CN117214340B - 一种包含花椒的中药组合物的质量控制方法及其应用 - Google Patents
一种包含花椒的中药组合物的质量控制方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种包含花椒的中药组合物的检测方法,该检测方法包括如下步骤:取中药组合物供试品溶液和对照品溶液进行检测,其中,该中药组合物包括花椒、干姜、人参和胶饴糖,该对照品为6‑姜辣素,该检测的色谱条件为:采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱,流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种,流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液;根据检测结果,获得该中药组合物的成分信息,或者成分信息和含量信息。本发明对包含花椒的中药组合物的化学成分进行了全面系统地解析,为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种包含花椒的中药组合物的质量控制方法及其应用。
背景技术
根据《中华人民共和国中医药法》,古代经典名方是指“至今仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂”。古代经典名方在我国有着历史悠久、丰富的人用历史并应用至今,是历代医家临床实践精华的总结,承载着数千年来中医药灿烂文明的深厚积淀,是中医药理论经过几千年的锤炼,是历代临床经验的总结,是中医药伟大宝库中最精华的部分。对中药经典名方进行深入的研究与开发,是挖掘传统中医药宝库的一把金钥匙。中医药在经典名方的基础上筛选出有效方剂“三药三方”,如三方其中的清肺排毒汤是来自张仲景《伤寒杂病论》的经典名方组合。
中药经典名方汤剂作为传统的中医临床用药的最常用的剂型,具有组方合理、起效迅速、疗效显著、易于吸收等优点,深受广大患者的信赖。却因调配、携带、临时煎煮、久置容易发生霉败变质、汤液味苦和量大,以及标准难以统一,严重影响其临床疗效等缺点,不能适应现代人的生活要求。为了保持汤剂的优势,克服汤剂的种种不足,国家药品监督管理局药品审评中心于2021年08月31日发布的《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则(试行)》中明确指出按古代经典名方目录管理的中药复方制剂的质量应与经典名方基准样品的质量基本一致。基准样品代表了制剂的整体内在质量,除了成型工艺外,基准样品与制剂的其余质量控制指标均基本一致。因此基准样品是制剂内在质量的实物对照,是大生产工艺优化及其质量标准制定的参照物。基准样品是经典名方乃至所有中药研发的基准,是保证药物的安全性和有效性的对照物。经典名方复方制剂生产工艺路线制定、参数的优化和质量标准制定要以经典名方基准样品为参照。基准样品是沟通临床-企业-科研的纽带,是传承、应用和发扬传统中医药的基准。
指纹图谱是基于中药物质群整体作用的认识,借助于波谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图,是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式,具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。中药指纹图谱能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系,体现了中药成分的复杂性和相关性,与中医药的传统理论相适应,能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制,尤其适用于有效成分不完全明确或不需要完全明确的情况下,对中药材及中药产品进行质量控制。中药指纹图谱除能用于考察中药材产地、采收季节、采收部位、炮制加工、储存时间等因素,以提供依据鉴别生产前原料药材的真伪优劣,更可用于中药生产过程的质量控制:追踪制剂中某些化学成分的变化,监测原料药材与成品之间、成品的各批次间质量的一致性及稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比,指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量,在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下,可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制,是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。
目前,尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含花椒的中药组合物的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究,现有技术中,仅对该中药复方中的单一成分进行质量分析,尚无较全面、系统的质量控制方法反映本发明的中药复方及成品中主要基准样品成分的质量状况,无法对其生产过程及产品质量有效控制,不能较好地保证其临床疗效,故需采用能全面控制本发明的中药复方整体质量的指纹图谱的质控方法控制其关键质量。
发明内容
基于此,本发明提供了一种包含花椒的中药组合物的检测方法,该检测方法包括如下步骤:
取中药组合物供试品溶液和对照品溶液进行检测,其中,该中药组合物包括花椒、干姜、人参和胶饴糖,该对照品为6-姜辣素,
该检测的色谱条件为:采用填料为十八烷基键合硅胶的色谱柱,流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种,流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液,梯度洗脱程序为:0~35min,39%B;35~38min,39%B→20%B;38~40min,20%B;40~40.01min,20%B→39%B;40.01~50min,39%B,流速为0.4~1.5ml/min,柱温为20~40℃,检测波长为200~400nm,进样量为10~50μl;
根据检测结果,获得该中药组合物的成分信息,或者成分信息和含量信息。
在本发明中,流速、波长、温度、速率、时间、浓度、进样量、当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“10~50”时,所描述的范围应被解释为包括范围“10~50”、“10~45”、“10~40”、“10~35”、“10~30”、“10~25”、“10~20”、“10~15”、“15~50”、“15~45”、“15~40”、“15~35”、“15~30”、“15~25”、“15~20”、“20~50”、“20~45”、“20~40”、“20~35”、“20~30”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
进一步地,该信息为根据所记录的该中药组合物供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积,按照外标法计算该中药组合物中6-姜辣素的含量。
进一步地,该中药组合物供试品溶液的制备方法包括以下步骤:称取适量的中药组合物粉末,添加水或醇进行提取之后,放冷、定容、过滤,取续滤液,得到该中药组合物供试品溶液。
