、黄芩薄层鉴别色谱图 1、黄芩阴性样品 2、黄芩苷对照品 3～5、供试品6、绿原酸对照品 7、山银花阴性样品。

具体实施方式

实施例1：本发明药物胶囊剂鉴别及含量测定方法

处方：

麻黄52g；石膏324g；连翘194g；黄芩78g；桑白皮194g；炒苦杏仁130g；前胡78g；清半夏130g；陈皮78g；浙贝母78g；牛蒡子130g；山银花130g ；大黄39g；桔梗76g； 甘草65g。

制备方法：

1、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

2、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加60%乙醇回流提取2次，每次2小时，第一次加9倍量，第二次加8倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，备用；

3、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加7倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

4、按常规方法制成胶囊剂即得。

鉴别及含量测定：

浙贝母的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量19g的胶囊内容物，加浓氨试液2ml与三氯甲烷20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为17：2：1乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

连翘的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量8.5g的胶囊内容物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

牛蒡子鉴别方法：取连翘鉴别项下供试品溶液，作为供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

大黄鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量19g的胶囊内容物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理10分钟，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为15：5：1的30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

甘草鉴别方法：取连翘项下供试品溶液，作为供试品溶液；取甘草对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各6μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇（6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

山银花、黄芩鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量3g的胶囊内容物，加入甲醇50ml超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取盐酸麻黄碱含量测定项下备用的甲醇滤液3μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以新配制的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（8：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

该药物组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量30g的胶囊内容物，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液15ml溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1ml，摇匀，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加比例为1：10的盐酸-甲醇溶液1ml混匀，水浴蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为以乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），检测波长207nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液5μL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

该药物组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量40g的胶囊内容物，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水10ml溶解，上聚酰胺柱，60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加比例为22：78的乙腈--0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长283nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

实施例2：本发明药物散剂鉴别及含量测定方法

处方：

麻黄86g；石膏194g；连翘324g；黄芩130g；桑白皮324g；炒苦杏仁78g；前胡130g；清半夏78g；陈皮130g；浙贝母130g； 牛蒡子78g；山银花78g ；大黄65g；桔梗46g； 甘草39g。

1、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

2、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加60%乙醇回流提取2次，每次2小时，第一次加8倍量，第二次加6倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14的清膏，备用；

3、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次2小时，第一次加9倍量，第二次加7倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

4、按常规方法制成散剂即得。

鉴别及含量测定：

浙贝母的鉴别方法：取相当与18.5g生药量的散剂，加浓氨试液2ml与三氯甲烷20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为17：2：1乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

连翘的鉴别方法：取相当于9g生药量的散剂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

牛蒡子鉴别方法：取相当于9.5g生药量的散剂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

大黄鉴别方法：取相当于19g生药量的散剂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理10分钟，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为15：5：1的30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

甘草鉴别方法：取相当于8.5g生药量的散剂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取甘草对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各4μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇（6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

山银花、黄芩鉴别方法：取相当于3g生药量的散剂，加入甲醇50ml超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取盐酸麻黄碱含量测定项下备用的甲醇滤液2～3μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以新配制的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（8：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

该药物组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量35g的散剂，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液15ml溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1ml，摇匀，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加比例为1：10的盐酸-甲醇溶液1ml混匀，水浴蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为以乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），检测波长207nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液各5μL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

该药物组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量40g的散剂，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水10ml溶解，上聚酰胺柱，60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加比例为22：78的乙腈--0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长283nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

实施例3：本发明药物片剂鉴别及含量测定方法

处方：

麻黄69g；石膏259g；连翘259g；黄芩104g；桑白皮259g；炒苦杏仁104g；前胡104g；清半夏104g；陈皮104g；浙贝母104g； 牛蒡子104g；山银花104g；大黄52g；桔梗61g；甘草52g。

1、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

2、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加50%乙醇回流提取2次，每次3小时，第一次加10倍量，第二次加6倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，备用；

3、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加7倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

