CN111505196A - 大建中汤物质基准的质量控制方法 - Google Patents

大建中汤物质基准的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种大建中汤物质基准的质量控制方法，包括确立制备工艺和建立质量评价体系。首先在遵循古法的基础上对大建中汤及物质基准制备条件进行筛选比较，确定了其制备工艺。大建中汤中各味饮片经过煎煮、过滤、浓缩、干燥得到大建中汤物质基准。在此基础上，建立大建中汤物质基准的质量属性研究方法。大建中汤物质基准质量控制采用薄层色谱鉴别、含量测定、指纹图谱方法相结合。本发明建立了全面控制大建中汤物质基准的质量评价体系，为大建中汤复方制剂的合理开发应用提供了研究基础。

Description

大建中汤物质基准的质量控制方法
技术领域
本发明涉及药品质量控制领域，具体地说，涉及大建中汤物质基准的质量控制方法。
背景技术
大建中汤出自张仲景的《金匮要略》，由蜀椒(去汗)、干姜、人参组成。主治中阳虚衰、阴寒内盛证，有温中补虚，散寒降逆的功效。大建中汤具有广泛的临床应用价值，一直被医家认为是治疗脾胃虚寒腹满痛的典型方剂，主要治疗由脾胃阳衰、阴寒内盛引起的脘腹疼痛。大建中汤较擅长治疗中焦虚寒证，也可用于治疗阳虚寒甚虫动证。大建中汤被列入首批公布的经典名方100首中，表明其具有较高的开发应用价值。
大建中汤是以“建中法”哲学思想创建方药体系三首方中的一首。张仲景在用药物调治疾病时，时时注意养护脾胃，除重视药物配伍外，均配合粥来治疗。而现代人生活节奏快、忙碌紧张，临床中脾胃相关疾病患者也日益增多，建中系列方在调理中焦脾胃中被广泛应用，已形成较为独立的治疗大法。
大建中汤在《金匮要略》中已有煎煮、服用方法，但由于现代和汉代的计量单位存在较大的差异，现代的称量参数、煎煮参数均不明确，且《中国药典》中只有单味药的检测方法，其复方(汤剂及物质基准)尚无源于传统制法且符合现代制备技术的制备方法，缺乏客观的复方(汤剂及物质基准)质量评价体系。
专利文献CN103237899A，公开日2013.08.07，公开了一种大建中汤的生物测定方法及使用该方法的质量管理方法。所述大建中汤的生物测定方法是在培养的产生血清素的细胞中添加含有大建中汤的受试试样，接着，测定培养上清中的血清素含量。所述大建中汤制剂的质量管理方法是通过所述生物测定方法在相同条件下对作为大建中汤其临床上的药理效果已得到认可的参比制剂与受试制剂评价药理活性，评价参比制剂与受试制剂的等效性。
期刊文献(李响,孙耀志,高松,等.大建中汤颗粒质量标准研究[J].中医学报,2013,28(12):1867-1869.)公开了一种大建中汤颗粒的质量标准。方法：采用薄层色谱法对大建中汤颗粒中的人参进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法对人参中的人参皂苷Rg1、Re、Rb1进行含量测定。
然而目前未见如本发明的大建中汤物质基准的质控方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供大建中汤物质基准的质控方法，为经典名方大建中汤复方制剂开发提供可靠的质量属性的研究方法和评价体系。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种大建中汤物质基准的质量控制方法，包括以下步骤：
步骤S1，建立待测大建中汤物质基准的指纹图谱，其中色谱条件为：流动相0.2％磷(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序为：
Figure BDA0002536047670000021
检测波长：210nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，进样量：5μl，色谱柱：waters C18色谱柱；
步骤S2，确定待测大建中汤物质基准的指纹图谱是否包含以下色谱峰，判断待测大建中汤质量是否合格：
Figure BDA0002536047670000022
注：以下平均保留时间/保留时间的单位均为min
作为一个优选例，进一步确定待测大建中汤物质基准的指纹图谱是否包含以下色谱峰：
Figure BDA0002536047670000023
Figure BDA0002536047670000031
作为另一优选例，在建立待测大建中汤物质基准的指纹图谱的过程中，将待测大建中汤浸膏粉按照以下方法制备成待测溶液：取大建中汤浸膏粉2g，精密称定，加入70％乙醇20ml，超声(频率35kHz，功率250w)30min，滤过，测定。
作为另一优选例，在建立待测大建中汤物质基准的指纹图谱的过程中，混合对照品溶液制备方法为：取芦丁、金丝桃苷、人参皂苷Rg1、6-姜辣素适量，加甲醇溶解。
作为另一优选例，还包括测定待测大建中汤浸膏粉中人参皂苷含量的步骤，测定的色谱条件：流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，具体梯度如下：
Figure BDA0002536047670000041
检测波长为203nm；柱温为35℃；流速1.0ml/min；进样量10μl；色谱柱WatersSymmetryShield C18(250mm×4.6mm，5μm)；
待测溶液制备方法为：取待测大建中汤浸膏粉2g，精密称定，加入甲醇20ml，超声(35kHz，100w)1h，滤过，即得；其中浸膏粉与甲醇加入量的比例为：2g:20ml。
作为另一优选例，还包括测定待测大建中汤浸膏粉中6-姜辣素含量的步骤，测定的色谱条件：流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～35min，38％～39％B；35～40min，39％～90％B。柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；进样量20μl；色谱柱Kromasil100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)；