进一步地,该中药组合物粉末的制备方法包括以下步骤:称取适量的花椒、干姜和人参,得到药材饮片混合物,加水浸泡一段时间之后,第一次武火加热至沸腾之后第一次文火煎煮一段时间,过滤,量取第一滤液并加入胶饴糖,第二次武火加热至沸腾之后第二次文火煎煮一段时间,过滤,量取第二滤液使其浓缩成浸膏,干燥,研磨成粉,过筛,混匀,得到该中药组合物粉末。
进一步地,该药材饮片混合物与该水或醇的质量/体积(g/ml)之比为(0.5~10):(1~50),例如约1:约8.7。
进一步地,该加水浸泡的时间为10~60min,例如约30min。
进一步地,该第一次文火煎煮的时间为10~120min,例如约90min。
进一步地,该第一滤液与该水之间的体积比值为0.25~0.75,例如约0.5。
进一步地,该胶饴糖与该水之间的体积比值为0.1~0.4,例如约0.25。
进一步地,该第二次文火煎煮的时间为10~50min,例如约20min。
进一步地,该第二滤液与该水之间的体积比值为0.2~0.6,例如约0.375。
进一步地,该浓缩为将该第二滤液置于旋转蒸发仪中浓缩。
进一步地,该旋转蒸发仪的条件:真空度为-0.001~-0.150Mpa,例如-0.085~-0.099Mpa,转速为50~100r/min,例如约80r/min,温度为30~80℃,例如55~65℃。
进一步地,该浓缩为浓缩至在20℃下相对密度为1~1.5,例如1.17~1.24。
进一步地,该干燥为在冷冻干燥机中干燥。
进一步地,该冷冻干燥机的条件:冷阱温度不高于约-40℃,真空度不高于约100Pa。
进一步地,该干燥为干燥至水分不超过约8.0%。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约1”包括1的±5%,或从0.95到1.05;“约8.7”包括8.7的±5%,或从8.265到9.135;“约30”包括30的±5%,或从28.5到31.5;“约90”包括90的±5%,或从85.5到94.5;“约0.5”包括0.5的±5%,或从0.475到0.525;“约0.25”包括0.25的±5%,或从0.2375到0.2625;“约20”包括20的±5%,或从19到21;“约0.375”包括0.375的±5%,或从0.35625到0.39375;“约80”包括80的±5%,或从76到84;“约40”包括40的±5%,或从38到42;“约100”包括100的±5%,或从95到105;“约8”包括8的±5%,或从7.6到8.4。
进一步地,该筛为三号筛。
进一步地,该对照品溶液的制备方法包括:称取适量的6-姜辣素,添加体积百分比浓度为10%~100%的甲醇水溶液例如约50%的甲醇水溶液配制成6-姜辣素浓度为0.01~100mg/ml的该对照品溶液。
进一步地,在该对照品溶液中的6-姜辣素浓度为约0.02mg/ml。
进一步地,该高效液相检测的该流速为0.6~1.2ml/min,例如约1.0ml/min。
进一步地,该柱温为25~35℃,例如约30℃。
进一步地,该检测波长为250~320nm,例如280nm。
进一步地,该进样量为20~40μl,例如约30μl。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约0.02”包括0.02的±5%,或从0.019到0.021;“约1”包括1的±5%,或从0.95到1.05;“约30”包括30的±5%,或从28.5到31.5。
进一步地,该6-姜辣素对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。
进一步地,该6-姜辣素对应的色谱峰的分离度大于2.0。
进一步地,该色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱、SVEA-C18Gold色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、Waters Symmetry C18色谱柱、Kinetex-C18色谱柱、HALO90A AQ-C18色谱柱或Sufex-C18色谱柱。
进一步地,该色谱柱的规格:柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm。
进一步地,该检测方法进一步包括单味饮片阴性对照溶液的制备与检测:取缺少各单味饮片的中药组合物阴性粉末,以甲醇作为提取溶剂,超声处理,过滤,取续滤液进行检测。
进一步地,该单味饮片阴性对照溶液的制备方法与该中药组合物供试品溶液的制备方法相同。
进一步地,在该中药组合物供试品溶液的制备方法中,该中药组合物粉末的质量为1~10g,例如约2.5g。
进一步地,该中药组合物粉末与该水或醇的质量/体积(g/ml)之比为(0.5~10):(1~30),例如约1:约20。
进一步地,该醇为甲醇。
进一步地,该甲醇的体积浓度百分比为50%~100%,例如约50%。
进一步地,该提取为振摇提取、超声提取和/或回流提取,例如超声提取。
进一步地,该超声提取的功率为300~700W,例如约500W。
进一步地,该超声提取的频率为30~50KHz,例如约40KHz。
进一步地,该超声提取的时间为10~60min,例如约30min。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约2.5”包括2.5的±5%,或从2.375到2.625;“约1”包括1的±5%,或从0.95到1.05;“约20”包括20的±5%,或从19到21;“约50”包括50的±5%,或从47.5到52.5;“约500”包括500的±5%,或从475到525;“约40”包括40的±5%,或从38到42;“约30”包括30的±5%,或从28.5到31.5。
进一步地,该流动相A为甲醇。
进一步地,该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地,该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地,该酸水溶液为0.01%~0.2%的酸水溶液。
进一步地,该酸水溶液为0.01%~0.2%的磷酸水溶液。
进一步地,该酸水溶液为约0.05%的磷酸水溶液。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约0.05”包括0.05的±5%,或从0.0475到0.0525。
进一步地,该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地,该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
进一步地,该花椒、该干姜与该人参之间的质量之比为(0.5~2):(1~15):(0.5~9)。
进一步地,该花椒、该干姜与该人参之间的质量之比为约1:约6:约3。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约1”包括1的±5%,或从0.95到1.05;“约6”包括6的±5%,或从5.7到6.3;“约3”包括3的±5%,或从2.85到3.15。
根据本发明的另一个方面,提供了一种包含花椒的中药组合物的指纹图谱构建方法,该构建方法包括如下步骤:
中药组合物供试品溶液的制备:称取适量的中药组合物粉末,添加水或醇,经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后,放冷、补足重量、摇匀、过滤,取续滤液,得到该中药组合物供试品溶液,其中,该中药组合物包括花椒、干姜、人参和胶饴糖;
对照品溶液的制备:称取适量的6-姜辣素,添加体积百分比浓度为10%~100%的甲醇水溶液例如约50%的甲醇水溶液配制成6-姜辣素浓度为0.01~100mg/ml的该对照品溶液;