4、将步骤C所得合并的清膏，喷雾干燥，收集喷雾粉备用；

5、压片所需原料的重量份比例如下：

步骤4所得喷雾粉282.6g；步骤1所得细粉101g；羧甲基淀粉钠12.5g；微晶纤维素9.0g；硬脂酸镁2.25g，加入淀粉，按常规制剂方法制成片剂，即得。

鉴别及含量测定：

浙贝母的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量18g的片剂，去掉包衣，研细，加浓氨试液2ml与三氯甲烷20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为17：2：1乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

连翘的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量10g片剂，去掉包衣，研细，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

牛蒡子鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量8的片剂，去掉包衣，研细，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

大黄鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量19g的片剂，去掉包衣，研细，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理10分钟，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为15：5：1的30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

甘草鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量10g的片剂，去掉包衣，研细，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取甘草对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各6μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇（6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

山银花、黄芩鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量2g的片剂，去掉包衣，研细，加入甲醇50ml超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取盐酸麻黄碱含量测定项下备用的甲醇滤液2μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以新配制的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（8：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

该药物组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量28g的片剂，去掉包衣，研细，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液15ml溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1ml，摇匀，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加比例为1：10的盐酸-甲醇溶液1ml混匀，水浴蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为以乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），检测波长207nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液5μL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

该药物组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量30-40g的片剂，去掉包衣，研细，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水10ml溶解，上聚酰胺柱，60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加比例为22：78的乙腈--0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长283nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

实施例4：本发明药物丸剂鉴别及含量测定方法

处方：

麻黄55g；石膏254g；连翘318g；黄芩107g；桑白皮203g；炒苦杏仁107g；前胡82g；清半夏105g；陈皮84g；浙贝母125g； 牛蒡子122g；山银花113g；大黄42g；桔梗60g； 甘草50g。

按常规方法制成丸剂。

鉴别及含量测定：

浙贝母的鉴别方法：取相当与18.5g生药量的丸剂，研碎，加浓氨试液2ml与三氯甲烷20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为17：2：1乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

连翘的鉴别方法：取相当于9g生药量的散剂，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

牛蒡子鉴别方法：取相当于9.5g生药量的丸剂，研碎，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

大黄鉴别方法：取相当于19g生药量的丸剂，研碎，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理10分钟，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为15：5：1的30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

甘草鉴别方法：取相当于8.5g生药量的丸剂，研碎，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取甘草对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各4μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇（6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

山银花、黄芩鉴别方法：取相当于3g生药量的丸剂，研碎，加入甲醇50ml超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取盐酸麻黄碱含量测定项下备用的甲醇滤液2～3μl、对照品溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以新配制的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（8：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

该药物组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量35g的丸剂，研碎，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液15ml溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1ml，摇匀，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加比例为1：10的盐酸-甲醇溶液1ml混匀，水浴蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为以乙腈-0.1%磷酸溶液（5：95），检测波长207nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液各5μL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

该药物组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量40g的丸剂，研碎，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水10ml溶解，上聚酰胺柱，60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加比例为22：78的乙腈--0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长283nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

Claims (10)

1.一种中药组合物中多种成分鉴别及含量的测定方法，该中药组合物由下列重量份数的原料药制成：麻黄52-86；石膏194-324；连翘194-324；黄芩78-130；桑白皮194-324；炒苦杏仁78-130；前胡78-130；半夏78-130；陈皮78-130；浙贝母78-130；牛蒡子78-130；山银花78-130 ；大黄39-65；桔梗46-76；甘草39-65，其特征在于

该中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法包括：

（1）浙贝母的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量15-20g的组合物，加浓氨试液与三氯甲烷，超声处理，蒸干溶液，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（2）连翘的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量5-10g的组合物，加甲醇超声处理，溶液蒸干，残渣加甲醇溶解，置中性氧化铝柱上，用80%甲醇洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材0.5-1.5g，加甲醇超声处理后滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（3）牛蒡子鉴别方法：取连翘鉴别方法中的供试品溶液作为牛蒡子鉴别供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5-1.5g，加甲醇超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取两种溶液各1-8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（4）大黄鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量15-20g的组合物，加甲醇超声处理，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2-0.8g，加甲醇超声处理，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

