CN115778997B - 一种芪蒡颗粒的制备方法及其质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芪蒡颗粒的制备方法及其质量检测方法，制备方法为取生黄芪，炒牛蒡子中药饮片，加入适量浓度乙醇回流提取两次，滤过，滤液合并，减压浓缩至浸膏，真空干燥成干膏，研磨至干浸膏粉，加入糊精混匀，制粒，即得本品。本发明的芪蒡颗粒用于气阴两虚，脾肾亏虚，气虚血瘀，瘀浊内蕴，水湿泛滥等症；制备方法控制了提取时间、料液比、提取溶剂浓度及各项参数，保证了制备过程中的药品质量；检测方法上考察了芪蒡颗粒中黄芪甲苷、牛蒡苷的薄层鉴别，绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素含量测定与指纹图谱等研究，准确率高、重复性好，能够严格控制芪蒡颗粒的产品质量，确保其质量安全、均一、有效、可控，为芪蒡颗粒的安全有效和标准化生产提供保障。
Description
技术领域
本申请涉及中药颗粒制备及检测技术领域，尤其涉及一种芪蒡颗粒的制备方法及其质量检测方法。
背景技术
糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌不足而引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。据数据统计，2021年全球糖尿病成年患者达到5.37亿例，与2019年相比，患病人数增加了16%。伴随着中国城镇化、老龄化及生活水平改变的影响，中国糖尿病患病率显著增加。2011-2021年，中国糖尿病患病人数由9000万例增加至1.4万例，增幅达56%。随着糖尿病疾病的进一步发展，会产生糖尿病肾病、糖尿病病足、糖尿病性脑血管病等并发症。其中，糖尿病肾病是由于主要微血管并发症而引起的慢性肾脏疾病，在糖尿病患病群体中，糖尿病肾病患者发病率约占糖尿病患病总人数的10%-40%。临床上对于糖尿病肾病的药物治疗有血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素受体阻滞剂、葡萄糖共转运蛋白2抑制剂、非甾体类盐皮质激素受体拮抗剂、内皮素-1受体A拮抗剂等，但糖尿病肾病患者主要人群为中老年人群，身体负担较大，而临床对于糖尿病肾病的药物治疗多具有器官损伤、药物过敏，低血糖等不良反应，损伤较大。而在中医理论指导下的中药治疗对于糖尿病肾病患者安全性更好、不良反应少、具有临床疗效等优点，因此从中医理论下探究糖尿病肾病的治疗手段具有重要意义。
糖尿病肾病在中医范畴属于消渴之证，表现为阴阳两虚，脾肾两亏，又附痰浊，积瘀血，为虚实夹杂之证。因此，对于糖尿病肾病，要以活血化瘀，补脾健肾为辨治。黄芪味甘性温，具有益气健脾、利水消肿之效；牛蒡子味苦性寒，功在宣肺利水、清热解毒，二者配对，相辅相成，一阴一阳，一补一泻，一温一寒，甘温益气，甘寒养阴，起益气养阴，清热解毒，利水消肿之效，可用于气阴两虚脾肾亏虚等症，对糖尿病肾病的治疗具有良好的临床效果。本研究应用现代提取工艺技术，将其制备成便于患者服用、安全有效的颗粒剂，预期成果将产生较好的社会效益与可观的经济效益。
本发明的目的在于提供一种芪蒡颗粒的制备工艺及其质量检测方法，通过确定制备工艺及其质量检测方法，为保证芪蒡颗粒质量达到稳定、安全、可控提供参考。
发明内容
本发明提供了一种芪蒡颗粒的制方法及其质量检测方法，对于制备方法中的植物药提取物具有降血糖，减少肾损伤作用，该方法将植物药制备成颗粒剂，便于患者服用、安全有效，可实现大生产，预计产生较好的社会效益与经济效益。同时还给出芪蒡颗粒的质量检测方法，准确率高，重复性好，能够严格控制产品质量，确保其质量安全、均一、有效、可控。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种芪蒡颗粒的制备工艺，包括步骤如下：
步骤一：原料准备：黄芪、炒牛蒡子；
步骤二：醇提取：将步骤一中的原料混合并加入体积比为10-30的55%-95%的乙醇溶液，提取1-3次，每次提取时间为30min-2h，用纱布过滤，弃滤渣，合并提取液；
步骤三：收膏：将步骤二提取的提取液减压浓缩至生药浓度为0.9-1.2的浸膏；
步骤四：制备浸膏粉；使用真空干燥浸膏，研磨，并过120目筛，得到干浸膏粉；
步骤五：制粒；向干浸膏粉中加入糊精，加入85%-无水乙醇作为润湿剂，用20目筛进行湿法制粒，整粒后放入50℃，干燥3h得到芪蒡颗粒。
进一步的技术方案，步骤一中的原料按照重量份数为：黄芪12份，炒牛蒡子12份。
进一步的技术方案，步骤一种牛蒡子炮制参数为生牛蒡在锅温180℃-200℃时下药，保持温度155℃-165℃，炒制8min-10min，得炒牛蒡子。
进一步的技术方案，步骤二中乙醇提取的温度为85-95℃。
进一步的技术方案，步骤三中减压浓缩条件为真空度：-0.10-0.8Mpa，温度为60℃。
进一步的技术方案，步骤四中真空干燥机器型号为FD-1B-50，参数设置为温度60℃-70℃，真空度为-0.1-0.08Mpa。
进一步的技术方案，步骤四中将干浸膏进行研磨，过120目筛。
进一步的技术方案，步骤五中干浸膏粉：糊精重量比为3:7进行湿法制粒。
进一步的技术方案，步骤五中采用85%乙醇作为润湿剂。
进一步的技术方案，步骤五中制粒放入鼓风干燥箱，温度设置为50℃，干燥时间为3h。