根据高效液相检测该中药组合物供试品溶液和该对照品溶液的结果,获得中药组合物指纹图谱;
该高效液相检测的色谱条件为:采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱,流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种,流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液,梯度洗脱程序为:0~35min,39%B;35~38min,39%→20%B;38~40min,20%B;40~40.01min,20%B→39%B;40.01~50min,39%B,流速为0.4~1.5ml/min,柱温为20~40℃,检测波长为200~400nm,进样量为10~50μl。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约50”包括50的±5%,或从47.5到52.5。
进一步地,该高效液相检测的该流速为0.6~1.2ml/min,例如约1.0ml/min。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约1”包括1的±5%,或从0.95到1.05。
进一步地,该柱温为25~35℃,例如约30℃。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约30”包括30的±5%,或从28.5到31.5。
进一步地,该检测波长为250~320nm,例如280nm。
进一步地,该进样量为20~40μl,例如约30μl。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约30”包括30的±5%,或从28.5到31.5。
进一步地,该6-姜辣素对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。
进一步地,该6-姜辣素对应的色谱峰的分离度大于2.0。
进一步地,在该检测波长为280nm时,该指纹图谱包括1-5号峰,其中,2号峰为6-姜辣素作为参照峰,1号峰、3号峰、4号峰和5号峰的相对保留时间分别对应为0.72~0.88、1.29~1.57、1.40~1.71和1.51~1.85。
进一步地,在该检测波长为280nm时,该指纹图谱包括1-5号峰,其中,2号峰为6-姜辣素作为参照峰,1号峰、3号峰、4号峰和5号峰的相对保留时间平均值分别对应为0.80、1.43、1.55和1.68。
进一步地,该花椒、该干姜与该人参之间的质量之比为(0.5~2):(1~15):(0.5~9)。
进一步地,该花椒、该干姜与该人参之间的质量之比为约1:约6:约3。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约1”包括1的±5%,或从0.95到1.05;“约6”包括6的±5%,或从5.7到6.3;“约3”包括3的±5%,或从2.85到3.15。
进一步地,该流动相A为甲醇。
进一步地,该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地,该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地,该酸水溶液为0.01%~0.2%的酸水溶液。
进一步地,该酸水溶液为0.01%~0.2%的磷酸水溶液。
进一步地,该酸水溶液为约0.05%的磷酸水溶液。
在本发明中,“约”是指一个特定值的±5%范围的值。例如,“约0.05”包括0.05的±5%,或从0.0475到0.525。
进一步地,该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地,该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
进一步地,该色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱、SVEA-C18Gold色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、Waters Symmetry C18色谱柱、Kinetex-C18色谱柱、HALO90A AQ-C18色谱柱或Sufex-C18色谱柱。
进一步地,该色谱柱的规格:柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm。
进一步地,在该检测波长为280nm时,1号峰为花椒药材、干姜药材的共有峰,2号峰来自干姜药材,3号峰、4号峰和5号峰来自花椒药材。
根据本发明的另一个方面,提供了一种包含花椒的中药组合物的质量控制方法,该质量控制方法包括如下步骤:
(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准指纹图谱;
(2)取中药组合物供试品溶液,根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测,得到中药组合物待测样品指纹图谱;以及
(3)将步骤(2)所得到的该中药组合物待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药组合物基准样品标准指纹图谱进行对比,符合要求的则为合格产品,不符合要求的则为不合格产品。
进一步地,该符合要求包括以下的一种或多种:
(1)该中药组合物待测样品指纹图谱中呈现出5个特征色谱峰,各特征色谱峰的保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10%之内;
(2)以6-姜辣素对照品所对应的峰为S峰,中药组合物待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10%之内;以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统,该中药组合物待测样品指纹图谱与该中药组合物基准样品标准指纹图谱经相似度计算,相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面,提供了一种上述检测方法或上述构建方法或上述质量控制方法在包含花椒的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
本发明的有益效果:
简而言之,本发明提供了一种包含大黄和附子的中药复方基准样品的指纹图谱测定和质量控制方法,该方法确认了5个共有特征峰,条件简单,分析时间短,解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题,保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性,为后续制剂的质量控制提供了重要的参考依据,确保产品的质量稳定,保障中药复方的疗效,让该中药复方更好地为人类生命健康服务。
具体而言,与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
(1)建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱,克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷,可以从整体上、宏观上控制本发明中药复方基准样品的内在质量,保证了药物的疗效,利用现代药物研究的主要手段,实现精品传承经典,使经典名方得到了更为正规的质量控制。