（5）甘草鉴别方法：取连翘鉴别方法中的供试品溶液作为甘草鉴别供试品溶液；取甘草对照药材1-1.5g，加甲醇超声处理，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～8μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（6）山银花、黄芩鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量1-3g的组合物，加入甲醇超声处理过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，上述三种溶液各2-8μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（7）该中药组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量1-3g的组合物，加入甲醇50ml，超声处理后滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1-5ml，摇匀，用乙醚振摇提取，乙醚溶液加配比为1：10盐酸-甲醇溶液混匀，蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加比例为5：95的乙腈-0.1%磷酸溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为比例为0-5：95-100的乙腈-0.1%磷酸溶液，检测波长205-209nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液5-10μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液5-10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

（8）该中药组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量0.5-2g的组合物，加入甲醇50ml，超声处理，滤过，取续滤液25ml，蒸干，残渣用水溶解，上聚酰胺柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加22%乙腈--78%的0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长281-285nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10-15μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液10-20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

2.根据权利要求1所述的中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法优选为：

（1）浙贝母的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量18-20g的组合物，加浓氨试液2ml与三氯甲烷20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取浙贝母对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为17：2：1乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（2）连翘的鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量8-10g的组合物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇10ml使溶解，上100～200目中性氧化铝3g，内径1cm柱，用80%甲醇5ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取连翘对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4～6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按体积比为24：1：0.1的三氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（3）牛蒡子鉴别方法：取连翘鉴别项下供试品溶液作为牛蒡子鉴别供试品溶液；取牛蒡子对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取对照药材1-2μl ，供试品溶液4～6μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为16：3的三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

（4）大黄鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量18-20g的组合物，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；取大黄对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理10分钟，取上清液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15：5：1的30～60℃石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

（5）甘草鉴别方法：取连翘鉴别项下供试品溶液作为甘草鉴别供试品溶液；取甘草对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和上述对照药材溶液各4～6μl分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以体积比为6：1的三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（6）山银花、黄芩鉴别方法：取相当于该中药组合物生药量1-3g的组合物，加入甲醇50ml超声处理30分钟，过滤，滤液蒸干，作为供试品溶液；取绿原酸对照品、黄芩苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液2～3μl、对照品溶液2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以新配制的体积比为8：1：1：1的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（7）该药物组合物的麻黄含量测定方法由以下步骤组成：

A供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量30-40g的组合物，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，蒸干，残渣用0.1mol/L的盐酸溶液15ml溶解，转移至分液漏斗中，加入6mol/L氢氧化钠溶液1ml，摇匀，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加比例为1：10的盐酸-甲醇溶液1ml混匀，水浴蒸干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品适量，加比例为5：95的乙腈-0.1%磷酸溶液，制成每1ml含盐酸麻黄碱46μg和盐酸伪麻黄碱20μg混合溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为比例5：95的乙腈-0.1%磷酸溶液，检测波长207nm；

D标准曲线的制定及计算结果：分别将盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液5-10μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液5-10μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量；

（8）该药物组合物的陈皮含量测定方法由以下步骤组成：

A、供试品溶液的制备：取相当于该中药组合物生药量30-40g的组合物，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣用水10ml溶解，上聚酰胺柱，60～80目，1.5g，内径1cm，用水湿法上柱，弃去水液，用30%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

B、对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，用流动相制成每1ml含30μg的溶液，加比例为22：78的乙腈--0.1%磷酸溶液的溶液，制成每1ml含30μg的溶液，即得；

C、HPLC检测：色谱柱为C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-12min， 22%乙腈，78%的0.1%磷酸；12-17min，22-40%乙腈，78-60%的0.1%磷酸；17-22min， 40-22%乙腈，60-78%的0 .1%磷酸；22-25min，22%乙腈，78%的0.1%磷酸；检测波长283nm，流速为1-1.2ml/min；