待测溶液制备方法为：取待测大建中汤浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇20ml，称重，超声(频率35kHz，功率250w)45min，放冷，称重，用75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得；其中浸膏粉与甲醇加入量的比例为：1g:20ml。
作为另一优选例，还包括测定待测大建中汤浸膏粉中芦丁和金丝桃苷含量的步骤，测定的色谱条件：采用Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相为0.3％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～40min，14％～16％B；40～41min，16％～90％B；41～50min，90％B；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：256nm；进样量：5μl；
待测溶液制备方法为：取待测大建中汤的浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇30ml，称重，超声(频率35kHz，功率250w)30min，放置室温，称重，用75％甲醇补足减失的重量，0.22μm滤膜滤过，即得；其中浸膏粉与甲醇加入量的比例为：1g:30ml。
作为另一优选例，还包括人参薄层色谱鉴别的步骤，具体为：
供试品溶液制备：取浸膏粉1g，加水饱和正丁醇10ml，超声处理(频率35kHz，功率250w)30min，滤过，滤液加入3倍量氨试液，振摇提取，静置，分取上层溶液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，即得；同法制备人参空白溶液及人参对照药材溶液；
吸取上述三种溶液各5μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)的﹣20℃放置的下层液进行展开，取出，晾干后喷10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热显色，分别于日光灯和紫外灯(365nm)下进行观察，在药材色谱相应的位置上，供试品色谱显示相同颜色的斑点或荧光斑点，且人参空白溶液无干扰，则质量合格。
作为另一优选例，还包括干姜、花椒薄层色谱鉴别的步骤，具体为：
供试品溶液制备：取待测大建中汤浸膏粉1g，加乙酸乙酯20ml，超声处理(频率35kHz，功率250w)30min，过滤，滤液蒸干，残渣加0.5ml甲醇溶解，即得；同法制备干姜空白、花椒空白溶液；取干姜、花椒粉末0.5g，同法制成药材溶液；
吸取上述溶液5种溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2:1:1)进行展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸试液，105℃加热至显色清晰观察，供试品色谱中，在药材色谱相应位置上存在相同颜色斑点，且阴性无干扰，则质量合格。
本发明优点在于：
1、2015版《中国药典》中未收载花椒中相关成分的含量测定方法，经文献查阅，花椒中含有黄酮类成分，以芦丁、金丝桃苷等为主，故本专利同时测定花椒中芦丁和金丝桃苷的HPLC的方法，填补了现行版药典中缺乏对花椒主成分含量测定的空白。
2、从药材→饮片→大建中汤→物质基准薄层色谱鉴别中均有对应的特征斑点，为物质基准中的特征成分溯源到药材提供了依据，通过含量测定证实了药材→饮片→大建中汤→物质基准间具有一定的相关性。
3、建立大建中汤物质基准的特征图谱，弥补了单一成分无法反映整体复方的缺点，从整体上评价大建中汤物质基准的内在化学物质的种类及其含量。
4、本发明所建立的质量评价方法的精密度、稳定性及重复性均良好。
5、本专利以大建中汤为研究对象，按照《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》、《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求(征求意见稿)》等文件的技术要求，建立大建中汤物质基准的制备和质量评价体系研究，为该复方制剂的合理开发应用提供了研究工作基础。
附图说明
图1.大建中汤物质基准中人参鉴别的薄层色谱图。
图2.大建中汤物质基准中干姜、花椒鉴别的薄层色谱图。
图3.不同波长下检测大建中汤的指纹图谱。
图4.不同柱温下检测大建中汤的指纹图谱。
图5.不同流速下检测大建中汤的指纹图谱。
图6.大建中汤物质基准的不同提取方法的色谱图。
图7.大建中汤物质基准的不同超声提取时间的色谱图。
图8.大建中汤物质基准的不同浓度甲醇超声提取的色谱图。
图9.混合标准品对照色谱图。
图10.大建中汤及各阴性样品的指纹图谱。
图11.大建中汤的对照指纹图谱。
图12.大建中汤物质基准的对照指纹图谱。
图13.15批大建中汤的指纹图谱叠加图。
图14.15批大建中汤物质基准的指纹图谱叠加图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1.大建中汤物质基准制备
1.1大建中汤
1.1.1药材产地、剂量、炮制
人参产地选用吉林、黑龙江，花椒产地选取四川、甘肃、陕西三个省份，而干姜产地则选用云南和山东；参考“经典名方古今剂量折算原则专家共识”，大建中汤用药剂量蜀椒一合折合为4.2g；处方中蜀椒为去汗，根据查阅的文献资料，蜀椒为去除枝、柄及椒目后进行微炒，有香味散出，表面出油即可。
1.1.2大建中汤剂制备
称取干姜12g，人参6g，花椒8.4g于煎药砂锅中，加水800ml，浸泡40min，煎煮7min(1200w，160℃)，半开盖，保持微沸1h(500w，100℃)，100目筛滤过，滤液继续保持微沸0.5h，至体积300ml，得大建中汤剂。
1.1.3得膏率测定