进一步的技术方案，步骤五中的干燥颗粒过一号筛和五号筛，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15%。
一种芪蒡颗粒的质量检测方法，包括对芪蒡颗粒的定性与定量检测，具体为黄芪中黄芪甲苷、炒牛蒡子中牛蒡苷的薄层鉴别，绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素的含量测定与指纹图谱检测和指纹图谱共有峰的指认。
进一步的技术方案，黄芪中黄芪甲苷的薄层鉴别包括以下步骤：
取本品1.0g，研细，加甲醇25mL，超声处理30min，过滤，蒸干，残渣加入10mL10%氨水（V/V）溶解。将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次（15mL、10mL、5mL）。合并萃取液，蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，得芪蒡颗粒供试品溶液；
取黄芪对照药材1.0g，加甲醇25mL，超声处理30min，过滤，蒸干，残渣加入10mL10%氨水（V/V）溶解。将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次（15mL、10mL、5mL）。合并萃取液，蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，得黄芪对照药材溶液；
取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的对照品溶液得到黄芪甲苷对照品溶液；
按处方中的比例和制备工艺制成缺黄芪的空白颗粒，同供试品溶液的制备方法制得缺黄芪的阴性对照溶液；
按照薄层色谱法（通则0502），吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上（薄层板置于105℃预活化30min，冷却至室温备用），以三氯甲烷-甲醇-水（6:4:0.5）为展开剂，预平衡30min，上行展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇，105℃下烘烤约3min至斑点显色清晰。置日光灯与紫外灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱，显相同淡紫色斑点。
进一步的技术方案，炒牛蒡子中牛蒡苷的薄层鉴别包括以下步骤：
取颗粒1.0g，研细，加75%甲醇25mL，超声处理15min，过滤，蒸干，加入甲醇2mL溶解，得芪蒡颗粒供试品溶液；
取牛蒡子对照药材0.5g，研细，加75%甲醇25mL，超声处理15min，过滤，蒸干，加入甲醇2mL溶解，得牛蒡子对照药材溶液；
取牛蒡苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的对照品溶液得到牛蒡苷对照品溶液；
按处方中的比例和制备工艺制成缺牛蒡子的空白颗粒，同供试品溶液的制备方法制得缺牛蒡子的阴性对照溶液；
按照薄层色谱法（通则0502），吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上（薄层板置于105℃预活化30min，冷却至室温备用），以三氯甲烷-甲醇（10:2）为展开剂，预平衡30min，上行展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇，105℃下烘烤约3min至斑点显色清晰，置日光灯下检视，在与对照品色谱相应的位置上，显相同淡紫色斑点。
进一步的技术方案，绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素的含量测定方法为：
1） 对照品溶液的制备，精密称取绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素对照品适量，置于5mL的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得混合对照品贮备溶液，质量浓度分别为0.32、0.22、0.03、4.92、0.05、0.50、0.02 mg/mL。
2） 供试品溶液的制备，取芪蒡颗粒一袋，研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75%甲醇25mL，超声（150W，40kHZ）提取15min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，过0.45μm滤膜，得供试品溶液，进液相分析；
3） 色谱条件：色谱柱：kromasil 100-5-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈（16:84，B相）-0.1%甲酸水（A相）；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于1500。梯度洗脱，程序如下：
| 时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 79 | 21 |