D标准曲线的制定及计算结果：将橙皮苷对照品溶液10-15μL注入步骤C中高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到对照样品溶液的标准曲线；将供试样品溶液10-20μL注入高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到橙皮苷的含量。

3.如权利要求1或2任一所述的中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法，其特征在于是该中药组合物由如下重量份比例的原料药制成的：

麻黄52；石膏324；连翘194；黄芩78；桑白皮194；炒苦杏仁130；前胡78；半夏130；陈皮78；浙贝母78；牛蒡子130；山银花130 ；大黄39；桔梗76； 甘草65。

4.如权利要求1或2任一所述的中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法，其特征在于是该中药组合物由如下重量份比例的原料药制成的：

麻黄86；石膏194；连翘324；黄芩130；桑白皮324；炒苦杏仁78；前胡130；半夏78；陈皮130；浙贝母130； 牛蒡子78；山银花78 ；大黄65；桔梗46； 甘草39。

5.如权利要求1或2任一所述的中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法，其特征在于是该中药组合物由如下重量份比例的原料药制成的：

麻黄69；石膏259；连翘259；黄芩104；桑白皮259；炒苦杏仁104；前胡104；半夏104；陈皮104；浙贝母104； 牛蒡子104；山银花104；大黄52；桔梗61；甘草52。

6.如权利要求1或2任一所述的中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法，其特征在于是该中药组合物由如下重量份比例的原料药制成的：

麻黄55；石膏254；连翘318；黄芩107；桑白皮203；炒苦杏仁107；前胡82；半夏105；陈皮84；浙贝母125； 牛蒡子122；山银花113；大黄42；桔梗60； 甘草50。

7.如权利要求3-6任一所述的中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法，其特征在于是该中药组合物的活性成分是由以下步骤制成：

A、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

B、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加40-70%乙醇回流提取2次，每次1-4小时，第一次加8-10倍量，第二次加6-9倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，备用；

C、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次1-4小时，第一次加9-11倍量，第二次加7-9倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

步骤A所得细粉和步骤C所得合并后的清膏共同构成该药物组合物的活性成分。

8.如权利要求3-6任一所述的中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法，其特征在于所述中药组合物制剂剂型为胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂或注射剂。

9.根据权利要求8 所述中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法中片剂的制备方法，其特征在于是由如下步骤组成：

A、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

B、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加40-70%乙醇回流提取2次，每次1-4小时，第一次加8-10倍量，第二次加6-9倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，备用；

C、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次1-4小时，第一次加9-11倍量，第二次加7-9倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.14-1.16的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

D、将步骤C所得合并的清膏，喷雾干燥，收集喷雾粉备用；

E、压片所需原料的重量份比例如下：

步骤D所得喷雾粉200-355；步骤A所得细粉54-145；羧甲基淀粉钠10-15.5；微晶纤维素7-12；硬脂酸镁1.5-3.5，加入淀粉，按常规制剂方法制成片剂，即得。

10.根据权利要求9 所述中药组合物的多种成分鉴别及含量的测定方法中片剂的制备方法，其特征在于是由如下步骤组成：

A、按组方比例称取浙贝母，粉碎成细粉，备用；

B、按组方比例称取麻黄、连翘、炒苦杏仁、半夏、牛蒡子、大黄加50%乙醇回流提取2次，每次3小时，第一次加10倍量，第二次加6倍量，提取液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，备用；

C、按组方比例称取石膏、桑白皮、前胡、陈皮、山银花、桔梗、甘草，加水煎煮两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加7倍量，煎液合并，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃热测相对密度为1.15的清膏，与步骤B所得的清膏合并，备用；

D、将步骤C所得合并的清膏，喷雾干燥，收集喷雾粉备用；

E、压片所需原料的重量份比例如下：

步骤D所得喷雾粉282.6；步骤A所得细粉101；羧甲基淀粉钠12.5；微晶纤维素9.0；硬脂酸镁2.25，加入淀粉，按常规制剂方法制成片剂，即得。

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