取大建中汤20ml，每批各3份，共15批，置于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后放烘箱中，105℃中烘3h至恒重，称定重量，计算得膏率。15批大建中汤的得膏率在23％～32％之间，平均得膏率为27.17％，RSD为9.98％。
1.2物质基准
1.2.1真空干燥
取步骤1.1.2所得药液，真空度为-0.1Mpa，在65℃以下浓缩至适量，置于真空干燥箱中进行干燥，得浸膏粉，即为物质基准。
从汤剂到物质基准人参皂苷Rg1和Re之和的转移率在53.64-93.68％之间，均值为73.69％，未出现51.58-95.80％之外的离散值；人参皂苷Rb1转移率在54.13-92.34％之间，均值为72.58％，未出现50.80-94.35％以外的离散值。6-姜辣素的转移率在14.03-22.43％之间，均值为18.50％，未出现12.95-24.06％以外的离散值。芦丁的转移率在24.55-37.16％之间，均值为29.85％，未出现20.89-38.80％以外的离散值；金丝桃苷转移率在20.71-35.99％之间，均值为28.98％，未出现20.29-37.68％离散值。
1.2.2冷冻干燥
取步骤1.1.2所得药液于恒重的容器中，密封，放入-80℃冰箱中冷冻过夜，取出，放入冻干机(真空度为1.0mbar，隔热板加热温度为15℃)中干燥24h。
从汤剂到物质基准人参皂苷Rg1和Re之和的转移率在55.88-96.46％之间，均值为74.80％，未出现52.36-97.24％以外的离散值；人参皂苷Rb1转移率在52.41-88.70％之间，均值为68.46％，未出现47.92-89.00％以外的离散值。6-姜辣素的转移率在20.04-33.68％之间，均值为26.87％，未出现18.87-34.93％以外的离散值。芦丁的转移率在56.21-86.76％之间，均值为67.73％，未出现44.41-88.05％以外的离散值；金丝桃苷的转移率在49.96-86.84％之间均值为70.77％，未出现49.54-92.00％以外的离散值。
1.2.3干燥方式选择
冷冻干燥后物质基准中芦丁、金丝桃苷、6-姜辣素的转移率较真空干燥高，人参皂苷转移率接近。冷冻干燥条件下易受温度影响的成分含量升高，但考虑到后期工业化生产的可实施性，选用真空干燥。
2.大建中汤物质基准的质量属性研究
采用薄层鉴别、含量测定、指纹图谱进行质量属性研究，建立质量控制方法。
2.1薄层鉴别
2.1.1人参薄层色谱鉴别
供试品溶液制备：取浸膏粉1g，加水饱和正丁醇10ml，超声处理(频率35kHz，功率250w)30min，滤过，滤液加入3倍量氨试液，振摇提取，静置，分取上层溶液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，即得。同法制备人参空白溶液及人参对照药材溶液。吸取上述三种溶液各5μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)的﹣20℃放置的下层液进行展开，取出，晾干后喷10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热显色。分别于日光灯和紫外灯(365nm)下进行观察，在药材色谱相应的位置上，供试品色谱显示相同颜色的斑点或荧光斑点，且人参空白溶液无干扰。结果见图1。
注：从左到右依次为人参对照药材(左起第一列薄层色谱)、人参阴性(左起第二列薄层色谱)、物质基准(左起第三～七列薄层色谱)。
2.1.2干姜、花椒薄层色谱鉴别
供试品溶液制备：取上述浸膏粉1g，加乙酸乙酯20ml，超声处理(频率35kHz，功率250w)30min，过滤，滤液蒸干，残渣加0.5ml甲醇溶解，即得。同法制备干姜空白、花椒空白溶液。取干姜、花椒粉末0.5g，同法制成药材溶液。吸取上述5种溶液各3μl，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2:1:1)进行展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸试液，105℃加热至显色清晰观察。供试品色谱中，在药材色谱相应位置上存在相同颜色斑点，且阴性无干扰。结果见图2。
注：从左到右依次为花椒药材(A和B中左起第一列薄层色谱)、干姜药材(A和B中左起第二列薄层色谱)、花椒阴性(A和B中左起第三列薄层色谱)、干姜阴性(A和B中左起第四列薄层色谱)、物质基准1-12批(A中左起第五～十六列薄层色谱)/13-15批(B中左起第五～七列薄层色谱)。
2.2含量测定
大建中汤处方主要由人参、干姜、花椒3味中药组成，经过煎煮提取后，各饮片中的各种成分依据其理化性质，一定程度地溶出并分散于汤液中，汤剂作为物质基准的中间体，其质量属性影响到物质基准的质量属性。现参考2015版《中国药典》及相关文献，建立汤剂中人参皂苷、6-姜辣素、芦丁及金丝桃苷的含量测定方法，以期对汤剂及物质基准的质量控制提供依据。
2.2.1人参皂苷含量测定
2.2.1.1色谱条件
大建中浸膏粉中人参皂苷含量测定色谱条件：流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，具体梯度见表1；检测波长为203nm；柱温为35℃；流速1.0ml/min；进样量10μl；色谱柱Waters SymmetryShield C18(250mm×4.6mm，5μm)。见表1。
表1.梯度洗脱表
Figure BDA0002536047670000081
2.2.1.2溶液制备
对照品溶液制备：分别精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，甲醇溶解使人参皂苷Rg1、Re、Rb1浓度分别为1.104mg/ml、1.014mg/ml、1.158mg/ml。
供试品溶液制备：对于浸膏粉中人参皂苷含量提取条件进行筛选，考虑到浸膏粉中人参皂苷含量相对较低，选择称取2g(相当于人参药材0.5g)。
(1)提取溶剂筛选
在2015版《中国药典》一部，人参药材提取为水饱和正丁醇超声提取，现对提取溶剂进行选择。