| 20 | 76 | 24 |
| 25 | 76 | 24 |
| 30 | 72 | 28 |
| 37 | 60 | 40 |
| 42 | 57 | 43 |
| 47 | 55 | 45 |
| 52 | 60 | 40 |
| 67 | 90 | 10 |
| 70 | 90 | 10 |
4） 标准曲线的制备，精密吸取一定体积的混合对照品储备液，稀释2、4、10、100倍，共得5种不同质量浓度的对照品溶液，按3）项下色谱条件进行分析测定。以对照品质量浓度X （mg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。绿原酸：y=17189817.35x-70582.10，R2=0.9992，线性范围为0.0032-0.3156 mg/mL；异绿原酸C：y=23136040.07x-98683.70，R2=0.9992，线性范围为0.0022-0.2237 mg/mL；芒柄花苷：y=63676091.44x-4503.78，R2=0.9997，线性范围为0.0003-0.0319 mg/mL；牛蒡苷：y=1384168.73x-16712.28，R2=0.9999，线性范围为0.0492-4.9210 mg/mL；毛蕊异黄酮：y=76565282.95x-284.77，R2=0.9996，线性范围为0.0005-0.0459 mg/mL；牛蒡苷元：y=2113187.09x-3977.21，R2=0.9998，线性范围为0.0050-0.5047 mg/mL；芒柄花素：y=79305756.55x+29452.96，R2=0.9991，线性范围为0.0002-0.0237 mg/mL。
进一步的技术方案，指纹图谱检测方法为：
（1）对照品溶液的制备，精密称取绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素对照品适量，置于5mL的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得混合对照品贮备溶液，质量浓度分别为0.32、0.22、0.03、4.92、0.05、0.50、0.02 mg/mL。
（2）供试品溶液的制备，取10个批次的芪蒡颗粒，分别研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75%甲醇25mL，超声（150W，40kHZ）提取15min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，过0.45μm滤膜，得供试品溶液，进液相分析；
（3）色谱条件：色谱柱：kromasil 100-5-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈（16:84，B相）-0.1%甲酸水（A相）；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于1500。梯度洗脱，程序如下：
| 时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 79 | 21 |
| 20 | 76 | 24 |
| 25 | 76 | 24 |
| 30 | 72 | 28 |
| 37 | 60 | 40 |
| 42 | 57 | 43 |
| 47 | 55 | 45 |
| 52 | 60 | 40 |
| 67 | 90 | 10 |
| 70 | 90 | 10 |
（4）测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
采用本申请的技术方案的有益效果如下：
本发明一种芪蒡颗粒的制备工艺步骤一中使用的原料，其水溶性成分与脂溶性成分均有降低血糖保护肾脏的作用。
本发明一种芪蒡颗粒的制备工艺步骤一中使用的原料，牛蒡子为炮制牛蒡子，其有效成分较生品均一，且锅温180℃时下药，炮制温度维持在155℃-165℃，炒制8min，为牛蒡子最佳炮制工艺，各有效成分比较均一，并且符合中药“逢子必炒”炮制理论。
本发明一种芪蒡颗粒的制备工艺步骤二中采用55%乙醇作为提取溶剂可以较全面的提取出原料中具有降血糖保护肾脏的水溶性与脂溶性成分，本次研究采用回流提取，提取2次，每次提取90min，效率高，非常适用工业规模化生产。本发明通过单因素试验考察，比较了提取溶剂（水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇）、提取次数（1次、2次、3次）、提取时间（30min、45min、60min、90min、120min），发现采用55%乙醇作为提取溶剂，提取2次，每次提取90min提取效率相对最高。
本发明一种芪蒡颗粒的制备工艺步骤三种采用减压浓缩，通过大量实验说明，在该参数下减压浓缩效率高。
本发明一种芪蒡颗粒的制备工艺步骤四中采用真空干燥，参数设置为60℃-70℃，真空度为-0.1-0.08Mpa，本发明比较了常压干燥、冷冻干燥、真空干燥三种干燥方式。采用真空干燥，芪蒡浓缩液的降血糖保护肾脏的相关成分有效转移率较好，成分变化较少效率较高。干燥后得到的干浸膏进行研磨过120目筛，得到干浸膏粉，易于制粒。