(2)本发明中药复方基准样品中化学成分复杂,要实现其特征峰的分离难度大,本发明在建立起指纹图谱的过程中,采用了梯度洗脱的方法,解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。
(3)本发明在建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱过程中,确认了5个共有特征峰,并对其相对保留时间和相对峰面积和相似度进行了研究,保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性,为后续真武汤复方制剂的质量控制提供重要的参考依据和质量参照。
(4)以本发明中药复方基准样品中各有效成分指纹图谱作为一个整体看待,注重各个特征峰的前后顺序和相互关系,既避免了因只测定一、二个化学成分而判定本发明中药复方基准样品整体质量的片面性,又减少了为质量达标而人为处理的可能性,为完整、准确评价本发明中药复方基准样品的质量提供了新的方法和手段。
(5)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,还可以根据这些附图获得其他的附图,而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为本发明的方法进样精密度结果示意图。
图2为本发明的方法重复性共有模式匹配图。
图3为本发明的供试品溶液色谱图。其中,2号峰为6-姜辣素。
图4为20批本发明的包含花椒的中药组合物的特征图谱共有模式匹配图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另外说明,本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料,但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物,这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质,这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”,“一种”和“所述”包括复数指示物,除非上下文另有明确规定。
在本发明中,术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例
1、仪器与试剂
仪器:高效液相色谱仪安捷伦1100色谱系统,包括G1322A型脱气机、G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1315B型DAD二极管阵列检测器、G1316A型柱温箱、ChemStation色谱工作站;Waters 2695色谱系统,包括四元梯度输液泵(Alliance 2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2996型DAD二极管阵列检测器、Empower 3色谱管理系统;电子分析天平:SHIMADZΜ(岛津)AΜW120D、Sartoriμs(赛得利斯)BSA124S;超声清洗机:KQ-500DB型昆山市超声仪器有限公司;电热套:DZTW型邦西仪器科技(上海)有限公司;超纯水机:AXLK1820-2重庆阿修罗科技发展有限公司;色谱柱:Agilent 5TC-C18(2)柱(柱长25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm)批号:563545;Agilent ZORBAX SB-C18柱(柱长25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm)批号:USCL083448;Ultimate XB C18柱(柱长25cm,内径4.6mm,粒径5μm);批号:60180600895;Symmetry C18柱(柱长25cm,内径4.6mm,粒径5μm);批号03193906513830;Supfex YS-C18柱(长25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm);批号:WX0032EL42;HALO 90A AQ-C18柱(长25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm);批号:USEQU001274。试剂:甲醇、乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。6-姜辣素(批号111833-201806,纯度99.9%,中国食品药品检定研究院)。
2、溶液的制备
2.1、对照品溶液的配制
精密称取6-姜辣素对照品10.05mg,置20ml量瓶中,加入50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得每1ml含6-姜辣素(以99.9%计)0.5mg的对照品储备液。
分别精密量取6-姜辣素对照品储备液2ml,置50ml量瓶中加50%甲醇稀释至刻度,即得每1ml含6-姜辣素(以99.9%计)0.02mg的对照品溶液。
2.2、供试品溶液的制备
包含花椒的中药组合物粉末的制备方法
【处方量】
花椒9g、干姜55.2g、人参27.6g和胶饴糖200ml
【制法】取花椒、干姜、人参三味,置2L全自动陶瓷煎药壶中,加水800ml,浸泡30分钟,加盖,武火(220V)加热至沸,文火(175V)保持微沸煎煮90min,过滤,去渣,量取400ml滤液并加入胶饴糖,武火(220V)加热至沸,文火(175V)保持微沸煎煮20min,趁热过滤,量取300ml滤液置旋转蒸发仪中浓缩,真空度:-0.085~-0.099Mpa,转速:80转/分钟,温度:55~65℃,浓缩至相对密度为1.17~1.24(20℃),约50ml。取出,浸膏置不锈钢盘中,使铺料厚度为5~15mm,在-18℃冰柜中预冻过夜,取出,置冷冻干燥机中干燥,干燥冷阱温度≤-40℃,真空度≤100Pa,冷冻干燥至水分不超过8.0%,取出,粉碎,过三号筛,混匀,即得包含花椒的中药组合物粉末(以下简称为“本品粉末”)。收得本品粉末重62.92~78.92g,收率范围:38.8%~48.7%。收得本品粉末均值±30%范围为51.74~96.10g,收率均值±30%范围为:32.0%~59.4%。
取本品粉末约2.5g,精密称定,置50ml量瓶中,加50%甲醇适量,超声处理(功率500W,频率40kHZ)30分钟,放至室温,加50%甲醇定容至刻度,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
2.3、阴性样品溶液的制备
①缺花椒的阴性样品溶液的制备:按处方称取缺花椒的其他药味,按包含花椒的中药组合物粉末的制备方法制得缺花椒的阴性样品冻干粉,按“2.2”项下制备缺花椒的阴性样品溶液。
②缺人参的阴性样品溶液的制备:按处方称取缺人参的其他药味,按包含花椒的中药组合物粉末的制备方法制得缺人参的阴性样品冻干粉,按“2.2”项下制备缺人参的阴性样品溶液。
③缺干姜的阴性样品溶液的制备:按处方称取缺干姜的其他药味,按包含花椒的中药组合物粉末的制备方法制得缺干姜的阴性样品冻干粉,按“2.2”项下制备缺干姜的阴性样品溶液。
④缺胶饴糖的阴性样品溶液的制备:按处方称取缺胶饴糖的其他药味,按包含花椒的中药组合物粉末的制备方法制得缺胶饴糖的阴性样品冻干粉,按“2.2”项下制备缺胶饴糖的阴性样品溶液。
⑤空白溶剂:50%甲醇。
2.4、单味药材对照溶液的制备
分别取花椒、人参、干姜、胶饴糖药材,按包含花椒的中药组合物粉末的制备方法制得单味药材冻干粉,按“2.2”项下制备以上各单味药材溶液。