精密称定浸膏粉2g，分别加入20ml水饱和正丁醇、甲醇、70％甲醇，超声(频率35kHz，功率250w)0.5h，甲醇、70％甲醇提取液滤过，即得，水饱和正丁醇蒸干，20ml甲醇溶解，滤过，即得。结果如下，见表2。
表2.提取溶剂选择结果
Figure BDA0002536047670000091
结果表明以甲醇作为提取溶剂提取的三种成分含量最高，且操作方便，故选择甲醇作为提取溶剂。
(2)提取时间选择
精密称定浸膏粉2g，加入20ml甲醇，分别超声(频率35kHz，功率250w)30、45、60min，滤过，按上述色谱条件进行分析，结果见表3。
表3.提取时间考察结果
Figure BDA0002536047670000092
结果表明超声提取1h含量最高，所以选择超声振荡提取时间1h。
供试品溶液制备：取浸膏粉2g，精密称定，加入20ml甲醇，超声(35kHz，100w)1h，滤过，即得。
2.2.1.3人参皂苷含量测定方法学考察
(1)线性关系考察
分别精密吸取上述对照品溶液适量至同一5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得含240μg/ml Rg1、220μg/ml Re和160μg/ml的对照品溶液。稀释后，得一系列浓度的混标，进行分析。以峰面积为y轴，浓度为x轴，进行线性回归，计算回归方程。人参皂苷Rg1、Re、Rb1分别为y＝3.144x+1.432，R2＝0.9999；y＝2.547x+7.542，R2＝0.9996；y＝2.139x+0.4837，R2＝0.9999，表明在所设定的浓度范围内线性关系良好。
(2)精密度考察
精密吸取含60μg/ml Rg1、55μg/ml Re和40μg/ml的对照品溶液，连续进样6次，根据峰面积计算RSD值。人参皂苷Rg1、Re、Rb1分别为0.18％、0.08％、0.27％，表明仪器精密度良好。
(3)重复性考察
按照上述供试品制备方法制备6份样品，进行测定分析，计算RSD值。结果见表4。
表4.重复性考察结果
Figure BDA0002536047670000101
结果表明供试品的重复性较好。
(4)加样回收率试验
根据重复性结果，按照1:1的量加入对照品，进行测定分析。人参皂苷Rg1、Re、Rb1平均回收率分别为96.80％、103.00％、91.42％，均在药典所规定的范围内(85-110％)。
(5)稳定性考察
分别于0、2、4、8、12、24、36、48h进样，计算人参皂苷Rg1、Re、Rb1峰面积RSD值分别为1.97％、1.50％、1.88％，表明供试品溶液在48h内稳定。
(6)专属性试验
按照上述供试品溶液制备方法制备人参空白浸膏粉溶液，进样测定分析，并与供试品溶液、对照品溶液进行比对，表明阴性无干扰。
(7)检测限和定量限
经过浓度摸索，人参皂苷Rg1、Re、Rb1的检测限分别为0.3929μg/ml、0.1097μg/ml、0.5514μg/ml，定量限为1.257μg/ml、0.7682μg/ml、0.9630μg/ml。
(8)系统耐用性试验
①柱温考察
取同一供试品溶液分别在25、30、35℃下进样分析，记录色谱图，结果表明，柱温35℃时基线相对于其他两个温度较平，且分离效果较好，选择35℃作为分析测定的柱温。
②流速考察
取同一供试品溶液分别在0.8、1.0、1.2ml/min下进样分析，记录色谱图，结果表明，流速为0.8ml/min时分析时间较长，流速为1.2ml/min时分离效果较差，选用1.0ml/min作为测定分析的流速。
2.2.2 6-姜辣素含量测定
2.2.2.1色谱条件
色谱条件：流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～35min，38～39％乙腈；35～40min，39％～90％B。柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；进样量20μl；色谱柱Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)。
2.2.2.2溶液制备
对照品溶液制备：取6-姜辣素标准品适量于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得6-姜辣素浓度为2.248μg/ml。
供试品溶液制备：为了准确、高效的测定浸膏粉中6-姜辣素的含量，对浸膏粉的处理方法进行考察。
2015版《中国药典》中干姜项下6-姜辣素含量测定时，所选用溶剂为75％甲醇，所以本实验参考药典方法同样选择75％甲醇作为提取溶剂，现对提取方法、提取时间、溶剂用量进行考察，以优化提取方法。
(1)提取方法考察
超声提取：取浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇20ml，称定重量，超声提取(频率35kHz，功率250w)30min，放凉，称重，75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。
回流提取：取浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇20ml，称定重量，80℃加热回流30min，放冷，称重，75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。结果见表5。
表5.提取方法比较结果
Figure BDA0002536047670000111
以上结果表明两种提取方法比较，6-姜辣素含量无明显差异，但超声提取操作简便，选择超声作为其提取方法。
(2)提取时间考察
取浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇20ml，称重，分别超声(频率35kHz，功率250w)30min、45min、1h，放凉，称重，用75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。结果见表6。
表6.提取时间考察结果
Figure BDA0002536047670000121