本发明一种芪蒡颗粒的制备工艺步骤五中采用85%乙醇作为润湿剂，本申请通过比较不同浓度乙醇作为润湿剂进行湿法制粒，无水乙醇、95%乙醇、90乙醇制粒松散，不易成型，80%乙醇制粒黏连，较难制粒，85%乙醇进行制粒，不黏连，较易制粒。
步骤五中采用糊精进行湿法制粒，通过比较微晶纤维素，甘露醇、糊精三种不同辅料与干浸膏粉末进行制粒，糊精制粒成型性、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性较好。
步骤五中采用糊精：干浸膏粉=3:7进行湿法制粒，每日服用量不超过药典规定，具有安全性，并且加入糊精可以改善干浸膏粉的吸湿性。
本发明一种芪蒡颗粒的质量检测方法提供的技术方案是根据该药方中药味的特性并基于一定的基础研究进行制定，采用定性分析与定量分析相结合的方式对药品进行质量检测，省时省力，准确率高，可以帮助鉴别药物的真伪性，评价药物的有效性，保证药物质量的均一、稳定、可靠。
本发明一种芪蒡颗粒的质量检测方法对于准确检测芪蒡颗粒有效成分具有重要意义，为对该药物和该领域药物的研发与制备具有重要意义。
本发明一种芪蒡颗粒的质量标准的检测方法对于黄芪中黄芪甲苷、炒牛蒡子中牛蒡苷的薄层鉴别方法简单，操作方便，重现性好，准确度高。
本发明一种芪蒡颗粒的质量检测方法中芪蒡颗粒的高效液相色谱供试品溶液的制备，是溶解其有效成分的优化方案，前期通过相关网络药理学研究与相关文献检索，确定黄芪、炒牛蒡子中治疗糖尿病肾病的潜在活性成分，并以此进行含量测定指标进行质量评价，并针对成分特点，确定洗脱程序，能给有得到准确度高的高效液相色谱结果，从而帮助检测判断芪蒡颗粒是否达到标准，保证临床使用该药的安全和稳定性。本发明提供的薄层色谱检测法中对照品和供试品制备的技术方案包括但不限于药品的选择、制备条件的选择、检测条件的选择均是具有针对性的，实验结果表达良好。准确度高，误差小，操作性强，能够对芪蒡颗粒中的药物成分做出准确的定性分析。
本发明一种芪蒡颗粒的质量检测方法中指纹图谱的检测，各个峰型良好，各批次之间相似度大于0.9，具有良好的相似性。
附图说明
为了更清楚的说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2芪蒡颗粒黄芪薄层色谱检测结果；
图2为实施例2芪蒡颗粒炒牛蒡子薄层色谱检测结果；
图3为芪蒡颗粒高效液相色谱图谱；
图4为芪蒡颗粒提取溶剂考察结果；
图5为芪蒡颗粒提取时间考察结果；
图6为芪蒡颗粒线性考察结果；
图7为芪蒡颗粒含量测定精密度试验结果；
图8为芪蒡颗粒含量测定重复性试验结果；
图9为芪蒡颗粒含量测定稳定性试验结果；
图10为芪蒡颗粒加样回收率实验结果；
图11为芪蒡颗粒指纹图谱结果；
图12为芪蒡颗粒指纹图谱相似度结果。
具体实施方式
下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。
一种芪蒡颗粒的制备方法及其质量检测方法，制备方法为取生黄芪，炒牛蒡子中药饮片，加入适量浓度乙醇回流提取两次，滤过，滤液合并，减压浓缩至浸膏，真空干燥成干膏，研磨至干浸膏粉，加入糊精混匀，制粒，即得本品。本发明的芪蒡颗粒用于气阴两虚，脾肾亏虚，气虚血瘀，瘀浊内蕴，水湿泛滥等症；制备方法控制了提取时间、料液比、提取溶剂浓度及各项参数，保证了制备过程中的药品质量；检测方法上考察了芪蒡颗粒中黄芪甲苷、牛蒡苷的薄层鉴别，绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素含量测定与指纹图谱等研究，准确率高、重复性好，能够严格控制芪蒡颗粒的产品质量，确保其质量安全、均一、有效、可控，为芪蒡颗粒的安全有效和标准化生产提供保障。
如图1~图12所示：
实施例1
一种芪蒡颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：原料准备：黄芪12份、炒牛蒡子12份；
步骤二：醇提取：将步骤一中的原料混合并加入浓度55%的乙醇溶液，提取2次，每次提取时间为90min，提取温度为85℃，提取结束后用纱布过滤，弃滤渣。
步骤三：收膏：将步骤二得到的合并提取液减压浓缩至生药含量0.96的浸膏，减压浓缩条件为：真空度是-0.1Mpa，温度为60℃。
步骤四：制备浸膏粉：使用真空干燥制备浸膏，干浸膏研磨，过120目筛，得到浸膏粉。真空干燥参数为：真空度0.08Mpa，温度为60℃。
步骤五：制粒：取干浸膏粉与糊精按照重量比3:7称量，充分混匀，加入85%乙醇作为润湿剂在20目筛制粒，制得湿颗粒放入电热鼓风干燥箱进行干燥，电热鼓风干燥箱温度设置为50℃，时间为3h，即得。
实施例2
一种芪蒡颗粒的质量检测方法，黄芪中黄芪甲苷的薄层鉴别包括以下步骤：
取本品1.0g，研细，加甲醇25mL，超声处理30min，过滤，蒸干，残渣加入10mL10%氨水（V/V）溶解。将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次（15mL、10mL、5mL）。合并萃取液，蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，得芪蒡颗粒供试品溶液；