3、色谱条件的确立
3.1、初始色谱条件
取本品粉末约2.5g,精密称定,置50ml量瓶中,加50%甲醇适量,超声处理(功率500W,频率40kHZ)30分钟,放至室温,加50%甲醇定容至刻度,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂(柱长250mm,内径为4.6mm,粒径为5μm,Agilent 5TC-C18(2));以甲醇为流动相A,以0.05%磷酸溶液为流动相B,流速为每分钟1.0ml,柱温为30℃。洗脱程序如表1所示。
表1流动相洗脱梯度1
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~35 | 62 | 38 |
35~38 | 62→80 | 38→20 |
38~40 | 80 | 20 |
40~40.01 | 80→62 | 20→38 |
40.01~50 | 62 | 38 |
3.2、测定波长的选择
将“3.1”中供试品溶液注入HPLC中,以甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B)为流动相,通过二极管阵列检测器在200~400nm的紫外区进行在线检测,在3D通道中提取210nm、260nm、280nm、300nm四个波长进行对比分析,以便了解包含花椒的中药组合物在低中高波长情况下的色谱峰分布情况。
结果表明,经过比较,包含花椒的中药组合物特征图谱的色谱峰在280nm附近均有较大吸收,HPLC图谱显示检测波长为280nm时,且整个色谱图的峰分布协调性最佳,且色谱峰性能参数最佳,故选用280nm为包含花椒的中药组合物特征图谱检测波长。
3.3、流动相磷酸比例的选择
液相检测方法的流动相中多采用酸来改善色谱峰的分离情况和对称性,不同比例酸的效果可能有很大的差别。因此,比较甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液三种不同比例磷酸流动相组成对色谱峰的影响。
结果表明,相对于甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸而言,选用甲醇-0.05%磷酸作为流动相时,各色谱峰分布更加均匀,分离效果更好,并且缓冲液的比例较低时有利于色谱柱的使用寿命,故特征图谱选择以甲醇-0.05%磷酸溶液作为后续研究用流动相。
3.4、流动相酸种类的选择
液相检测方法的流动相中多采用醋酸、磷酸、甲酸用于改善色谱峰的分离情况和对称性,因此,比较甲醇-0.05%乙酸溶液、甲醇-0.05%甲酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液三种不同流动相组成对色谱峰的影响。
结果表明,相对于甲醇-0.05%甲酸、甲醇-0.05%乙酸溶液而言,甲醇-0.05%磷酸作为流动相时,各色谱峰分布更加均匀,分离效果更好,故选择以甲醇-0.05%磷酸溶液作为后续研究用流动相。
3.5、流动相梯度的选择
采用甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B)为流动相,筛选表1至表4所示的流动相洗脱梯度。
表2流动相洗脱梯度2
表3流动相洗脱梯度3
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~35 | 63 | 37 |
35~38 | 63→80 | 37→20 |
38~40 | 80 | 20 |
40~40.01 | 80→63 | 20→37 |
40.01~50 | 63 | 37 |
表4流动相洗脱梯度4
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~35 | 61 | 39 |
35~38 | 61→80 | 39→20 |
38~40 | 80 | 20 |
40~40.01 | 80→61 | 20→39 |
40.01~50 | 61 | 39 |
结果表明,相对于其他流动相洗脱梯度而言,在流动相洗脱梯度4下,各色谱峰已完全实现基线分离,分布更加均匀,分离效果更好,特征峰性能参数最佳。故确定流动相梯度4为后续研究用流动相洗脱梯度。
4、供试品溶液制备考察
4.1、提取溶剂的选择
考察不同提取溶剂(水、50%甲醇、甲醇)对色谱峰的影响。
取本品粉末约2.5g,三份,分别精密称定,分别精密加入50ml超纯水、50%甲醇、甲醇,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,取出,放冷,分别以各自溶剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
结果表明,相比于水和甲醇,提取溶剂为50%甲醇时,峰形与性能参数更优,并且考虑到水为提取溶剂不利于供试品储存且不利于色谱柱的使用寿命,且煎液与对照品均以50%甲醇进样,故择优选择稀释溶剂为50%甲醇。
4.2、处理方式的选择
考察不同处理方式(超声处理、加热回流)对色谱峰的影响。
取本品粉末约2.5g,三份,分别精密称定,具塞锥形瓶中,精密加50%甲醇50ml,称定重量,一份超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,取出,放冷,用50%甲醇补足失重,摇匀。一份振摇30分钟,取出,放冷,用50%甲醇补足失重,摇匀。另一份加热回流30分钟,取出,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,注入液相色谱仪,测定。
结果表明,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟与加热回流30分钟供试品中拟定特征峰各峰的峰面积、分离度、峰宽、总峰面积等无显著差异,为方便操作择选择超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟。
4.3、提取时间的选择
考察不同超声时间(15分钟、30分钟、45分钟)对色谱图的影响。
取本品粉末约2.5g,三份,分别精密称定,精密加50%甲醇50ml,分别超声处理(功率500W,频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟,取出,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,注入液相色谱仪,测定。
结果表明,超声处理(功率500W,频率40kHz)15分钟,总峰面积最小;超声处理30分钟总峰面积最大,且包含花椒的中药组合物含量测定供试品处理方式选择超声30分钟。鉴于上述原因,故择优选择超声处理时间为30分钟。
4.4、取样量的选择
考察不同取样量(2g、2.5g、3g)对色谱峰的影响。
取本品粉末约2g、2.5g、3g,分别精密称定,精密加50%甲醇50ml,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,取出,放冷,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,注入液相色谱仪,测定。
结果表明,经浓度换算转化后,取样量2.5g、3g、3.5g供试品中拟定共有峰提取效率基本一致。但当取样量为2.5g时供试品中各拟定共有峰的响应值和系统适应性参数均较合适,且与煎液折算的收率最接近,故选择取样量为2.5g。
4.5、进样量的考察
分别精密吸取同一供试品溶液10μl、20μl、30μl、40μl注入液相色谱仪,测定。