结果表明：超声45min和1h提取差异不明显，为节省时间，选择超声提取45min。
(3)提取溶剂量考察
取浸膏粉1g，精密称定，分别加入75％甲醇20、30、40ml，称重，分别超声(频率35kHz，功率250w)45min，放凉，称重，用75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。结果见表7。
表7.提取溶剂用量考察结果
Figure BDA0002536047670000122
结果表明加入75％甲醇20ml时提取较完全，选择20ml 75％甲醇。
供试品溶液制备：取浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇20ml，称重，超声(频率35kHz，功率250w)45min，放冷，称重，用75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。
2.2.2.3 6-姜辣素含量测定方法学考察
(1)线性关系考察
取上述2.248mg/ml的6-姜辣素标准品溶液1.05ml于5ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，得浓度为240.45μg/ml对照品溶液。采取对半稀释法，对其进行稀释，得到120.22μg/ml、60.11μg/ml、30.06μg/ml、15.03μg/ml、7.51μg/ml、3.76μg/ml一系列浓度的标准品溶液，按照2.2.2.1中所述色谱条件进行液相分析。以浓度作为x轴，峰面积作为y轴，进行线性回归，计算回归方程及R2值。回归方程为y＝5.5834x-3.7432，R2为0.9999。
(2)精密度考察
取浓度为30.056μg/ml的6-姜辣素对照品溶液按照2.2.2.1中所述色谱条件连续进样7针，计算相对标准偏差为0.12％，表明仪器精密度良好。
(3)重复性考察
称取浸膏粉1g 6份，精密称定，按照2.2.2.2中供试品溶液制备方法制备，参照2.2.2.1中所述色谱条件进行测定，结果见表8。
表8.重复性考察结果
Figure BDA0002536047670000131
结果表明该方法重复性良好。
(4)稳定性考察
取上述供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24、36、48h按2.2.2.1中所述色谱条件进行检测，计算RSD值为2.67％，表明供试品溶液在48h内稳定性良好。
(5)加样回收率试验
取浸膏粉适量6份，精密称定，按照约1:1的量加入6-姜辣素适量，以2.2.2.2中供试品溶液制备方法制备，参照2.2.2.1中所述色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表9。表9.加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0002536047670000132
注：回收率＝(测得量-原有量)/加入量×100％
结论：平均回收率为91.38％，符合《中国药典》(四部)通则9101中回收率限度85～110％要求。
(6)专属性试验
干姜阴性溶液制备：取干姜阴性浸膏粉1g，精密称定，按照2.2.2.2中供试品溶液制备方法制备，进样分析测定。结果表明干姜空白溶液对测定6-姜辣素没有影响，专属性较好。
(7)检测限和定量限
对6-姜辣素的浓度进行摸索，以11-12min为噪声范围，浓度为0.2627μg/ml信噪比为3时即为检测限，0.8349μg/ml时信噪比为10时，即为定量限。
(8)耐用性考察
①柱温考察
分别考察柱温为25、30、35℃时对图谱的影响，结果表明30℃的时候分离效果最佳。
②流速考察
分别考察流速为0.8、1.0、1.2ml/min对图谱的影响，结果表明流速为1.0ml/min，6-姜辣素分离效果较好，且分析时间也较短。
2.2.3芦丁和金丝桃苷含量测定
2.2.3.1色谱条件
采用Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相为0.3％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～40min，14％～16％B；40～41min，16％～90％B；41～50min，90％B；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：256nm；进样量：5μl。
2.2.3.2溶液制备
对照品溶液配制：取芦丁对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为1.07mg/ml的芦丁对照品溶液。
取金丝桃苷对照品适量，精密称定，于10ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，得1.04mg/ml的金丝桃苷对照品溶液。
供试品溶液制备：为使浸膏粉中被测试的芦丁和金丝桃苷成分提取尽量完全，现对浸膏粉的提取方法进行筛选。
(1)提取方法考察
超声提取：取浸膏粉1g，精密称定，加75％甲醇20ml，称重，超声(频率35kHz，功率250w)30min，称重，75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。
回流提取：取浸膏粉1g，精密称定，加75％甲醇20ml，称重，80℃水浴加热30min，放冷，75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。按照上述色谱条件进样分析，结果见表10。
表10.提取方法考察结果
Figure BDA0002536047670000151
两种提取方法差异不明显，选择超声作为浸膏粉中芦丁和金丝桃苷含量测定的方法。
(2)提取时间考察
样品制备方法同上述2.2.3.2溶液制备，不同提取时间对芦丁和金丝桃苷的影响，结果见表11。
表11.提取时间考察结果
Figure BDA0002536047670000152