取黄芪对照药材1.0g，加甲醇25mL，超声处理30min，过滤，蒸干，残渣加入10mL10%氨水（V/V）溶解。将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次（15mL、10mL、5mL）。合并萃取液，蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，得黄芪对照药材溶液；
取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的对照品溶液得到黄芪甲苷对照品溶液；
按处方中的比例和制备工艺制成缺黄芪的空白颗粒，同供试品溶液的制备方法制得缺黄芪的阴性对照溶液；
按照薄层色谱法（通则0502），吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上（薄层板置于105℃预活化30min，冷却至室温备用），以三氯甲烷-甲醇-水（6:4:0.5）为展开剂，预平衡30min，上行展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇，105℃下烘烤约3min至斑点显色清晰。置日光灯与紫外灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱，显相同淡紫色斑点。结果如图1所示，A：日光灯下B：365nm紫外灯下，1.黄芪甲苷对照品； 2. 黄芪对照药材； 3-5. 芪蒡颗粒三批供试品： 6.缺黄芪芪蒡颗粒阴性对照。
一种芪蒡颗粒的质量检测方法，炒牛蒡子中牛蒡苷的薄层鉴别包括以下步骤：
取颗粒1.0g，研细，加75%甲醇25mL，超声处理15min，过滤，蒸干，加入甲醇2mL溶解，得芪蒡颗粒供试品溶液；
取牛蒡子对照药材0.5g，研细，加75%甲醇25mL，超声处理15min，过滤，蒸干，加入甲醇2mL溶解，得牛蒡子对照药材溶液；
取牛蒡苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的对照品溶液得到牛蒡苷对照品溶液；
按处方中的比例和制备工艺制成缺牛蒡子的空白颗粒，同供试品溶液的制备方法制得缺牛蒡子的阴性对照溶液；
按照薄层色谱法（通则0502），吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上（薄层板置于105℃预活化30min，冷却至室温备用），以三氯甲烷-甲醇（10:2）为展开剂，预平衡30min，上行展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇，105℃下烘烤约3min至斑点显色清晰，置日光灯下检视，在与对照品色谱相应的位置上，显相同淡紫色斑点。结果如图2所示，1. 牛蒡苷对照品； 2. 牛蒡子对照药材；3-5. 芪蒡颗粒三批供试品； 6. 缺牛蒡子芪蒡颗粒阴性对照
一种芪蒡颗粒的质量检测方法，绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素的含量测定方法为：
1） 对照品溶液的制备，精密称取绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素对照品适量，置于5mL的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得混合对照品贮备溶液，质量浓度分别为0.32、0.22、0.03、4.92、0.05、0.50、0.02 mg/mL。
2） 供试品溶液的制备，取芪蒡颗粒一袋，研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75%甲醇25mL，超声（150W，40kHZ）提取15min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，过0.45μm滤膜，得供试品溶液，进液相分析，高效液相色谱图见图3；
3） 色谱条件：色谱柱：kromasil 100-5-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈（16:84，B相）-0.1%甲酸水（A相）；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于1500。梯度洗脱，程序如下：
| 时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 79 | 21 |
| 20 | 76 | 24 |
| 25 | 76 | 24 |
| 30 | 72 | 28 |
| 37 | 60 | 40 |
| 42 | 57 | 43 |
| 47 | 55 | 45 |
| 52 | 60 | 40 |
| 67 | 90 | 10 |
| 70 | 90 | 10 |
实施例3
取芪蒡颗粒一袋，研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，精密加入50%甲醇、75%甲醇、甲醇、50%乙醇、75%乙醇、乙醇各25mL，超声提取15min，取出，放冷，过滤，提取溶剂定容至25mL容量瓶中，得供试品溶液，过0.45μm滤膜，进液相分析，记录各成分峰面积进行比较，结果见图4。
结果显示，芪蒡颗粒提取溶剂选择75%甲醇进行提取，提取率高，干扰较小。