结果表明,进样量为10μl~40μl经浓度换算,各峰面积及总峰面积无显著差异,故进样量在10μl~40μl均可,为保持实验连续性后续进样量仍然选用30μl。
4.6、供试品溶液制备方法的建立
综上所述,确定供试品制备方法为:取本品粉末约2.5g,精密称定,置50ml量瓶中,加50%甲醇适量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,放至室温,加50%甲醇定容至刻度,滤过,取续滤液,即得。
5、方法学验证
5.1、专属性试验
精密吸取“2、溶液的制备”项下的空白溶剂、对照品溶液、缺花椒的阴性样品溶液、缺干姜的阴性样品溶液、缺人参的阴性样品溶液、缺胶饴糖的阴性样品溶液、供试品溶液各30μl,注入液相色谱仪,按照“3”项下的色谱条件检测,记录色谱图。
结果表明,峰2(保留时间:13.306min)为6-姜辣素。峰1为花椒、干姜共有峰;峰2来自干姜药材;峰3、峰4和峰5来自花椒药材。空白溶剂无干扰。
5.2、精密度试验
5.2.1、仪器精密度
取同一对照品溶液,连续进样6次,记录色谱图,计算。
结果表明:对照品溶液色谱峰的相对保留时间与相对峰面积RSD%均小于2%,符合相关规定,仪器精密度良好。
5.2.2、进样精密度
取同一供试品溶液,连续进样6次,记录色谱图,计算。
如图1所示,结果表明:5个共有峰的相对保留时间均符合规定。相对峰面积RSD%均小于2%。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理,以包含花椒的中药组合物粉末对照特征图谱为参照谱,经Mark峰匹配相似度均在0.90以上。综合判断,该方法的进样精密度好,符合特征图谱的要求。
5.2.3、方法重复性试验
取同一批供试品,按“2.2、供试品溶液的制备”的方法制备6份供试品,注入液相色谱仪,计算。
如图2所示,结果表明:5个共有峰的相对保留时间均符合规定。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理,以包含花椒的中药组合物粉末对照特征图谱为参照谱,经Mark峰匹配相似度均在0.90以上。综合判断,该方法的重复性好,符合特征图谱的要求。
5.2.4、中间精密度(不同仪器)
取同一供试品溶液,分别在Agilent高效液相色谱仪和Waters高效液相色谱仪上进行试验,记录色谱图,计算。
结果表明:5个共有峰的相对保留时间均符合规定。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理,以包含花椒的中药组合物粉末对照特征图谱为参照谱,经Mark峰匹配相似度均在0.90以上。综合判断,方法的中间精密度(不同品牌液相色谱仪)好,符合特征图谱的要求。
5.2.5、中间精密度(不同实验人员)
取同一份供试品,由甲、乙、丙三位不同实验人员每人依法制备供试品溶液两份,注入同一液相色谱仪,记录色谱图,计算。
结果表明:5个共有峰的相对保留时间均符合规定。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理,以包含花椒的中药组合物粉末对照特征图谱为参照谱,经Mark峰匹配相似度均在0.90以上。综合判断,该方法的中间精密度(不同实验人员)好,符合特征图谱的要求。
综上所述,该方法精密度良好。
5.3、耐用性
5.3.1、稳定性试验
取同一供试品液分别于配制后0、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96小时,测定,记录色谱图,计算。
结果表明:5个共有峰的相对保留时间均符合规定。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理,以包含花椒的中药组合物对应实物(冻干粉)对照特征图谱为参照谱,经Mark峰匹配相似度均在0.90以上。说明供试品溶液在96小时内稳定,满足检测需要。
5.3.2、不同品牌色谱柱的考察
取同一供试品溶液,分别以不同色谱柱(Agilent 5TC-C18(2)柱长25cm,内径4.6mm,粒径5μm;SVEA-C18 Gold柱长25cm,内径4.6mm,粒径5μm;Agilent ZORBAX SB-C18柱长25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm;Waters Symmetry C18柱长25cm,内径4.6mm,粒径5μm;Kinetex-C18柱长25cm,内径4.6mm,粒径5μm;HALO 90AAQ-C18柱长25cm,内径为4.6mm,粒径为5μm进行试验,记录色谱图,计算。
结果表明:5个共有峰的相对保留时间均符合规定。且所选用的色谱柱中各峰的分离度、峰宽等参数均符合相关要求。
综上所述,包含花椒的中药组合物特征图谱色谱柱耐用性良好。
6、色谱条件的确定
照高效液相色谱法(《中国药典》中国药典2015年版四部通则0512)测定。
本发明建立了包含花椒的中药组合物粉末特征图谱测定方法,以6-姜辣素为指标成分及5个共有峰为评判指标,对包含花椒的中药组合物粉末特征图谱的色谱条件和系统适应性进行验证,并且对样品的前处理方法进行考察,确定供试品制备方法,通过对该测定方法进行方法学考察,建立包含花椒的中药组合物粉末特征图谱的方法,并测定20批包含花椒的中药组合物粉末特征图谱,结果表明该方法简单易操作,具有分离效果好、精密度、重复性好等优点,因此可用于包含花椒的中药组合物物质基准对应实物特征图谱的测定。
色谱条件与系统适应性试验:以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂(柱长25cm,内径4.6mm,粒径5μm,Agilent 5TC-C18(2));以甲醇为流动相A,以0.05%磷酸溶液为流动相B,按表4中的规定进行梯度洗脱;流速每分钟为1.0ml;柱温为30℃;检测波长280nm。理论板数按6-姜辣素峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备:取6-姜辣素对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成每1ml含6-姜辣素20μg的参照物溶液,即得。
供试品溶液制备:取本品粉末约2.5g,精密称定,置50ml量瓶中,加50%甲醇适量,超声处理(功率500W,频率40kHZ)30分钟,取出,放冷,并用50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法:分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各30μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
如图3所示的供试品特征图谱中,应分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰,与6-姜辣素参照物相应的峰为S峰,计算特征峰1~5的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%以内,规定值为:0.80(峰1)、1.00(峰2)、1.43(峰3)、1.55(峰4)、1.68(峰5)。供试品溶液的系统适用性如表5所示。
通过20批供试品特征图谱的检测结果进行分析,采用药典委员会编制的特征图谱相似度评价软件“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版,生成对照特征图谱;通过对共有峰的识别和指认,得到包含花椒的中药组合物粉末HPLC特征图谱共有色谱峰5个,其中2号峰保留时间与6-姜辣素参照物峰的保留时间相同。1号峰为花椒、干姜共有峰;2号峰来自干姜药材;3、4、5号峰来自花椒药材。空白溶剂无干扰。以6-姜辣素参照物峰对应的峰为S峰,按中药色谱特征图谱相似度评价系统,供试品特征图谱与包含花椒的中药组合物粉末对照特征图谱经相似度计算特征图谱相似度均大于0.90,其相对保留时间应在规定值的±10%以内,如图4和表6所示。