上述结果表明，三种提取时间对两种成分提取影响不大，为了节省时间，选取30min作为提取时间。
(3)提取溶剂用量考察
取浸膏粉1g，精密称定，分别加入20、30、40ml的75％甲醇，称重，分别超声(频率35kHz，功率250w)30min，放冷，称重，用75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得。结果见表12。
表12.提取溶剂用量考察结果
Figure BDA0002536047670000153
结果表明三种不同溶剂用量对两种成分提取影响不大，选择30ml作为本次提取的溶剂量。
(4)提取溶剂考察
取浸膏粉1g，精密称定，分别加入30ml的甲醇、75％甲醇、50％甲醇，称重，分别超声(频率35kHz，功率250w)30min，放冷，称重，用对应浓度甲醇补足减失的重量，滤过，即得。结果见表13。
表13.提取溶剂考察结果
Figure BDA0002536047670000161
结果表明75％甲醇提取较完全，选用75％甲醇作为提取溶剂。
供试品溶液制备：取浸膏粉1g，精密称定，加入30ml的75％甲醇，称重，超声(频率35kHz，功率250w)30min，放置室温，称重，用75％甲醇补足减失的重量，0.22μm滤膜滤过，即得。
2.2.3.3芦丁和金丝桃苷含量测定方法学考察
(1)线性关系考察
取上述芦丁标准品溶液0.6ml置5ml容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，得浓度为128.2μg/ml的标准品溶液。取上述金丝桃苷标准品溶液1.25ml置于5ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，得361.5μg/ml的对照品溶液。上述两种对照品溶液按照1:1混匀，得混合对照品溶液。对其进行适当稀释，制备系列浓度混标溶液，其中芦丁浓度分别为：64.1、32.1、16、12、8、4、3μg/ml，金丝桃苷为180.2、90.1、45.05、33.75、22.5、11.25、8.44μg/ml。以峰面积为y轴，浓度为x轴进行线性回归，计算回归方程和R2值。芦丁标准曲线为y＝8.2207x-0.1339，R2为0.9998；金丝桃苷标准曲线为y＝13.526x+8.7233，R2为0.9999。
(2)精密度考察
取芦丁浓度12μg/ml、金丝桃苷33.75μg/ml的混标，按照2.2.3.1中色谱条件连续进样6次，根据芦丁和金丝桃苷峰面积计算相对标准偏差分别为1.13％、1.12％，表明仪器精密度良好。
(3)重复性考察
取浸膏粉1g，共6份，分别精密称定，按照上述2.2.3.2中溶液制备方法进行制备，按照2.2.3.1中色谱条件进行测定，并计算结果。结果见表14。
表14.重复性考察结果
Figure BDA0002536047670000162
结果表明试验操作和仪器测试重复性良好。
(4)稳定性考察
取上述供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24、36、48h按2.2.3.1中所述色谱条件进行检测，芦丁和金丝桃苷峰面积的RSD值分别为1.31％、2.81％，表明供试品溶液在48h内较稳定。
(5)加样回收率考察
取浸膏粉适量6份，精密称定，按照约1:1的量加入芦丁和金丝桃苷适量，以2.2.3.2中供试品溶液制备方法制备，参照2.2.3.1中所述色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表15、16。
表15.芦丁加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0002536047670000171
表16.金丝桃苷加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0002536047670000172
注：回收率＝(测得量-原有量)/加入量×100％
结果表明加样回收率符合《中国药典》(四部)通则9101下规定。
(6)专属性试验
花椒阴性溶液制备：取花椒阴性浸膏粉1g，精密称定，按照2.2.3.2中供试品溶液制备方法制备按照2.2.3.1色谱条件进行测定。结果表明，该方法具有较好的专属性，阴性无干扰。
(7)检测限和定量限
选择20-21min为噪声范围，对芦丁和金丝桃苷的浓度进行摸索，S/N＝3时即为检测限，S/N＝10时为定量限。芦丁浓度为0.3789μg/ml时信噪比为3，为检测限；浓度为1.268μg/ml时信噪比为10，为定量限。金丝桃苷浓度为0.2571μg/ml时信噪比为3，为检测限；浓度为0.7988μg/ml时信噪比为10，为定量限。
(8)耐用性考察
①柱温考察
分别考察柱温为25、30、35℃时对图谱的影响，结果表明，柱温为30℃时金丝桃苷色谱峰后边干扰峰未分离完全，25℃时柱温偏低影响分析，所以选择35℃作为分析条件。
②流速考察
分别考察流速为0.8、1.0、1.2ml/min对图谱的影响，结果表明流速为1.2ml/min时芦丁峰之前存在干扰峰，且0.8ml/min时所用的分析时间相对较长，故选用1.0ml/min作为流动相流速。
2.3指纹图谱建立
2.3.1指纹图谱条件筛选
大建中汤物质基准指纹图谱的色谱条件与大建中汤相同(以下为大建中汤指纹图谱检测波长、柱温及流速的筛选过程)。
(1)波长选择
分别在210、220、230、254、268、275nm下检测，结果如图3。
比较不同波长下色谱图发现210nm下有更多色谱峰，且方中人参含有的人参皂苷主要在紫外末端吸收，所以选用210nm作为检测波长。
(2)柱温选择
同一供试品溶液分别在25、30、35℃下进行测定，结果见图4。
三种温度条件下，25℃时分离效果较差，选用最常用的30℃。
(3)流速选择
分别在0.8、1.0、1.2ml/min下检测，结果见图5。
三种流速比较，0.8ml/min时分析时间较长，1.2ml/min时柱压偏高，选用1.0ml/min。
(4)指纹图谱色谱条件