实施例4
取芪蒡颗粒一袋，研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75%甲醇25mL，超声提取15min、30min、45min、60min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，得供试品溶液，过0.45μm滤膜，进液相分析，记录各成分峰面积进行比较，结果见图5。
结果显示，芪蒡颗粒提取时间在15min相对稳定，无明显变化，从能耗方面考虑，将提取时间确定为15min。
实施例5
按照以下检测方式进行试验：
1） 对照品溶液的制备，精密称取绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素对照品适量，置于5mL的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得混合对照品贮备溶液，质量浓度分别为0.32、0.22、0.03、4.92、0.05、0.50、0.02 mg/mL。
2） 供试品溶液的制备，取不同批号的芪蒡颗粒，研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75%甲醇25mL，超声提取15min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，得供试品溶液，每个批号平行提取2次，过0.45μm滤膜，进液相分析。
3） 色谱条件：色谱柱：kromasil 100-5-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈（16:84，B相）-0.1%甲酸水（A相）；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于1500。梯度洗脱，程序如下：
| 时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 79 | 21 |
| 20 | 76 | 24 |
| 25 | 76 | 24 |
| 30 | 72 | 28 |
| 37 | 60 | 40 |
| 42 | 57 | 43 |
| 47 | 55 | 45 |
| 52 | 60 | 40 |
| 67 | 90 | 10 |
| 70 | 90 | 10 |
精密吸取一定体积的混合对照品储备液，稀释2、4、10、100倍，共得5种不同质量浓度的对照品溶液，按3）项下色谱条件进行分析测定。以对照品质量浓度X （mg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。绿原酸：y=17189817.35x-70582.10，R2=0.9992，线性范围为0.0032-0.3156 mg/mL；异绿原酸C：y=23136040.07x-98683.70，R2=0.9992，线性范围为0.0022-0.2237 mg/mL；芒柄花苷：y=63676091.44x-4503.78，R2=0.9997，线性范围为0.0003-0.0319 mg/mL；牛蒡苷：y=1384168.73x-16712.28，R2=0.9999，线性范围为0.0492-4.9210 mg/mL；毛蕊异黄酮：y=76565282.95x-284.77，R2=0.9996，线性范围为0.0005-0.0459 mg/mL；牛蒡苷元：y=2113187.09x-3977.21，R2=0.9998，线性范围为0.0050-0.5047 mg/mL；芒柄花素：y=79305756.55x+29452.96，R2=0.9991，线性范围为0.0002-0.0237 mg/mL，见图6。
精密吸取同一供试品溶液10μL，按上述液相条件进液相分析，测得各色谱峰面积的RSD均小于2.88%（n=5），表明仪器精密度良好。结果见图7。
取一批芪蒡颗粒按照供试品溶液制备条件平行制备5份，按上述液相条件进液相分析，测得各色谱峰面积的RSD均小于2.72%，表明方法重复性良好。结果见图8。
精密吸取同一供试品溶液10μL，按上述液相条件在0、4、8、12、24h分别测定，测得各色谱峰面积的RSD均小于2.90%，表明供试品溶液在24小时内稳定。结果见图9
取同一批芪蒡颗粒5份，研磨，每份约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，提取，过滤加入适量的对照品，定容至25mL容量瓶内，过0.45μm滤膜，按上述液相条件进液相分析，RSD为1.36%-3.36%（n=5），表明测定方法具有一定的准确性。结果见图10。
实施例6
一种芪蒡颗粒的质量检测方法，指纹图谱检测方法为：
1）对照品溶液的制备，精密称取绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素对照品适量，置于5mL的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得混合对照品贮备溶液，质量浓度分别为0.32、0.22、0.03、4.92、0.05、0.50、0.02 mg/mL。