结合包含花椒的中药组合物粉末特征图谱方法学验证结果及20批包含花椒的中药组合物粉末的共有峰情况,规定供试品色谱中应呈现5个共峰,其中2号峰保留时间与6-姜辣素参照物峰的保留时间相同。与6-姜辣素参照物峰相应的峰为S峰。通过20批包含花椒的中药组合物粉末计算各共有峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间在平均值的±10%范围内。
表5供试品溶液的系统适用性
表6 20批本发明的包含花椒的中药组合物特征图谱相似度
以上对本发明实施例进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时,本领域技术人员依据本发明的思想,基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处,都属于本发明保护的范围。综上所述,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (57)
1.一种包含花椒的中药组合物的指纹图谱构建方法,其特征在于,所述构建方法包括如下步骤:
中药组合物供试品溶液的制备:称取适量的中药组合物粉末,添加甲醇水溶液,经过振摇提取、超声提取和/或回流提取之后,放冷、补足重量、摇匀、过滤,取续滤液,得到所述中药组合物供试品溶液,其中,所述中药组合物由花椒、干姜、人参和胶饴糖组成;
对照品溶液的制备:称取适量的6-姜辣素,添加体积百分比浓度为10%~100%的甲醇水溶液配制成6-姜辣素浓度为0.01~100mg/ml的所述对照品溶液;
根据高效液相检测所述中药组合物供试品溶液和所述对照品溶液的结果,获得中药组合物指纹图谱;
所述高效液相检测的色谱条件为:采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱,流动相A为甲醇,流动相B为0.05%磷酸溶液,梯度洗脱程序为:0~35min,39%B;35~38min,39%→20%B;38~40min,20%B;40~40.01min,20%B→39%B;40.01~50min,39%B,流速为0.4~1.5ml/min,柱温为20~40℃,检测波长为280nm,进样量为10~50μl。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述对照品溶液的制备中,所述甲醇水溶液的体积百分比浓度为47.5%~52.5%。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述中药组合物粉末的制备方法包括以下步骤:称取适量的花椒、干姜和人参,得到药材饮片混合物,加水浸泡一段时间之后,第一次武火加热至沸腾之后第一次文火煎煮一段时间,过滤,量取第一滤液并加入胶饴糖,第二次武火加热至沸腾之后第二次文火煎煮一段时间,过滤,量取第二滤液使其浓缩成浸膏,干燥,研磨成粉,过筛,混匀,得到所述中药组合物粉末。
4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述药材饮片混合物与所述水或醇的质量/体积(g/ml)之比为(0.5~10):(1~50)。
5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述药材饮片混合物与所述水或醇的质量/体积(g/ml)之比为(0.95~1.05):(8.265~9.135)。
6.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述加水浸泡的时间为10~60min。
7.根据权利要求6所述的构建方法,其特征在于,所述加水浸泡的时间为28.5~31.5min。
8.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述第一次文火煎煮的时间为10~120min。
9.根据权利要求8所述的构建方法,其特征在于,所述第一次文火煎煮的时间为85.5~94.5min。
10.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述第一滤液与所述水之间的体积比值为0.25~0.75。
11.根据权利要求10所述的构建方法,其特征在于,所述第一滤液与所述水之间的体积比值为0.475~0.525。
12.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述胶饴糖与所述水之间的体积比值为0.1~0.4。
13.根据权利要求12所述的构建方法,其特征在于,所述胶饴糖与所述水之间的体积比值为0.2375~0.2625。
14.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述第二次文火煎煮的时间为10~50min。
15.根据权利要求14所述的构建方法,其特征在于,所述第二次文火煎煮的时间为19~21min。
16.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述第二滤液与所述水之间的体积比值为0.2~0.6。
17.根据权利要求16所述的构建方法,其特征在于,所述第二滤液与所述水之间的体积比值为0.35625~0.39375。
18.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述浓缩为将所述第二滤液置于旋转蒸发仪中浓缩。
19.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述旋转蒸发仪的条件:真空度为-0.001~-0.150Mpa,转速为50~100r/min,温度为30~80℃。
20.根据权利要求19所述的构建方法,其特征在于,所述旋转蒸发仪的条件:真空度为-0.085~-0.099Mpa,转速为76~84r/min,温度为55~65℃。
21.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述浓缩为浓缩至在20℃下相对密度为1~1.5。
22.根据权利要求21所述的构建方法,其特征在于,所述浓缩为浓缩至在20℃下相对密度为1.17~1.24。
23.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述干燥为在冷冻干燥机中干燥。
24.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述冷冻干燥机的条件:冷阱温度不高于-42℃~-38℃,真空度不高于95~105Pa。
25.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述干燥为干燥至水分不超过7.6%~8.4%。
26.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述筛为三号筛。
27.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述对照品溶液中的6-姜辣素浓度为0.019~0.021mg/ml。
28.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备方法中,所述中药组合物粉末的质量为1~10g。