流动相0.2％磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，见表17。检测波长：210nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，进样量：5μl，色谱柱：waters C18色谱柱。
表17.梯度洗脱表
Figure BDA0002536047670000191
2.3.2物质基准供试品溶液的制备
(1)不同提取方法的比较
①超声处理：取浸膏粉2g，精密称定，加入70％甲醇20ml，超声((频率35kHz，功率250w)45min，过滤。
②回流处理：取浸膏粉2g，精密称定，加入70％甲醇20ml，加热回流45min，过滤。
③温浸处理：取浸膏粉2g，精密称定，加入70％甲醇20ml，65℃温浸45min，滤过，测定。结果见图6。
结果表明，不同处理方法对色谱图无明显影响，选择超声作为提取方法。
(2)不同超声提取时间的比较
取浸膏粉2g，精密称定，加入70％甲醇20ml，分别超声(频率35kHz，功率250w)30min、45min、60min，滤过，测定。结果见图7。
结果表明，不同超声提取时间对色谱图无明显影响，选择30min作为提取时间。。
(3)不同浓度甲醇超声提取的比较
取浸膏粉2g，精密称定，分别加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇20ml，超声(频率35kHz，功率250w)30min，滤过，测定。结果见图8。
结果表明，不同浓度甲醇超声提取对色谱图无明显影响，选择70％甲醇作为提取溶剂。
(4)物质基准供试品处理方法
取浸膏粉2g，平行3份，精密称定，分别加入70％甲醇20ml，超声提取(频率35kHz，功率250w)30min，滤过，测定。
2.3.3大建中汤物质基准的指纹图谱建立
2.3.3.1溶液制备
供试品溶液制备：见上述2.3.2(4)的供试品处理方法。
混合对照品溶液制备：取芦丁、金丝桃苷、人参皂苷Rg1，6-姜辣素适量，加甲醇溶解，即得。
空白溶液制备：取各味药材浸膏粉(与大建中汤中对应生药量同)，按照上述2.3.2(4)的供试品处理方法制备，即得。
2.3.3.2色谱条件
见上述2.3.1(4)。
2.3.4 15批大建中汤物质基准的指纹图谱分析
2.3.4.1参照峰及共有峰确定
混合标准品对照色谱图及阴性样品指纹图谱分别见图9、10。按照上述方法对15批物质基准进行检测，将色谱峰导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中，以S1作为参照，选择保留时间参数，时间亮度窗设为1，用平均数进行自动匹配，多点校正，生成物质基准的对照指纹图谱。结合本发明涉及的大建中汤及其物质基准，将二者对照指纹图谱(见图11、12)及二者的15批指纹图谱叠加图(见图13、14)。从二者的对照指纹图谱及叠加指纹图谱可知，从汤剂到物质基准，二者的化学成分的质量属性具有良好的一致性与相关性。
2.3.4.2色谱峰归属
通过分析物质基准相关对照图谱(图9、10、12、14)，可以得出：15批物质基准中有38个共有峰，其中1-23、28、35、37、38号来自花椒，29、30、33来自人参，24、25、27、31、34、36来自干姜，20号为芦丁，21为金丝桃苷、29为人参皂苷Rg1、30为人参皂苷Re、33为人参皂苷Rb1。具体分析结果见表18。
表18.大建中汤物质基准的38个共有峰信息
Figure BDA0002536047670000201
Figure BDA0002536047670000211
2.3.5大建中汤物质基准指纹图谱方法学考察
2.3.5.1精密度考察
取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录图谱，根据保留时间，计算相似度，相似度均在0.991以上，仪器精密度良好。见表19。
表19.精密度相似度计算
Figure BDA0002536047670000221
2.3.5.2重复性考察
分别制备6份供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定，记录图谱，根据保留时间，计算相似度，相似度均在0.981以上，重复性良好。见表20。
表20.重复性相似度计算
Figure BDA0002536047670000222
2.3.5.3稳定性考察
取同一份供试品溶液，分别在0、3.5、7、14、21、42、49h进样，计算相似度为0.990以上，样品在49h内稳定。见表21。
表21.稳定性相似度计算
Figure BDA0002536047670000223
2.3.6 15批大建中汤相似度评价
采用相似度评价软件对15批大建中汤相似度评价，相似度在0.964-0.988之间，相似度良好。见表22。
表22.15批物质基准相似度计算
Figure BDA0002536047670000231
以上实验结果表明：本发明的大建中汤物质基准的测定方法具有良好的精密度、稳定性、重复性，能初步反映大建中汤到物质基准在整体的化学特征及质量属性上的一致性和相关性，能反映大建中汤物质基准整体的质量属性信息，可以为后续大建中汤复方制剂的开发提供物质基准的质量参考信息。
需要说明的是，本发明在长期大量的实验研究中，做了大量关于色谱条件的研究实验，但不能在此一一赘述，以上仅以典型的实验作为说明。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，建立待测大建中汤物质基准的指纹图谱，其中色谱条件为：流动相0.2％磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序为：
Figure FDA0002536047660000011
检测波长：210nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，进样量：5μl，色谱柱：waters C18色谱柱；
步骤S2，确定待测大建中汤物质基准的指纹图谱是否包含以下色谱峰，判断待测大建中汤质量是否合格：