2）供试品溶液的制备，取10个批次的芪蒡颗粒，分别研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75%甲醇25mL，超声（150W，40kHZ）提取15min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，过0.45μm滤膜，得供试品溶液，进液相分析；
3）色谱条件：色谱柱：kromasil 100-5-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-乙腈（16:84，B相）-0.1%甲酸水（A相）；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于1500。梯度洗脱，程序如下：
| 时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 79 | 21 |
| 20 | 76 | 24 |
| 25 | 76 | 24 |
| 30 | 72 | 28 |
| 37 | 60 | 40 |
| 42 | 57 | 43 |
| 47 | 55 | 45 |
| 52 | 60 | 40 |
| 67 | 90 | 10 |
| 70 | 90 | 10 |
4） 测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，色谱图与对照品进行比对，指认出峰1为绿原酸，峰2为异绿原酸C，峰3为芒柄花苷，峰4为牛蒡苷，峰5为毛蕊异黄酮，峰6为牛蒡苷元，峰7为芒柄花素，结果见图11，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”对10个批号的芪蒡颗粒的指纹图谱进行分析，以编号S3芪蒡颗粒的指纹图谱作为参照图谱，生成10批次样品的对照指纹图谱。结果显示：10批次芪蒡颗粒与对照指纹图谱相似度均大于0.9，具有良好的相似性，结果见图12。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (2)
1.一种芪蒡颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括对芪蒡颗粒的定性与定量检测，具体为黄芪中黄芪甲苷、炒牛蒡子中牛蒡苷的薄层鉴别，绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素的含量测定与指纹图谱检测和指纹图谱共有峰的指认；
所述黄芪中黄芪甲苷的薄层鉴别包括以下步骤：
取本品1.0g，研细，加甲醇25mL，超声处理30min，过滤，蒸干，残渣加入10mL10％氨水(V/V)溶解；将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次；合并萃取液，蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，得芪蒡颗粒供试品溶液；
取黄芪对照药材1.0g，加甲醇25mL，超声处理30min，过滤，蒸干，残渣加入10mL10％氨水(V/V)溶解；将溶液移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次；合并萃取液，蒸干，残渣加入2mL甲醇溶解，得黄芪对照药材溶液；
取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的对照品溶液得到黄芪甲苷对照品溶液；
按处方中的比例和制备工艺制成缺黄芪的空白颗粒，同供试品溶液的制备方法制得缺黄芪的阴性对照溶液；
按照薄层色谱法，吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:4:0.5)为展开剂，预平衡30min，上行展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇，105℃下烘烤约3min至斑点显色清晰。置日光灯与紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱，显相同淡紫色斑点；
所述炒牛蒡子中牛蒡苷的薄层鉴别包括以下步骤:
取颗粒1.0g，研细，加75％甲醇25mL，超声处理15min，过滤，蒸干，加入甲醇2mL溶解，得芪蒡颗粒供试品溶液；
取牛蒡子对照药材0.5g，研细，加75％甲醇25mL，超声处理15min，过滤，蒸干，加入甲醇2mL溶解，得牛蒡子对照药材溶液；
取牛蒡苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的对照品溶液得到牛蒡苷对照品溶液；
按处方中的比例和制备工艺制成缺牛蒡子的空白颗粒，同供试品溶液的制备方法制得缺牛蒡子的阴性对照溶液；
按照薄层色谱法，吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10:2)为展开剂，预平衡30min，上行展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇，105℃下烘烤约3min至斑点显色清晰，置日光灯下检视，在与对照品色谱相应的位置上，显相同淡紫色斑点；