29.根据权利要求28所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述中药组合物粉末的质量为2.375~2.625g。
30.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述中药组合物粉末与所述甲醇水溶液的质量/体积(g/ml)之比为(0.5~10):(1~30)。
31.根据权利要求30所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述中药组合物粉末与所述甲醇水溶液的质量/体积(g/ml)之比为(0.95~1.05):(19~21)。
32.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述甲醇的体积浓度百分比为50%~100%。
33.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述甲醇的体积浓度百分比为47.5%~52.5%。
34.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述超声提取的功率为300~700W。
35.根据权利要求34所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述超声提取的功率为475~525W。
36.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述超声提取的频率为30~50KHz。
37.根据权利要求36所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述超声提取的频率为38~42KHz。
38.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述超声提取的时间为10~60min。
39.根据权利要求38所述的构建方法,其特征在于,在所述中药组合物供试品溶液的制备中,所述超声提取的时间为28.5~31.5min。
40.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述高效液相检测的所述流速为0.6~1.2ml/min。
41.根据权利要求40所述的构建方法,其特征在于,所述高效液相检测的所述流速为0.95~1.05ml/min。
42.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述柱温为25~35℃。
43.根据权利要求42所述的构建方法,其特征在于,所述柱温为28.5℃~31.5℃。
44.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述进样量为20~40μl。
45.根据权利要求44所述的构建方法,其特征在于,所述进样量为28.5~31.5μl。
46.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述6-姜辣素对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。
47.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述6-姜辣素对应的色谱峰的分离度大于2.0。
48.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述检测波长为280nm时,所述指纹图谱包括1-5号峰,其中,2号峰为6-姜辣素作为参照峰,1号峰、3号峰、4号峰和5号峰的相对保留时间分别对应为0.72~0.88、1.29~1.57、1.40~1.71和1.51~1.85。
49.根据权利要求48所述的构建方法,其特征在于,在所述检测波长为280nm时,所述指纹图谱包括1-5号峰,其中,2号峰为6-姜辣素作为参照峰,1号峰、3号峰、4号峰和5号峰的相对保留时间平均值分别对应为0.80、1.43、1.55和1.68。
50.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述花椒、所述干姜与所述人参之间的质量之比为(0.5~2):(1~15):(0.5~9)。
51.根据权利要求50所述的构建方法,其特征在于,所述花椒、所述干姜与所述人参之间的质量之比为(0.95~1.05):(5.7~6.3):(2.85~3.15)。
52.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱、SVEA-C18 Gold色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、Waters Symmetry C18色谱柱、Kinetex-C18色谱柱、HALO 90AAQ-C18色谱柱或Sufex-C18色谱柱。
53.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述色谱柱的规格:柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm。
54.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述检测波长为280nm时,1号峰为花椒药材、干姜药材的共有峰,2号峰来自干姜药材,3号峰、4号峰和5号峰来自花椒药材。
55.一种包含花椒的中药组合物的质量控制方法,其特征在于,所述质量控制方法包括如下步骤:
(1)根据权利要求1至54中任一项所述的指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准指纹图谱;
(2)取中药组合物供试品溶液,根据权利要求1至54中任一项所述的指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测,得到中药组合物待测样品指纹图谱;以及
(3)将步骤(2)所得到的所述中药组合物待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的所述中药组合物基准样品标准指纹图谱进行对比,符合要求的则为合格产品,不符合要求的则为不合格产品。
56.根据权利要求55所述的质量控制方法,其特征在于,所述符合要求包括以下的一种或多种:
(1)所述中药组合物待测样品指纹图谱中呈现出5个特征色谱峰,各特征色谱峰的保留时间在所述中药组合物基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10%之内;
(2)以6-姜辣素对照品所对应的峰为S峰,中药组合物待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在所述中药组合物基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10%之内;以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统,所述中药组合物待测样品指纹图谱与所述中药组合物基准样品标准指纹图谱经相似度计算,相似度不得低于0.90。
57.根据权利要求1至54中任一项所述的构建方法或根据权利要求55或56所述的质量控制方法在包含花椒的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
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