Figure FDA0002536047660000012
2.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，进一步确定待测大建中汤物质基准的指纹图谱是否包含以下色谱峰：
Figure FDA0002536047660000013
Figure FDA0002536047660000021
3.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，在建立待测大建中汤物质基准的指纹图谱的过程中，将待测大建中汤浸膏粉按照以下方法制备成待测溶液：取大建中汤浸膏粉2g，精密称定，加入70％甲醇20ml，超声(频率35kHz，功率250w)30min，滤过，测定。
4.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，在建立待测大建中汤物质基准的指纹图谱的过程中，混合对照品溶液制备方法为：取芦丁、金丝桃苷、人参皂苷Rg1、6-姜辣素适量，加甲醇溶解。
5.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，还包括测定待测大建中汤浸膏粉中人参皂苷含量的步骤，测定的色谱条件：流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，具体梯度如下：
Figure FDA0002536047660000031
检测波长为203nm；柱温为35℃；流速1.0ml/min；进样量10μl；色谱柱WatersSymmetryShield C18(250mm×4.6mm，5μm)；
待测溶液制备方法为：取待测大建中汤的浸膏粉2g，精密称定，加入20ml甲醇，超声(35kHz，100w)1h，滤过，即得；其中浸膏粉与甲醇加入量的比例为：2g:20ml。
6.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，还包括测定待测大建中汤浸膏粉中6-姜辣素含量的步骤，测定的色谱条件：流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～35min，38％～39％B；35～40min，39％～90％B；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；进样量20μl；色谱柱Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)；
待测溶液制备方法为：取待测大建中汤的浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇20ml，称重，超声(频率35kHz，功率250w)45min，放冷，称重，用75％甲醇补足减失的重量，滤过，即得；其中浸膏粉与甲醇加入量的比例为：1g:20ml。
7.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，还包括测定待测大建中汤浸膏粉中芦丁和金丝桃苷含量的步骤，测定的色谱条件：采用Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相为0.3％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～40min，14％～16％B；40～41min，16％～90％B；41～50min，90％B；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：256nm；进样量：5μl；
待测溶液制备方法为：取待测大建中汤的浸膏粉1g，精密称定，加入75％甲醇30ml，称重，超声(频率35kHz，功率250w)30min，放置室温，称重，用75％甲醇补足减失的重量，0.22μm滤膜滤过，即得；其中浸膏粉与甲醇加入量的比例为：1g:30ml。
8.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，还包括人参薄层鉴别的步骤，具体为：
供试品溶液制备：取大建中汤浸膏粉1g，加水饱和正丁醇10ml，超声处理(频率35kHz，功率250w)30min，滤过，滤液加入3倍量氨试液，振摇提取，静置，分取上层溶液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，即得；同法制备人参空白溶液及人参对照药材溶液；
吸取上述三种溶液各5μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)的﹣20℃放置的下层液进行展开，取出，晾干后喷10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热显色，分别于日光灯和紫外灯(365nm)下进行观察，在药材色谱相应的位置上，供试品色谱显示相同颜色的斑点或荧光斑点，且人参空白溶液无干扰，则质量合格。
9.根据权利要求1所述的大建中汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，还包括干姜、花椒薄层色谱鉴别的步骤，具体为：
供试品溶液制备：取待测大建中汤浸膏粉1g，加乙酸乙酯20ml，超声处理(频率35kHz，功率250w)30min，过滤，滤液蒸干，残渣加0.5ml甲醇溶解，即得；同法制备干姜空白、花椒空白溶液；取干姜、花椒粉末0.5g，同法制成药材溶液；
吸取上述溶液5种溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2:1:1)进行展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸试液，105℃加热至显色清晰观察，供试品色谱中，在药材色谱相应位置上存在相同颜色斑点，且阴性无干扰，则质量合格。
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