所述绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素的含量测定方法为：
1)对照品溶液的制备，精密称取绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素对照品适量，置于5mL的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得混合对照品贮备溶液，质量浓度分别为0.32、0.22、0.03、4.92、0.05、0.50、0.02mg/mL；
2)供试品溶液的制备，取芪蒡颗粒一袋，研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75％甲醇25mL，超声提取15min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，过0.45μm滤膜，得供试品溶液，进液相分析；
3)色谱条件：色谱柱：kromasil 100-5-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-乙腈(16:84，B相)-0.1％甲酸水(A相)；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于1500；梯度洗脱，程序如下：
4)标准曲线的制备，精密吸取一定体积的混合对照品储备液，稀释2、4、10、100倍，共得5种不同质量浓度的对照品溶液，按3)项下色谱条件进行分析测定；以对照品质量浓度X(mg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程；绿原酸：y＝17189817.35x-70582.10，R2＝0.9992，线性范围为0.0032-0.3156mg/mL；异绿原酸C：y＝23136040.07x-98683.70，R2＝0.9992，线性范围为0.0022-0.2237mg/mL；芒柄花苷：y＝63676091.44x-4503.78，R2＝0.9997，线性范围为0.0003-0.0319mg/mL；牛蒡苷：y＝1384168.73x-16712.28，R2＝0.9999，线性范围为0.0492-4.9210mg/mL；毛蕊异黄酮：y＝76565282.95x-284.77，R2＝0.9996，线性范围为0.0005-0.0459mg/mL；牛蒡苷元：y＝2113187.09x-3977.21，R2＝0.9998，线性范围为0.0050-0.5047mg/mL；芒柄花素：y＝79305756.55x+29452.96，R2＝0.9991，线性范围为0.0002-0.0237mg/mL；
所述指纹图谱检测方法为：
(1)对照品溶液的制备，精密称取绿原酸、异绿原酸C、芒柄花苷、牛蒡苷、毛蕊异黄酮、牛蒡苷元、芒柄花素对照品适量，置于5mL的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得混合对照品贮备溶液，质量浓度分别为0.32、0.22、0.03、4.92、0.05、0.50、0.02mg/mL；
(2)供试品溶液的制备，取10个批次的芪蒡颗粒，研细，精密称定1.0g，置于锥形瓶中，加入75％甲醇25mL，超声(150W，40kHZ)提取15min，取出，放冷，过滤，定容至25mL容量瓶中，过0.45μm滤膜，得供试品溶液，进液相分析；
(3)色谱条件：色谱柱：kromasil 100-5-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-乙腈(16:84，B相)-0.1％甲酸水(A相)；流速：0.6mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于1500；梯度洗脱，程序如下：
(4)测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
2.一种芪蒡颗粒的制备方法，包括步骤如下：
步骤一：原料准备：黄芪、炒牛蒡子；原料按照重量份数是：牛蒡子12份，炒牛蒡子12份，步骤一中牛蒡子为炒牛蒡子，将生牛蒡在锅温180℃-200℃时下药，保持温度155℃-165℃，炒制8min-10min，得炒牛蒡子；
步骤二：醇提取：将步骤一中的原料混合并加入体积比为10-30的55％-95％的乙醇溶液，乙醇浸提的温度为85-95℃，提取1-3次，每次提取时间为30min-2h，用纱布过滤，弃滤渣，合并提取液；
步骤三：收膏：将步骤二提取的提取液减压浓缩至生药浓度为0.9-1.2的浸膏，减压浓缩中真空度为-0.1-0.08Mpa，温度为60℃；
步骤四：制备浸膏粉；使用真空干燥浸膏，研磨，并过120目筛，得到干浸膏粉，真空干燥机为FD-1B-50，温度设置为60℃，真空度为-0.1-0.08Mpa；
步骤五：制粒；向干浸膏粉中加入糊精，加入85％-无水乙醇作为润湿剂，用20目筛进行湿法制粒，整粒后放入50℃，干燥3h得到芪蒡颗粒，干浸膏进行研磨，过120目筛进行制粒；干浸膏粉的制备是糊精重量比为3:7，进行湿法制粒，整理，将得到的颗粒进行烘干。
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